Artigo de método

Organóides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas

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DOI:

10.3791/59682

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28 de junho de 2019

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1Laboratory of Tumor Immunology, Translational Research Center in Onco-Hematology, Department of Internal Medicine Specialties, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, University Medical Center, University of Geneva, 3Laboratory of Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Geneva University Hospitals, 4Tissue Engineering Laboratory, Hepia/HES-SO, University of Applied Sciences Western Switzerland, 5Laboratory of Experimental cell therapy, Department of Diagnostics, Geneva University Hospitals

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo introduz e descreve protocolos para derivar dois organóides neurais humanos específicos como um modelo relevante e exato para estudar 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro dos organóides neural humanos exclusivamente nos seres humanos e 2) neurônio dopaminérgicos diferenciação, gerando um organoide tridimensional.

Resumo

A falta de modelos neurais in vitro relevantes é um importante obstáculo ao progresso médico para as neuropatologias. O estabelecimento de modelos celulares relevantes é crucial para melhor compreender os mecanismos patológicos dessas doenças e identificar novos alvos e estratégias terapêuticas. Para ser pertinente, um modelo in vitro deve reproduzir as características patológicas de uma doença humana. Entretanto, no contexto da doença neurodegenerativas, um modelo in vitro relevante deve fornecer a recolocação da pilha neural como uma oportunidade terapêutica valiosa.

Tal modelo permitiria não somente a seleção de moléculas terapêuticas mas igualmente pode ser usado para aperfeiçoar a diferenciação neural do protocolo [por exemplo, no contexto da transplantação na doença de Parkinson (paládio)]. Este estudo descreve dois protocolos in vitro de 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro de um organóides neural humano (no) e de 2) diferenciação dopaminérgicos (da) do neurônio que gera um organoid tridimensional (3D). Para tanto, estabeleceu-se um protocolo bem padronizado que permite a produção de neuroesferas calibradas por tamanho derivadas da diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESC). O primeiro modelo pode ser usado para revelar os eventos moleculars e celulares que ocorrem durante no desenvolvimento do glioblastoma dentro do organoid neural, quando o organoid DA DA representar não somente uma fonte apropriada de neurônios DA DA para a terapia da pilha na doença de Parkinson mas igualmente pode ser usado para testes de drogas.

Introdução

A Organização Mundial da saúde (OMS) classifica os astrocitomas como grau baixo (grau I a II) ou alto grau (grau III e IV). Glioblastoma multiforme (GBM) é um astrocitoma grau IV, o mais letal dos tumores cerebrais primários, que é resistente a todas as formas atuais de tratamentos1. Apesar da terapia do padrão--cuidado que inclui a neurocirurgia, a quimioterapia, e a radioterapia, GBM permanece fatal e a taxa de sobrevivência total de 15 meses não mudou dramàtica sobre os 15 anos passados2. Para fazer progressos significativos na compreensão da patogênese da GBM, o uso de modelos relevantes é fundamental. Até o momento, o estudo da GBM baseou-se em linhagens celulares, fatias organootípicas de roedores e xenotransplante de células derivadas de pacientes em camundongos ou camundongos transgênicos desenvolvendo tumores espontâneos3,4. Embora esses modelos tenham sido úteis para estudar a metástase cerebral e a agressividade tumoral, eles são restritos por diferenças entre as espécies, e as conclusões resultantes podem ser traduzidas incorretamente para os tecidos humanos. Além disso, os modelos existentes com células humanas também são limitados pela ausência de interações tecido/tumor do hospedeiro3,4. Os modelos experimentais são críticos para a tradução da ciência básica para alvos terapêuticos. Portanto, descrever um protocolo para produzir organóides neurais humanos in vitro cocultivados com células iniciadores de GBM (GICs) pode fornecer um sistema relevante que imita características morfológicas e funcionais do desenvolvimento da GBM. Este sistema reproduz algumas características in vivo de desenvolvimentosgbm como migração difusa de células invasoras e áreas de necrose, e destaca a expressão gênica relevante para a biologia tumoral. Como revelado anteriormente, alguns microRNAs críticos são induzidos durante o desenvolvimento do GIC dentro do tecido nervoso 3D5,6.

O PD é uma desordem neurodegenerativas principal e associado com a degeneração de subtipos neuronal múltiplos7. Mesmo que um início progressivo dos sintomas (por exemplo, bradicinesia, tremor assimétrico do descanso, rigidez e instabilidade da postura) caracterize a doença, sua etiologia exata não é estabelecida claramente. Na verdade, muitos estudos têm destacado evidências de que os principais fatores de risco podem resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais. Os sintomas de parkinsonianos estão associados à degeneração bilateral dos neurônios dopaminérgicos na substancia nigra (SN), levando ao desaparecimento de axônios dopaminérgicos (da) projetando-se para o estriado8,9. Portanto, a redução dos níveis de dopamina estriatal está correlacionada com a progressão da disfunção motora em pacientes com DP. Os neurônios dopaminérgicos contêm Tirosina Hidroxilase (TH), uma enzima chave na síntese de neurotransmissores catecolaminérgicos que converte o aminoácido L-tirosina para L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA, um precursor de dopamina) para dopamina10. A perda adiantada da atividade do TH seguiu por um declínio na expressão da proteína do TH é uma indicação do paládio.

Este estudo descreve dois protocolos usando organoids neurais humanos, com um orientado especificamente para um midbrain-como o phenotype enriquecido com as pilhas do TH-positive.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de Genebra.

1. manutenção e cultura de células-tronco embrionárias humanas não diferenciadas (hESCs)

  1. Realize manutenção e expansão de hSECs em condições livres de alimentador por pré-revestimento de pratos com uma matriz extracelular específica.
    1. Descongelar 300 μL de matriz extracelular a 4 ° c (concentração típica de faixa 18-22 mg/mL, manter no gelo) e misturar suavemente com 15 mL de meio DMEM frio para evitar a geladura prematura da matriz extracelular. Adicione 7,5 ml do Matric extracelular a ambos os frascos T150.
    2. Incubar os pratos revestidos com matriz extracelular a 37 ° c durante pelo menos 1 h (máximo durante a noite).
    3. Remova o meio e as sementes de hESCs a uma densidade de 6,5 x 104 Cell/cm2.
  2. Manter H1 (linha celular hESC) em meio hESC e 1% de penicilina/estreptomicina.
  3. Passar as células com procedimento enzimático: Adicionar 7,5 mL de solução enzimática a um balão de T75 cm2 durante um período de 1-2 min a 37 ° c. Uma vez que as células estão completamente desanexadas, adicione 7,5 mL de DMEM-F12, em seguida, centrifugar por 5 min a 300 x g. Para permitir uma melhor sobrevida, re-placas de células na densidade desejada para os pratos de matriz extracelular-revestido, no mesmo meio contendo Rho-associado proteína quinase (ROCK) inibidor (10 μM) para 24 h.

2. organóides neurais derivados de hESC para estudos de GBM

  1. 24 h antes de iniciar a cultura 3D, substitua o meio hESC por um meio livre de soro suplementado com 10 μM de inibidor de rocha (ambos os componentes são necessários para apoiar a sobrevivência celular e formação de neurofera espontânea durante a fase de agregação em um micropoço da placa). As células devem estar em 60% de confluência. No dia seguinte (dia 0), separe as colônias de hESC como células únicas: Retire o meio, depois enxague com PBS sem CA2 +/mg2 +, acrescente 5 ml de solução de dissolução enzimática e incubar a 37 ° c por 1-2 min.
  2. Colete as células em meio livre de soro com 10 μM de inibidor de rocha e Centrifugue as células em 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e conte as células em 10 ml de meio livre de soro suplementado com 10 μm de inibidor de rocha.
  3. Em paralelo, enxague a placa de micropoços com 2 mL de meio livre de soro por poço e centrifugue a placa em 1200 x g por 5 min para remover todas as bolhas, o que pode prevenir a formação da neurofera.
  4. Prepare 28,2 x 106 de células em 12,5 ml de meio livre de soro suplementado com 10 μm de inibidor de rocha. Dispensar 1000 células/micropoços. Centrifugue as pilhas em 300 x g por 5 minutos e coloc a placa na incubadora em 37 ° c durante a noite (máximo 36 h). Por exemplo: para obter 30 organóides neurais humanos, use um balão de T150 a 70%-80% da confluência (cerca de 30 milhões células).
  5. No dia seguinte (dia 1), recolher as esferas (com um P1000) e colocá-los em uma placa de 6 poços. Em cada poço, adicionar 2 mL de meio B27 e DMEM-F12 GlutaMAX e Neurobasal médio (Mix em 1:1), suplementado com 1% B27 suplementos e 1% não essenciais aminoácidos (NEAA). Para promover a indução neural rápida, complemente o meio com o coquetel de inibição Dual-SMAD, composto de 10 μM de inibidor TGFβ/activin/nodal e inibidor da proteína morfogênica óssea de 0,5 μM (BMP). A partir deste passo em frente, as esferas são cultivadas em rotação (60 RPM, agitador orbital). A rotação é fundamental para evitar que as esferas grudem juntas ou na chapa.
  6. Mude o meio cada 2-3 dias: dobre a placa e deixe as esferas cair para baixo por 5 minutos, remova a metade do meio (2 mL), e adicione 2 mL do meio B27 fresco suplementado com os fatores de crescimento e os nervos inibidores. Não Centrifugue as esferas.
  7. Realize a indução neural de acordo com o seguinte curso do tempo:
    1. A partir de dias 1-4, a cultura das esferas em B27 médio suplementado com Dual-SMAD. O coquetel de inibição Dual-SMAD (10 μM de inibidor TGFβ/activin/nodal e inibidor de 0,5 μM BMP) promove a indução neural.
    2. A partir dos dias 4-11, promover a proliferação de rosetas neurais derivadas de hESC (nas esferas), adicionando 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF) e 10 ng/mL fator de fibroblastos básicos (bFGF) para o meio B27 suplementado com duplo-SMAD cocktail.
      Nota: no dia 11, a maioria das células deve ser positiva para Nestin.
    3. A partir dos dias 11-13, a cultura das esferas em meio B27 suplementado com 0,5 μM de inibidor BMP.
    4. A partir dos dias 13-21, a cultura das esferas em meio B27 suplementado com 10 ng/mL glial derivado fator neurotrófico (GDNF), 10 ng/mL cérebro derivado fator neurotrófico (BDNF) e 1 μM de γ-secretase inibidor. GDNF e BDNF promovem a diferenciação neuronal e glial. O inibidor da γ-secretase permite maior maturação neural.
    5. No dia 21, placa as esferas (aproximadamente 1.000 esferas) em uma membrana hidrofílico do politetrafluoretileno (PTFE) (diâmetro de 6 milímetros, 0,4 μm) depositada em uma inserção da placa da cultura projetada para a placa de 6 poços. Pare qualquer rotação desta etapa. A presença de rosettes, observada com um microscópio do brilhante-campo, indica o início da diferenciação neural. Os rosetas neural podem ser observados 2-3 dias após esferas do chapeamento na membrana de PTFE.
    6. Adicione 1 mL de meio B27 suplementado com fatores de crescimento e inibidores (como seguido) a cada poço embaixo da pastilha de membrana, a cada 2-3 dias (geralmente na segunda-feira, quarta e sexta-feira), para uma seguinte 3 semanas de diferenciação.
    7. A partir dos dias 21-25, cultivar organóides neurais humanos no mesmo meio de maturação neural (cf. Step 2.7.4).
    8. A partir dos dias 25-28, apenas complementam o meio B27 com 1 μM de inibidor de γ-secretase.
    9. Dos dias 28-39, pare de adicionar o inibidor de γ-secretase e continue a cultura organoid neural humana no meio B27 somente.
      Observação: após 3 semanas, os organóides neurais estão prontos para uso para implantação de GIC. Ao longo da maturação neural, observou-se diminuição do marcador neural imaturo Nestin e aumento dos marcadores neurais maduros β3-tubulin e GFAP.

3. isolamento e cultivo de glioblastoma-células iniciantes (GICs)

  1. Isole GICs fragmentando uma biópsia humana do GBM da classe elevada. Transfira o pedaço de tumor em uma taça contendo 0,25% de tripsina em 0,1 mM de EDTA (4:1) e mexa lentamente a 37 ° c por 30-60 min (dependendo do tamanho do tumor).
  2. Placa as células dissociadas em 75 cm2 frascos de cultura de tecidos revestidos a 2500-5000 células por cm2 em meio GIC: DMEM/F-12 médio (1:1) contendo 1% N2, 1% B27 e 1% G5 suplementos (para favorecer a sobrevivência do GIC), suplementados com bFGF e EGF (ambos em 10 ng/ml, para promover a stemness) e 1% de penicilina/estreptomicina.
  3. Uma vez que o GIC está bem estabelecido e crescendo, remova os suplementos de N2 e G5 do meio de GIC.
  4. Um dia antes de adicionar as células para o organóide, dissociar os GICs e contá-los.
  5. Enxague a placa de micropoços com 2 mL de meio GIC e centrifugue a placa na velocidade máxima para remover as bolhas (1000 x g). Coloque as GICs em 1.000 células para obter um gliomasphere por micropoços. Incubar durante a noite a 37 ° c (Figura 1C). Esta etapa é fundamental e permite que as GICs bem calibradas (um exemplo de GICs necrótico e de tamanho grande seja mostrada na Figura 2a,C).
  6. Para iniciar a invasão de GBM, adicione um gliomasphere em cima do tecido neural com uma ponta de Pipet grande furo (Figura 1F). Coloc com cuidado a placa de 6 poços para trás na incubadora.

4. organóides dopaminérgicos derivados de hESC para estudos de PD

  1. Dia 0: amplificar os hESCs na cultura 2D até 60% de confluência (dia 0), em seguida, substitua os meios de células-tronco usados para manter as características de pluripotência de hESCs com um meio livre de soro. Inicie a indução neural completando o meio de cultura com inibidor de 0,5 μM BMP e 10 μM TGFβ/activin/inibidor nodal (duplo-SMAD inibição cocktail), em seguida, adicione 10 μM de inibidor de rocha para 24 h para aumentar a taxa de sobrevivência das células durante a passagem.
  2. Dia 1: Prepare a placa de micropoços com 2,5 mL por poço de meio livre de soro suplementado com inibidor de 0,5 μM BMP, 10 μM de inibidor de TGFβ/activin/nodal e inibidor de rocha de 10 μM. Para especificar células para o padrão ventral do tubo neural, adicione 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL fator de crescimento de fibroblastos 8 (FGF8), e 2 μM de agonista suavizada. Centrifugue a placa (somente com meio e sem pilhas) em 1200 x g por 5 minutos para remover as bolhas de ar dos micropoços.
    1. Após 1 dia de indução neural em 2D, retire o meio e lave rapidamente com PBS sem CA2 +/MgCl2 +. Dissociar as colônias em suspensão de células simples adicionando 7,5 mL de solução enzimática recombinante em um balão de T75 cm2 . Incubar por 2 min a 37 ° c, em seguida, complete com 7,5 mL de DMEM-F12.
    2. Colete a suspensão celular e centrifugue a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e conte as células no mesmo meio usado para preparar a placa de micropoços.
    3. Ajuste o volume médio para obter uma suspensão celular que permita formar neuroesferas contendo 1000 células por micropoços (por exemplo, a placa de micropoços usada aqui contém 4.700 micropoços por poço). Assim, prepare 4,7 milhões células em 2,5 mL de meio e adicioná-lo ao anterior 2,5 mL de meio já colocado na placa.
    4. A fim de distribuir corretamente as células em cada micropoço, agitar suavemente a placa, e centrifugar a placa de micropoços 300 x g por 5 min. Incubar a placa em 37 ° c para 24 h para gerar esferas.
  3. Dia 2: lave suavemente os micropoços com o meio e colete, em seguida, transfira as esferas na placa de seis poços tratada com tecido. Substitua o meio pelo meio Neurobasal suplementado com 1% B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina. Além disso, adicione fatores de regionalização SHH, FGF8, agonista suavizada e moléculas pequenas de inibição de SMAD dupla.
    1. Coloque as esferas em rotação a 37 ° c (60 RPM, agitador orbital) e mude meio-meio recém-suplementado a cada 2-3 dias.
  4. Dia 3: para melhorar a indução neural e converter para progenitores neurais com uma identidade do midbrain, suplementam o meio com o inibidor de 3 μM GSK-3β, que ativa o caminho de WNT/β-catenin. Manter o inibidor GSK-3β no meio até o dia 13. Dividido em duas novas placas de 6 poços tratadas com tecido para reduzir a densidade da esfera por poço e evitar a agregação da esfera.
    Nota: no dia 8, a maioria das células deve ser positiva para Nestin.
  5. Dia 8: iniciar a maturação neural: substitua os fatores de regionalização SHH, FGF8, agonista suavizada e coquetel de inibição Dual-SMAD com campo de dibutyryl de 0,5 mM (para favorecer a maturação), inibidor de 20 nM de histona deacetilase (para saída do ciclo celular), 1 μM γ-secretase inibidores e fatores de crescimento, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL fator de crescimento transformador β3 (TGFβ3), e 5 ng/mL FGF20 (ambos favorecem a sobrevivência do progenitor). Mude o meio a cada 2-3 dias.
  6. Dia 21: gerar o organóide neural: semente em torno de 100 neuroesferas condições de interface ar-líquido na membrana de PTFE (6 mm de diâmetro). Transfira a membrana para um inserto de placa de cultura (0,4 mm) e adicione 1,2 mL de meio de maturação neural usado para diferenciação da neurofera como descrito anteriormente.
    1. Pare qualquer rotação desta etapa. Altere o meio a cada 2-3 dias até que o ponto de tempo de diferenciação exigido seja atingido.
      Nota: em relação à maturação neural, observou-se diminuição do marcador neural imaturo Nestin e aumento dos marcadores neurais maduros β3-tubulin e GFAP. As altas expressões TH e NURR1 foram observadas (Figura 3C) e confirmam a maturidade organoide neural11.

5. quantificação da expressão gênica de TH e Nurr1 para validação da diferenciação dopaminérgica

  1. Extração do RNA: no dia indicado da diferenciação, os neurospheres de lyse 40 com 350 μL do amortecedor de RLT (fornecido no jogo da extração do RNA) suplementados com 3,5 μL do 2-mercaptoethanol. Extraia o RNA das neuroesferas lisadas usando um kit de extração de RNA seguindo as instruções do fabricante.
  2. Quantificar as concentrações totais de RNA.
  3. Realize a transcrição reversa de 300 ng da extração total do RNA usando o jogo reverso da transcrição para a reacção em cadeia quantitativa do polymerase do tempo real (qPCR) e siga as instruções do fabricante.
  4. Execute a análise de qPCR em sistemas de deteção do PCR do tempo real, baseados na deteção assimétrica da tintura do cianina. Normalizar os dados com os genes de limpeza: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e fator de alongamento 1-alfa (EF1). As sequências de primers estão descritas na tabela 1.

6. detecção de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

  1. Use cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com detecção eletroquímica para detectar a presença de dopamina. A dopamina foi extraída por organóides neurais lisando em 100 mL de ácido perclórico de 0,1 N (HClO4) por 15 min a 4 ° c com um vortexing vigoroso a cada 5 min. Após a centrifugação, colete e armazene o sobrenadante a-20 ° c para dosagem de dopamina.
  2. Use uma coluna C-18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) para separar os analitos por HPLC de fase invertida no modo Isocrático a uma vazão de 1 mL/minuto. A detecção de dopamina deve ser realizada usando um detector coulométrico com o conjunto de células condicionantes em um potencial de + 200 mV.

7. gravação de dados brutos com plataforma de matriz de microelectode (MEA)

  1. Use um microscópio de dissecção para transferir neuroesferas para o centro de um dispositivo MEA poroso.
  2. Use um amplificador e sistema de aquisição de dados para gravações eletrofisiológicas. Meça a relação sinal-ruído (SNR) como o desvio padrão da tensão durante uma gravação de 5 minutos, usando o sinal como a tensão Peak-to-Peak média dos picos gravados nos mesmos períodos de 5 minutos.

Resultados

As etapas críticas deste protocolo devem ser bem identificadas e tratadas corretamente. Portanto, um diagrama de condições de cultura indicando o lapso de tempo para cada etapa, bem como os compostos utilizados para o protocolo de diferenciação, são ilustrados na Figura 1a e na Figura 3a para os organóides neurais no mais GBM e da da, respectivamente. A Figura 1b, C, D, e, F ilustra as células, esferas e no e mostram a morfologia típica para cada etapa. A Figura 1G, H, I ilustra a imunofluorescência que mancha com alguns marcadores neural.

figure-results-1
Figura 1 : Organoide neural humano (no) protocolo de diferenciação. (A) protocolo padronizado para a geração de no derivado de células-tronco embrionárias humanas (hESC). (B) os hESCs são mantidos na matriz extracelular em meio hESC. (C) placas de micropoços foram utilizadas para gerar neuroesferas calibradas. Em 2 semanas, as neuroesferas foram chapeadas na pastilha contendo uma membrana de PTFE (barra de escala = 50 μm). (D) visão MACROSCÓPICA do não na pastilha em um poço de uma placa de 6 poços. Durante os primeiros dias, foram observadas rosetas (seta preta) (E). (F) visão macroscópica de uma esfera não mais GIC no topo. (G-I) Análise da imunofluorescência da esfera do NO mais GIC (EGFR-positivo; barra da escala = 50 μm) (G) e não sozinho, que mostrou a reactividade imune para o marcador neuronal βiii-tubulin e ligeiramente positivo para o Nestin; Entretanto, o sinapsina 1 mostrou um sinal fraco (H, I) (barras da escala = 100 μm e 50 μm, respectivamente). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

figure-results-2
Figura 2 : Ilustração de esferas Necrotic e imaturo no. As neuroesferas (a) e no (B) podem sofrer necrose quando são muito numerosas no poço ou oversized (C) (barra de escala = 10 μm). (D) um GIC infectado com um repórter de tomate ajuda a rastrear a invasão de células tumorais em não, barra de escala, 10 μm. exemplo de não imaturo com tubos neurais (e) e sem tubos neurais (F) (barra de escala = 50 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3 : Protocolo padronizado para geração de organoide neural da e análise eletrofisiológica e morfológica. (A) protocolo padronizado para a geração de organóides neurais da da. (B) análise de imunofluorescência do organóide neural da da; Células do TH-immunoreactive que coexpressam Nurr1, um marcador específico do midbrain (barra da escala = 50 μm). Os dados são representados como média ± SEM (n = 3). (C) os gráficos representam a cinética da expressão gênica de th e Nurr1 avaliada pela qRT-PCR. (D) HPLC representativa: pico de dopamina (seta) foi detectado por HPLC do lisado organóide neural da da. (E) exemplo de dados brutos gravados com a plataforma mea. Cada espiga é exibida por uma linha vertical (carimbos de hora), enquanto o traço restante é o ruído. (F) imagem representando uma neurofera DEPOSITADA no mea. (G) superposição de picos típicos (curvas azuis e vermelhas) detectadas a partir dos dados brutos. A curva em negrito preta indica a média das curvas vermelhas correspondentes. (H) plotagem raster mostrando os carimbos de hora associados a cada espiga detectado. As diferentes cores destacam os diferentes eletrodos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

GeneFowardReverter
Nurr1GGCTGAAGCCATGCCTTGTGTGAGGTCCATGCTAAACTTGACA
THMÉTODO GCACCTTCGCGCAGTTCTCCCGAACTCCACCGTGAA
EEF1AGCAAAAATGACCCACCAATGGCCTGGATGGTTCAGGATA
GAPDHGCACAAGGAAAGAGAGAACCAGGGGAGATTCAGTGTGGGT

Tabela 1: primers utilizados neste protocolo.

Discussão

Um dos aspectos mais críticos deste protocolo inclui a manutenção da pluripotência de hESC durante a cultura da célula e o monitoramento estreito das esferas e da morfologia organoide neural. os hESCs são muito sensíveis, e cada manipulação pode conduzir à diferenciação descontrolada adiantada assim como a morte da pilha. A fim aumentar a reprodutibilidade experimental e evitar a ocorrência de eventos anormais do karyotype, recomenda-se para criopreservar diversos lotes dos hESCs na passagem a mais baixa após a validação de sua estabilidade do cromossoma. Além disso, recomenda-se descongelar um novo frasco para cada experimento e verificar o comportamento das células todos os dias. Se as esferas são menos refração com tamanho mais alto anormal, eles provavelmente começará a agregar e morrer.

Uma melhoria em cima deste sistema é a perfusão ou a implementação de um sistema vascularized (adicionando pilhas endothelial ou dentro de um microchip fluídico 3D)12,13. Entretanto, controlar a espessura do organoid neural (≤ 300 μm) permite a perfusão passiva eficiente do oxigênio e dos nutrimentos e impede a necrose. Outra melhoria é a introdução de células imunes (microglia). Com estas limitações na mente, os organóides neural mais um sistema de GIC podem ser uma ferramenta relevante para diversas razões. Em primeiro lugar, este sistema permite a triagem de drogas para monitorar como um composto terapêutico pode afetar uma célula organoide ou tumor. Segundo, as interações célula a célula podem ser estudadas, e os determinantes microambientais subjacentes às invasões individuais e coletivas podem ser visualizados e explorados5,6,13.

No contexto da doença de Parkinson, um organóide neural enriquecido em neurônios DA DA pode representar um modelo 3D relevante e preciso para estudar o desenvolvimento DA doença. Em estudos prévios, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo paciente de Parkinson diferenciadas para os neurônios DA DA foram usadas para estudar os subtipos neuronais afetados. De notar, alguns fenótipos relacionados à doença, como o acúmulo de α-sinucleina e sensibilidade ao estresse oxidativo,foram observados14,15. Além disso, o organóide neural pode ser usado como uma ferramenta para a tela de moléculas terapêuticas. No entanto, leituras específicos e relevantes devem ser configurados para avaliar a sobrevida e a funcionalidade do neurônio da da, como a produção de dopamina e a atividade eletrofisiológica. Ao todo, este protocolo fornece duas abordagens padronizadas e precisas baseadas em células-tronco para gerar organóides neurais.

Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem à ligue Genevoise contre le Cancer (Genebra, Suíça), à Fundação ISREC (Lausanne, Suíça) e à Fundação Clayton de pesquisa (Houston, TX, EUA) pelo apoio financeiro. Além disso, os autores agradecem ao HES-HO e ao Wyss Center pelo apoio financeiro. Agradecemos ao laboratório de Krause por discussões e apoio úteis e Dr. Halah Kutaish para revisão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 6 poços (placa de 6 poços)Falcon / Corning07-201-588
ABI Prism 7900 HT sistema de detecção  (Sistemas de detecção de PCR em tempo real)Applied BiosystemsDescontinuado
Aggrewell 400 (Placas de cultura de micropoços)Amplificador StemCell Technologies34421
(W2100-HS32)  (Amplificador)Anticorpo
Abcamab761951/100 de diluição
Anti-GFAP AnticorpoDako Z334 Diluição de 1/1000
Anti-Nestin, Anticorpo HumanoMillipore ABD69 Diluição de 1/400
Anticorpo Anti-Sinapsina IChemicon AB1543P Diluição de 1/500
Suplementos B27 (B27)Life Technologies / Invitrogen1238Para ambos os protocolos, solução estoque 100x, solução final 1x
Fator neurotrófico derivado do cérebro  (BDNF)Orientação CelularGFH1-2Para ambos os protocolos,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
CHIR-99021 (inibidor GSK-3β )Axon Medchemct99021Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 7.5 mM em DMSO, solução final 3 µ
M Composto E a &gama; – inibidor da secretase (&gama; – inibidor de secretase)CalbiochemCAS 209986-17-4Para ambos os protocolos (inibidor de gama-secretase XXI),  solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 1 µ M
Coulochem III  (Parâmetros do detector coulométrico)Thermo scientific
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)SigmaD0627Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 0.5 M em DMSO, solução final 0.5 mM
Dimetil Sulfoxide Pure (DMSO)Sigma-AldrichC6164Compostos solvente, pronto para usar
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies12491-015Para cultura de células, pronto para usar
a Mistura de Meio Eagle Modificado F-12 da Dulbecco (DMEM-F12)Gibco11320033Para cultura de células, pronto para usar
EDTA 0.1 mM (EDTA)Life TechnologiesAM9912Para cultura de células, pronto para usar
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)GibcoPHG0313Para cultura GIC,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 10 ng/mL
Fator de Crescimento de Fibroblastos 20 (FGF20)Peprotech100-41Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 5 ng/mL
fator de crescimento de fibroblastos 8  (FGF8)PeprotechGFH176-5Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 100 ng/mL
Fator de crescimento de fibroblastos-básico (bFGF)GibcoPHG0024Para cultura GIC,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 10 ng/mL
G5 suplementos (G5)Invitrogen17503012Para cultura GIC, solução estoque 100x, solução final 1x
Fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)Orientação CelularGFH2-2Para ambos os protocolos,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
Membrana de politetrafluoretileno hidrofílico (membrana PTFE)BioCell-InterfaceDescontinuado
LDN-193189 (inibidor de BMP)Axon Medchem /Stemgen04-0072-02 /1509Dual/Smad,  solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 0.5 µ M
L-glutamina (L-glutamina)Gibco25030081L-Glutamina (200 mM), solução estoque 200 mM, solução final 2 mM
Matrigel (matriz extracelular)BD Biosciences354277Matriz qualificada para hESC, solução estoque 18-22 mg/mL, solução final 180-220 µ g/mL
Millicell-CM Inserção de placa de cultura  (0,4 µ m) (Inserção da placa de cultura)MilliporePICM03050
Anti-beta;-Tubulina III monoclonal anticorpoSigma T8660 Diluição de 1/1000
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Agitador orbital)Major ScienceMS-NRC-30
Suplementos N2 (N2)Invitrogen17502-048Para cultura GIC, solução estoque 100x, solução final 1x
Nanodrop (Nanodrop)Thermo Fisher ScientificDescontinuado
Neurobasal (Neurobasal)Life Technologies / Gibco21103049Manutenção e maturação de populações de células neuronais embrionárias, prontas para uso
Aminoácidos Não Essenciais  (NEAA)Gibco11140Aminoácidos Não Essenciais 100X, solução estoque 100x, solução final 1x
Nurr1 Anticorpo (M-196)Santa CruzSc-5568Diluição 1/100
Nutristem  (hESC médio)Biological Industries05-100-1AMídia de células-tronco, pronta para usar
Penicilina / Estreptomicina  (Penicilina / Estreptomicina )Life Technologies / Gibco15140122Para cultura de células, solução estoque 5 mg/mL, solução final 50 µ g/mL 
Ácido perclórico 0.1N (HCLO4)Merck100519Para HPLC, pronto para uso
Solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+/Mg2+  (PBS sem Ca2+/Mg2+)Life Technologies14190250Para cultura de células, pronto para usar
Kit RT-PCR PrimeScript (Kit de transcrição reversa)TakaraRR014A
Purmorphamin (agonista suavizado)CalbiochemSML0868Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 10 mM em DMSO, solução final 2 µ M
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK)Abcam Biochemicalsab120129-1Rock Inhibitor,  solução estoque 50 mM em DMSO, solução final 10 µ M
RNeasy mini kit (kit de extração de RNA)Qiagen74104
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor )AscentAsc- 163Dual-Smad,  solução estoque 50 mM em DMSO, solução final 10 µ M
Sonic Hedgehog (SHH)Cell GuidanceGFH168-5Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 100 µ g/mL em H2O puro, solução final 100 ng/mL
StemPro Accutase (solução enzimática hESC)GibcoA11105-01hESC, pronta para uso
Simetria C-18,5 mm (4.6 150mm2)  (Coluna de fase invertida)Waters Corporation
T150 frasco (T150)Falcon08-772-1F
TH Anticorpo (F-11)Santa CruzSc-252691/200 diluição
Fatores de crescimento transformadores beta 3 (TGFβ 3)Cell GuidanceGFH109-2Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 100 µ g/mL em etanol puro, solução final 1 ng/mL
Trichostatine A (inibidor da histona desacetilase)SigmaT8552Para protocolo dopaminérgico,  solução estoque 100 µ M em DMSO, solução final 20 nM
TrypLE (solução enzimática recombinante)Solução enzimática recombinantede 12604021 Invitrogen, pronta para uso
Tripsina 0,25% (solução enzimática)Life Technologies15050065solução enzimática, pronta para uso
W2100, Sistemas Multicanal (Sistema de aquisição de dados)WAT045905
X-vivo (meio livre de soro)LonzaBE04-743Qsoro meio livre, pronto para uso
Anti-EGFR (fosfo Y1101) de sistemas multicanalSolução enzimática

Referências

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