Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC). Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.
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Artigo de método
Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry
Neste artigo
Resumo
Resumo
A preparação de seções de alta qualidade do olho do rato para immunohistochemistry (IHC) é crítica para avaliar a estrutura e a função retinal e para determinar os mecanismos que subjacentes doenças retinal. Manter a integridade estrutural durante toda a preparação do tecido é vital para obter dados reprodutíveis de IHC retinal mas pode ser desafiante devido à fragilidade e à complexidade da Citoarquitetura retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam otimamente a estrutura retinal, impedem frequentemente a análise de IHC realçando a fluorescência do fundo e/ou as interações dediminuição do anticorpo-epítopo, um processo sabido como o mascaramento do epítopo. Os fixatives mais leves, por outro lado, como o paraformaldeído a 4%, reduzem a fluorescência de fundo e o epitope-mascaramento, técnicas de dissecção meticulosa devem ser utilizadas para preservar a estrutura retiniana. Neste artigo, nós apresentamos um método detalhado para preparar copos do posterior da ocular do rato para o IHC que é suficiente preservar a maioria de interações do anticorpo-epítopo sem perda de integridade estrutural retinal. Nós incluímos IHC representativo com os anticorpos aos vários marcadores retinal do tipo da pilha para ilustrar a preservação e a orientação do tecido circunstâncias óptimas e suboptimal. Nosso objetivo é aperfeiçoar estudos de IHC do retina fornecendo um protocolo completo da dissecção do copo do posterior da ocular ao IHC.
Introdução
Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica poderosa para localizar proteínas e estruturas celulares específicas nos tecidos in situ1,2,3. Os métodos inadequados da fixação e o seccionamento secundário-optimal de tecidos complexos podem interromper a estrutura do tecido, gerar a mancha elevada do fundo ou diminuir interações do anticorpo-epítopo, tendo por resultado artefatos de coloração e conseqüente interpretação errónea de Dados IHC4. Como a retina de vertebrados é um órgão neural complexo e altamente organizado composto por estratos de fotorreceptore....
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Protocolo
Todos os métodos aqui descritos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório fornecidos pelo Instituto de recursos animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade da Pensilvânia.
Todas as ferramentas e equipamentos para os métodos são mostrados na Figura 1 e listados na tabela de materiais.
1. Enucleation do olho do rato, dissecção do copo do olho, e incorporação
- Eutanizar camundongos com dióxido de carbon....
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Resultados
Para ilustrar como estes protocolos, asseguram a preservação retinal óptima para IHC, nós sondado seções retinal dos ratos de P28 WT (C57Bl/6N) com os anticorpos ao rodopsina (um marcador do fotorreceptor)8, descarboxilase ácido glutâmico 65 (Gad65, uma pilha amacrina marcador)9, glutamina sintetase (GS, marcador de célula Müller)10, e calbindin (marcador de célula horizontal)11 (
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Discussão
A dissecção do retina do rato é um processo delicado devido ao tamanho e à forma pequenos de olhos do rato e à fragilidade do tecido retinal. Mesmo que a realização de dissecção de alta qualidade é uma questão de prática, tendo um protocolo detalhado, fornecendo métodos eficientes e dicas é uma necessidade para obter seções retinianas e IHC. Além do que os protocolos descritos aqui, há diversas pontas que permitem as seções retinal de alta qualidade consistentes que são apropriadas para o IHC reprodutível.
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Divulgações
Sem divulgações.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos da NIH (RO1-GMO97327) e da Fundação de pesquisa universitária (UPenn). Agradecemos especialmente Svetlana Savina por sua ajuda no desenvolvimento do protocolo de imuno-histoquímica, Gordon Ruthel (Universidade da Pensilvânia) e do Penn vet Imaging Core para assistência com microscopia e Leslie King, Ph.D. para leitura crítica deste manuscrito .
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo de Aço Inoxidável 6qt. (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | Para nitrogênio líquido (Figura 1E) |
| Folha de alumínio | |||
| Cauterizador | Bovie | #AA01 | Para marcar a orientação do olho (Figura 1A) |
| Pinça curva, pinça Dumont # 5/45, dobra de 45 graus | Ciências de Microscopia Eletrônica | #72703-D | Para enucleação e manutenção do olho do mouse (Figura 1A) |
| Tesoura curva, Tesoura de Mola Vannas - Borda de Corte de 2,5mm | Ferramentas de Belas Ciências | #15002-08 | Para cortar circunferencialmente a córnea (Figura 1B) |
| Prato | Para dissecção da ocular (Figura 1C) | ||
| Microscópio de dissecação | Leica, Houston, EUA | Facas Micro de Estereomicroscópio de Alto Desempenho MZ12.5 | |
| Ferramentas de Belas Ciências | #10315-12 | Para fazer uma pequena incisão na marca de queimadura (Figura 1A) | |
| Cera dental rosa | Ciências da Microscopia Eletrônica | #72660 | Para prato de dissecação de revestimento |
| Slide Rack e Coverplate | Ted Pella | #36107 | Para IHC retiniano (Figura 1G) |
| Copo de Aço Inoxidável (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | Para banho de isopentano (Figura 1E) |
| Caixa | Para refrigerador isolado | ||
| Pinça fina Dumont #5 | Ferramentas de Belas Ciências | #11254-20 | Para remover a córnea e extrair a lente (Figura 1B) |
| Criomolde Tissue-Tek (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Ciências da Necroscopia Eletrônica | #62534-10 | Molde para incorporação OCT |
| Buffers e Reagentes | Company | Número de Catálogo | Comentários |
| Solução de bloqueio | 2% Soro de Cavalo Normal, 1.5% Gelatina de Pele de Peixe Frio (a 40-50% em H2O, #G7765 de gato), 5% de albumina de soro bovino (cat #AK1391-0100) em tampão de permeabilização. | ||
| Gelvatol (mídia de montagem anti-desbotamento) | Sob a capela de exaustão, dissolva 0,337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) em 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Ajuste para pH 8-8,5 com HCl 12N (~ 5 gotas). Armazene em frasco de gota âmbar a 4° C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml em PBS (1000x). Alíquota e loja no escuro, a 4° C por até 1 ano ou a -20 graus; C para armazenamento de longo prazo. Prepare fresco a 1 ug/mL (1x) |
| Isopentano, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Nitrogênio Líquido | |||
| (PFA) em Ciências | Microscopia Eletrônica PBS | #15710 | Preparado fresco 4% PFA de 16% de estoque de PFA. Armazene os 16% restantes de PFA a 4° C no escuro. |
| permeabilização | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Prepare fresco. | ||
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4. Preparado a partir de 10x estoque |
| Soluções de sacarose | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolva a quantidade apropriada de sacarose em 37 C PBS (leva ~ 15 min para dissolver). Pode ser armazenado por alguns dias a 4 graus Celsius. |
| Composto OCT Tissue-Tek | Sakura | #4583 | |
| Anticorpos | Company< | strong>Número de Catálogo< | strong>Comentários |
| anti-calbindina | Sigma-Aldrich | C8666 | Para rotular células horinzotais |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Para rotular células amácrinas GABAérgicas |
| anti-GS | BD Transdução | 610517 | Para rotular Mü células |
| de | Millipore | MAB5316 | Para marcar bastonetes |
Referências
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
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Reimpressões e permissões
