Summary
RNA 중합효소와의 전사 인자 (TFs)의 상호 작용은 일반적으로 풀다운 검정을 사용하여 연구됩니다. 우리는 클라미다이얼 RNA 폴리머라제와 GrgA의 상호 작용을 특성화하기 위해 생체층 간섭측정기(BLI) 기술을 적용합니다. 풀다운 분석과 비교하여 BLI는 실시간 연결 및 해리를 감지하고 더 높은 감도를 제공하며 정량적입니다.
Abstract
전사 인자 (TF)는 RNA 폴리머라제, 다른 TF 및 / 또는 템플릿 DNA와 상호 작용하여 유전자 발현을 조절하는 단백질입니다. GrgA는 의무적인 세포내 세균성 병원체 클라미디아에서 특별히 발견되는 새로운 전사 활성제이다. 친화성 구슬을 이용한 단백질 풀다운 분석제는 GrgA가 발달 단계에서 제품이 차별화적으로 요구되는 유전자에 대한 프로모터의 다른 세트를 인식하는 두 가지 σ 인자, 즉 σ66 및 σ28을결합한다는 것을 밝혀냈습니다. 우리는 BLI를 사용하여 상호 작용을 확인하고 더 특성화했습니다. BLI는 풀다운에 비해 몇 가지 장점을 보여줍니다: 1) 결합 파트너 간의 실시간 연관 및 해리를 드러내고, 2) 정량적 운동 파라미터를 생성하고, 3) 풀다운 분석이 종종 검출하지 못하는 바인딩을 검출할 수 있다. 이러한 특성은 클라미디아에서유전자 발현 조절에서 GrgA의 생리적 역할을 추론할 수 있게 해주었으며, 가능한 상세한 상호작용 메커니즘을 가능하게 한다. 우리는 이 상대적으로 저렴한 기술이 전사 및 기타 생물학적 과정을 연구하는 데 매우 유용할 수 있다고 생각합니다.
Introduction
DNA를 템플릿으로 사용하여 RNA 분자를 생성하는 전사는 유전자 발현의 첫 번째 단계입니다. 세균성 RNA 합성은 표적 프로모터1,2에RNA 중합효소(RNAP) 홀로효소의 결합에 따라 시작된다. RNAP 홀로효소(RNAPholo)는 프로모터 서열을 인식하기 위해 요구되는 다중 서브유닛 촉매 코어(RNAPcore) 및 σ 인자로 구성된다. 전사 활성제 및 억압자, 집합적으로 TFs라고 불리는, RNAPcore, σ 인자 및/또는 DNA의 결합 분대를 통해 유전자 발현을 조절합니다. 유기체에 따라, 그 게놈의 상당 부분은 생리적 필요 및 환경 단서3에 응하여전사를 조절하는 TFs에 전념될 수 있다.
클라미디아는 인간과 동물의 다양한 질병에 대한 책임이 있는 의무적인 세포내세균입니다 4, 5,6,7,8. 예를 들면, 클라미디아 trachomatis는 틀림없이 세계적인 인간에 있는 제 1 의 성병전달병원체이고,몇몇 저개발 국가에서 실명의 주요한 원인 4,5. 클라미디아는 초등체(EB) 및 망상체(RB) 9라고 불리는 두 개의 교대세포 형태를 특징으로하는 독특한 발달 주기를 가지고 있다. 반면, EB는 세포 외 환경에서 생존 할 수 있지만, 그들은 증식 할 수 없습니다. EBs는 내분비증을 통해 숙주 세포를 입력하고 접종 후 시간 이내에 숙주 세포질에서 더 큰 RBs로 분화합니다. 더 이상 전염성이 없는, RBs는 이진 분열을 통해 증식합니다. 약 20 시간, 그(것)들은 30-70 시간의 주위에 호스트 세포를 종료하는 EBs로 다시 분화하기 시작합니다.
클라미다이얼 발달 주기의 진행은 전사에 의해 조절된다. 거의 1,000개의 클라미다이얼 유전자의 과반수가 RBs가 활발하게 복제되는 중주기 동안 발현되는 반면, 소수의 유전자만이 EB를 숙주 세포로 입력한 직후에 전사되어 렙스내로의 EBs, 및 또 다른 작은 유전자 세트는 BBs10,11로의 RBs의 분화를 가능하게 하기 위하여 전사되거나 점점 전사된다.
클라미다이얼 게놈은 세 가지 σ 인자, 즉 σ66,σ28 및 σ54를인코딩합니다. σ66은 대장균 및 기타 박테리아의 하우스키핑 σ70과 동등한 것으로, 초기 및 중간 주기 유전자뿐만 아니라 일부 후기 유전자의 프로모터를 인식하는 역할을 하는 반면 σ28 및 σ54는 필요합니다. 특정 후기 유전자의 전사. 여러 유전자는 σ 66-의존성 프로모터 및 σ28-의존성프로모터(12)를 모두 운반하는 것으로 알려져 있다.
복잡한 발달 주기에도 불구하고 클라미디아13에서소수의 F만 발견되었습니다. GrgA(이전에는 C. 트라코마티스 세로바르 D 및 CTL0766에서 C. 트라코마티스 혈청Var D 및 CTL0766에서 가상 단백질 CT504로 주석을 주석화) 클라미디아-특이적TF는 처음에 σ 66-의존성 유전자(14)의 활성제로 인식되었다. 친화성 풀다운 검사는 GrgA가 σ66 및 DNA를 결합시킴으로써 그들의 전사를 활성화한다는 것을 입증했다. 흥미롭게도, 나중에 GrgA가 σ28과병동침을 가하고, σ28-의존적프로모터로부터 의 전사를 시험관내15로활성화한다는 것을 나중에 발견되었다. GrgA가 σ66 및 σ28에대해 유사하거나 상이한 친화력을 가지고 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 BLI를 사용하는 데 의존했다. BLI 어설슬보에 따르면 GrgA는 σ 28보다 30배 더 높은친화도에서 σ66과 상호 작용하는 것으로 나타났으며, 이는 GrgA가 σ 66-의존적 전사 및 σ28-의존적전사에서 차등 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 15.
BLI는 바이오센서의 끝부분에 있는 고정화 단백질 층으로부터 반사되는 백색광의 간섭 패턴을 검출하고 이를 내부기준층(16)의 것과 비교한다. BLI는 이러한 두 가지 간섭 패턴을 분석하여 바이오센서의 팁에 결합된 단백질의 양에 대한 귀중하고 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 바이오센서의 팁에 고정되는 단백질은 리간드라고 하며, 일반적으로 NTA 또는 관련 입자에 대한 친화도를 가지는 일반적인 항체 또는 에피토프 태그(예를 들어, 폴리-His-또는 비오틴 태그)의 도움으로 고정화된다. 스트렙타비딘)을 바이오센서 의 끝에. 분석물로 불리는 이차 단백질의 결합은 바이오센서의 끝에 있는 리간드가 바이오센서의 불투명도에 변화를 일으켜 간섭 패턴의 변화를 초래합니다. 분석물의 상이한 농도에 걸쳐 반복될 때, BLI는 질적뿐만 아니라 리간드와 분석액(16)사이의 친화성에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있다.
우리의 지식의 베스트에, 우리는 전사15에있는 단백질 단백질 상호 작용을 특성화하기 위하여 BLI를 채택한 첫번째이었습니다. 본 공보에서는 σ 28-바인딩에 대해 이전에 요구되었던GrgA 프래그먼트가 실제로 바인딩을 중재한다는 것을 보여 줍니다. 이 원고는 BLI 분석의 단계, 그리고 BLI 그래프의 생성및 결합 역학의 파라미터에 초점을 맞추고 있습니다. 리간드 및 타말수의 생산 (및 정제)을위한 방법은 여기에서 다루지 않습니다.
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Protocol
1. 단백질의 준비
- BLI 버퍼 (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM MM 2MM 2Cl)에 대해 BLI 검정 (그의 태그 된 리간드 및 매질 모두 포함)에 사용되는 각 단백질을 투석 하기 위해 투석 백 (적절한 컷 오프 크기)을 사용하십시오. , 0.1 mM DTT, pH 8.0, 4°C에서 4°C로 미리 냉각된 4시간 동안.
참고: BLI 분석법은 리간드와 반응하는 분석물의 어금니 농도가 공지되도록 생체센서 및 분석물 상에서 결합 부위를 포화시키는 농도로 리간드가 존재하도록 요구한다. 그의 발현 및 정제에 대한 방법론은 여기에서 다루지 않지만, 이전 간행물14,15에서찾을 수 있다. 이 시스템은 리간드가 고도로 정제된 형태로 요구되지는 않지만, 분석 기간 동안 임의의 버퍼 변화에 의한 백색광 간섭 패턴의 변화를 최소화하기 위해 BLI 버퍼에 비정제 된 리간드도 투석하는 것이 필수적이다. - 신선한 BLI 버퍼로 전환하고 또 다른 4 시간 동안 투석을 계속하십시오.
2. 바이오 센서 수화 및 분석 설정
- 분석의 개시 약 10분 전에, BLI 완충제의 피펫 200 μL을 PCR 튜브내로.
- 장갑을 낀 손을 사용하여 바이오 센서의 넓은 부분을 잡고 원래 포장에서 Ni-NTA-바이오 센서를 제거합니다.
- 바이오센서의 유리팁만 BLI 버퍼에 잠기게 되도록 PCR-튜브 위에 바이오센서를 놓습니다.
- 완전한 수분을 확보하기 위해 바이오센서 팁을 최소 10분 동안 물에 잠기십시오.
- 상기 단계에서 Ni-NTA-바이오센서의 유리 팁이 BLI 버퍼 이외의 다른 것을 만지지 않았는지 확인한다.
참고: 이 프로토콜은 Ni-NTA-바이오센서를 그의 태그가 붙은 리간드와 함께 사용합니다. 필요한 경우, SA-Streptavidin-biosensor는 바이오티니글리간드와 함께 사용할 수 있습니다: (i) 리간드와 분석체 모두 그의 태그를 가지고 있거나 (ii) 둘 중 어느 것도 하지 않습니다.
- 상기 단계에서 Ni-NTA-바이오센서의 유리 팁이 BLI 버퍼 이외의 다른 것을 만지지 않았는지 확인한다.
- BLItz 기계를 켭니다.
- 기기 뒷면의 USB 데이터 출력 포트를 통해 기기가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 컴퓨터에서 연결된 소프트웨어(예: BLItz Pro)를 열고 화면 왼쪽에 있는 고급 운동학을 클릭합니다.
- 소프트웨어에서 각 제목 아래에 실험에 대한 모든 적절한 정보(실험 이름, 설명, 샘플 ID 및 단백질 농도 포함)를 입력합니다.
- 바이오 센서 유형을 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 Ni-NTA를 선택합니다.
- 실행 설정 제목에서 셰이커가 사용설정으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 단계 유형 목록 제목 아래에 초기 기준선, 하중, 기준선, 연결 및 해리의 5개 항목이 나열되어 있는지 확인합니다.
참고: 각 단계의 기간은 필요에 따라 기본값에서 변경할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 초기 기준선 및 기준선에 최소 30초를 사용합니다. 협회 와 해리에 대한 120 s. 로딩 단계(120~ 240초 범위)의 지속 시간은 Ni-NTA-바이오센서에 대한 리간드상의 그의 에피토프 태그의 농도 및 친화성에 따라 달라집니다.
- PCR 튜브에서 수화 된 Ni-NTA-바이오 센서를 제거하고 바이오 센서의 넓은 부분을 마운트에 밀어 기계의 바이오 센서 마운트에 부착하십시오.
참고: 실험 중에 바이오센서가 마르지 않도록 하십시오. - 0.5 mL 블랙 미세원원지 튜브를 기계의 튜브 홀더에 넣고 BLI 버퍼의 400 μL을 피펫으로 넣습니다.
- 튜브 홀더가 기기의 검은색 화살표 앞에 위치되도록 기계의 슬라이더가 배치되었는지 확인합니다.
- 바이오 센서 팁이 미세 원심 분리튜브의 완충액에 잠기게되도록 기계의 덮개를 닫습니다.
- 소프트웨어의 다음을 클릭하여 초기 기준선 기록을 시작합니다.
3. 바이오 센서에 리간드의 하중
- 초기 기준 선 단계가 레코딩을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
- 드롭 홀더(튜브 홀더 대신)가 검은색 화살표 앞에 놓이도록 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
- 투석된 그의 태그가 붙은 리간드(1.1단계에서)의 피펫 4 μL을 드롭 홀더에 끼우고 기계의 덮개를 닫습니다.
참고: 사용되는 리간드의 최적 농도는 단백질마다 다를 수 있습니다. 1.0 에서 2.0 mg/mL 사이의 농도는 일반적으로 240 초에서 바이오 센서의 끝에서 NTA를 포화시키기에 적당을 갖는다. - 소프트웨어에서 다음을 클릭하여 로드를 시작합니다.
4. 추가 리간드를 씻어내다
- 로딩 단계가 녹화를 완료한 후 기기덮개를 엽니다.
- 슬라이더를 왼쪽으로 이동하여 튜브 홀더가 다시 검은 색 화살표 앞에 배치되도록 합니다.
- 기기 뚜껑을 닫고 바이오센서 팁이 튜브 홀더의 BLI 버퍼에 잠겨 있는지 확인합니다.
- 소프트웨어에서 다음을 다시 클릭하여 기준선 기록을 시작합니다.
5. 리간드에 대한 어설션 의 협회
- 기준선 단계가 레코딩을 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다.
- 드롭 홀더를 제거하고 단백질을 파이펫팅하여 이중 탈이온수(ddH 2O)로 총5회 헹구어 청소합니다.
- 티슈 와이프를 사용하여 세척 후 드롭 홀더의 표면을 청소하십시오.
- 드롭 홀더를 기기에 다시 놓습니다.
- 드롭 홀더가 다시 검은 색 화살표 앞에 배치되도록 기기의 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
- 투석된 어액의 피펫 4 μL(1.1단계에서)을 드롭 홀더에 대고 기계 의 덮개를 닫습니다.
- 소프트웨어에서 다음을 클릭하여 연결을 시작합니다.
6. 리간드에서 의한 해화의 해리
- 연결 단계가 녹화를 완료한 후 기기덮개를 엽니다.
- 튜브 홀더가 다시 한 번 검은 색 화살표 앞에 위치하도록 기계의 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.
- 소프트웨어에서 다음을 클릭하여 해리를 시작합니다.
- 해리 단계가 녹화를 마친 후 기기덮개를 엽니다.
- 드롭 홀더와 튜브 홀더를 분리합니다.
- ddH2O로 모두 헹구어 단백질을 씻어내세요.
- 바이오 센서를 제거하고 안전하게 폐기하십시오.
7. 다른 농도와 상호 작용을 반복
- 다른 해석농도를 사용하여 동일한 리간드-해석기 쌍에 대해 2-7단계를 반복합니다.
참고: 최적의 결과를 얻기 전에 여러 번의 실행에서 측정물의 농도를 조정해야 할 수도 있습니다. 우리의 경험에서, 의 비율 1:5:10 분석물 농도의, 시작 75 nM, 일반적으로 적절 한.
8. 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석
- 모든 실행이 완료되면 파일을 클릭하여 소프트웨어의 데이터를 저장한 다음 화면 왼쪽에 있는 실험 저장을 클릭합니다.
- 데이터 실행 제목에서 단계 수정 및 피팅(1:1)을 선택하고 분석단추를 클릭하여 운동 데이터를 생성합니다.
- 정량적 데이터를 워크시트로 추출하고 그래프를 생성하려면 CSV로 내보내기를 클릭하고 기록된 데이터를 .csv 파일로 저장합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 .csv 파일을 엽니다.
- 연결 및 해리 역학을 가장 효과적으로 표시하려면 기준선 단계 이전의 모든 플롯 점을 제거하고 최종 기준선 값에서 모든 후속 플롯 점을 정규화합니다.
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Representative Results
BLI 검소사를 통해, 우리는 이전에 GrgA 15의 28 아미노산 중간 영역(잔류물 138-165)에 의존하여GrgA와 σ28의 결합을 확립하였다. 이에 따라, N-말기 그의 태그 전체 길이 GrgA (NH-GrgA)에 비해, GrgA 삭제 구조부족이 지역 (NH-GrgAΔ138-165) 감소 협회 비율과 증가 해리 율을 했다, 전체의 3 백만 배 손실로 이어지는 선호도(표1). 여기서, 우리는 이러한 중간 영역이 GrgA 단백질의 나머지 부재에서 σ28을 직접 결합한다는 것을 입증한다. 이러한 실험에서, N-말단히 태그(NH-GrgA138-165)로 태그된 중간 영역은 리간드로서 사용되었고, 이는 Ni-NTA 바이오센서의 끝에먼저 고정되었다(도 1A). 바이오센서에서 언바운드 NH-GrgA138-165를 세척한 후,σ28의첨가 후, 분석물 σ(28)와의 실시간 연관이 기록되었다. 마지막으로, 실시간 해리는 세척 후 기록되었다. 리간드 결합 전에 30s를 시작하고 세척 시작 후 2분 후에 끝나는 3개의 상이한 해석물 농도를 가진 실험의 기록은 도 1A에도시되어 있다. 리간드-분석물 상호 작용을 더 잘 시각화하기 위해 리간드를 추가하기 전에 데이터를 제거하고 기준선을 0으로 재설정하여 도 1B를도출합니다.
Σ28을 가진 NH-GrgA138-165 단편의 상호작용을 위한 운동 파라미터의 값은 표1에 제시되어 있다. NH-GrgA X σ28 상호작용과 비교하여, NH-GrgA138-165 X σ28 상호작용은 ka에서 통계적으로 유의한 60% 감소를 보였으며, kd에서 통계적으로 유의한 64% 증가를 나타냈다. , K D에서매우 통계적으로 유의한 3.5 배 증가. 이러한 변화는 NH-GrgA에 비해, NH-GrgA138-165 결합 σ28이 더 느리게, σ28에서 더 빨리 해리되고, σ28과의전반적인 친화도감소를 갖는다는 것을 보여준다. 따라서 GrgA에서 잔기 138-165는 σ28을 결합하지만 전체 길이 GrgA에 비해 친화도가 감소한다.
도 1: GrgA의 28아미노산 중간 영역은 시험관내에서 σ28을 결합한다.
(A) 4단계로 기록된 광 간섭 패턴의 실시간 변화: (i) NH-GrgA138-165(리간드)를 Ni-NTA 바이오센서에 결합, (ii) 세척, (iii) NS-σ28(Analyte)의 결합을 고정화된 것으로 NH-GrgA-138-165 (리간드), 및 (iv) 후속 세척. (B) (A) 및 기준선 의 초기 두 단계에서 값의 제거 후 리간드- 어액 화자 연관 및 해리의 향상된 시각화. 패널 B는 Desai 외, 201815에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 리간드 | N | ka | kd | KD | 참조 | |||||||||||
| 1/Ms | % 제어 | 1/s | % 제어 | M | % 제어 | |||||||||||
| NH-그라우트가 | 8개 | (1.5 ± 1.7) x 104 | 100개 | (2.8 ± 0.8) x 10-3 | 100개 | (2.2 ± 0.3) x 10-7 | 100개 | Desai 외, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ138-165 | 2개 | (5.6 ± 0.1) x 103 | 37세 | (4.1 ± 0.3) x 102 | 1.5 x 107 | (6.9 ± 4.5) x 10-2 | 3.1 x 108 | Desai 외, 2018 | ||||||||
| p=0.125 | p&0.002 | p&0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3개 | (6.0 ± 1.0) x 103 | 40 | (4.6 ± 0.4) x 10-3 | 164세 | (7.7 ± 0.3) x 10-7 | 350개 | 이 연구는 | ||||||||
| p=0.074 | p=0.006 | p&0.001 | ||||||||||||||
표 1: GrgA의 돌연변이체는, 단지 아미노산 잔기 138-165를 함유하고, Σ28을 결합하여 전체 길이 GrgA에 비해 낮은 친화도에도 불구하고.
BLI 공화학은 Ni-NTA 바이오센서를 사용하여 리간드로 그의 태그가 붙은 전신 GrgA 또는 결실 돌연변이체를 사용하여 수행되었고, 정제된 스트렙 태그σ28을 매말물질로서 수행하였다. 기록 그래프는 그림1에 나와 있습니다. 운동 파라미터의 값(평균 ±표준 편차)은 관련소프트웨어(17)와함께 생성되었다. k a(결속속도 상수)는 A 및 B. k d(해리속도 상수)의 1 몰 용액에서 s당 형성된 복합체의 수로서 정의되며 초당 붕괴되는 복합체의 수로서 정의된다. K (주) D(해리평상수)는 리간드 결합 부위의 50%가 타액에 의해 점유되는 농도로 정의되며, kd는 ka로 나눈다. n, 실험 반복 횟수. p 값은 2 꼬리 학생의 t 시험을 사용하여 계산되었습니다. NH-GrgA 및 NH-GrgAΔ138-165에 대한 운동 매개변수는 Desai et al., 201815에서나였습니다.
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Discussion
단백질 단백질 상호 작용은 전사 및 기타 생물학적 과정의 조절에 매우 중요합니다. 그(것)들은 풀다운 assays를 통해 일반적으로 공부됩니다. 풀다운 분석은 상대적으로 수행하기 쉽지만 양이 적고 약하지만 생물학적으로 의미있는 상호 작용을 감지하지 못할 수 있습니다. 이에 비해, 리간드와 어말레이트 사이의 실시간 연관 및 해리를 검출함으로써 BLI는 협회 및 해리속도 상수뿐만 아니라 전반적인 친화성을 제공한다.
풀다운 어세이에 비해 BLI 어세이스는 더 높은 감도를 제공합니다. 예를 들어, GrgA-σ28 상호 작용은 BLI에 의해 분석물의 낮은 nM 농도로 검출되지만 풀다운 분석 (게시되지 않은 데이터)에 의해 검출되지 않습니다. 풀다운과 는 달리 BLI는 감도에 크게 영향을 미칠 수 있는 검출 항체에 의존하지 않습니다.
더 중요한 것은, BLI 분석은 단백질 사이 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있는 반면, 풀다운 분석은 할 수 없습니다. 이는 σ28과 상이한 GrgA 구문의 상호작용에 의해 예시된다. NH-GrgA에 비해, NH-GrgAΔ138-165 및 NH-GrgA138-165는 결합 σ28에서ka에서 60%의 손실만을 겪습니다. 이러한 사실 인정은 GrgA가 N-말단 64 잔기가 결여된 것을 보여주는 우리의 이전 BLI 데이터와 일치하며, 이는 GrgA의 N-말단 서열이 σ28 결합에 기여한다는 것을 시사한다. NH-GrgAΔ138-165 및 NH-GrgA138-165는 결합 σ28에서유사한 k 값을 가지지만, 전자는 후자보다 91,000배 높은 k d를 가수있다. 이러한 결과는 138-165의 결합이 GrgA의 구조적 변화를 유발하여 복합체를 크게 안정화한다는 것을 나타냅니다.
BLI보다 더 긴 역사를 가진, 표면 플라스몬 공명(SPR)은 또한 실시간 단백질-단백질 상호작용18,19를정량화할 수 있다. BLI의 감도는 SPR20보다낮은 것으로 생각되지만, 전자는 현재 비용 효율성에서 후자를 능가합니다. 예를 들어, SPR 바이오 센서의 비용은 BLI 바이오 센서보다 훨씬 높습니다.
SPR의 기본 원리의 특성으로 인해 단백질을 둘러싼 미디어의 미세 유체학적 특성에 크게 영향을 받습니다. 따라서, 일부 SPR 기기와 관련된 실험은 최적의 완충 조건21,22,23,24를보장하기 위해 연구자의 부분에 상당한 지각을 필요로한다. 한편, 현재 BLI 계측기는 매우 제한된 온도 제어 범위(25)를 특징으로 하며, 따라서 주어진 상호작용에 대해 열역학적 파라미터(예: 엔탈피 및 깁스 자유 에너지)를 결정하기에 적합하지 않습니다.
글리세롤, 일반적으로 사용되는 저온 보호제, BLI와 호환되지 않습니다, 광범위한 화학 적 호환성에도 불구하고. 따라서, 리간드에서 글리세롤을 제거하고 투석에 의해 어게인하는 것이 중요합니다. 생성된 글리세롤이 없는 단백질은 4°C에 보관되어야 하며, 이는 증가된 불안정성 및 부정확한 운동 파라미터로 이어질 수 있습니다. BLI 분석은 투석 직후에 수행되는 것이 좋습니다, 특히 일치하지 않는 운동 매개 변수가 다른 시간에서 얻어지는 경우에. BLI 측정이 완료되어야 하는 정확한 시간 프레임은 단백질마다 다르며 농도에 의해 영향을 받습니다.
SPR과 마찬가지로 BLI는 소분자스크리닝(26)에사용되어 왔다. 새로운 BLI 기기가 스크리닝을 위한 높은 처리량 옵션을 제공한다는 점을 고려할 때, 우리는 BLI가 단백질-단백질 상호 작용을 용이하게 하거나 방해하는 소분자의 식별 및 특성화에 매우 유용해질 수 있다고 생각합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 (보조금 # AI122034 및 AI140167)와 뉴저지 건강 재단 (보조금 # PC 20-18)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
