Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Resumo

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencon ventral (VM). A terapia da recolocação da pilha prende a grande promessa para o tratamento do paládio. recentemente, as pilhas de haste neural induzidas (iNSCs) emergiram como um candidato potencial para a terapia da recolocação da pilha devido ao risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade para dar o aumento neurônios específicos da região e glia. os iNSCs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e vários outros tipos de células. Comparado com outros tipos de células somáticas, PBMNCs são um tipo de célula iniciante atraente por causa da facilidade de acesso e expansão na cultura. O vírus de Sendai (SeV), um vírus não integrativo do RNA, codificando fatores de reprogramação que incluem o OCT3/4humano, SOX2, KLF4 e c-Myc, tem um genoma negativo-sentido, único-encalhado, não-segmentado que não integre em genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para a reprogramação. Neste estudo, nós descrevemos um protocolo em que o iNSCs é obtido reprogramando PBMNCs, e diferenciado em neurônios especializados DA VM DA por um método Two-stage. Então os precursores são transplantados em modelos unilateralmente 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned do rato do paládio para avaliar a segurança e a eficácia para o tratamento do paládio. Este método fornece uma plataforma para investigar as funções e os efeitos terapêuticos de células neurais DA DA do paciente-específicas in vitro e in vivo.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa comum, causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencéfalo ventral (VM), com uma prevalência de mais de 1% na população acima de 60 anos de idade ^{1. º , 2}. ao longo da década passada, a terapia celular, destinada a substituir as células degenerativas ou danificadas, ou Nutrir o microambiente em torno dos neurônios degenerativos, mostrou potencial no tratamento de PD³. Enquanto isso, a tecnologia de reprogramação fez progressos significativos⁴, que fornece uma fonte celular promissora para a terapia de reposição. As pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e as pilhas de haste embrionário (ESCS) foram provadas ser capazes de diferenciar-se em pilhas neural de da, que poderiam sobreviver, maturate, e melhorar as funções de motor quando enxertadas em ratos e em modelos não-humanos do PD do primata^{5 ,6,7,8}. os iPSCs representam um marco nas tecnologias de reprogramação celular e têm um grande potencial de transplante celular; Entretanto, há ainda uma preocupação sobre o risco de formação tumoral a partir das células incompletamente diferenciadas. Uma fonte celular alternativa para o transplante de células é células-tronco adultas comprometidas por linhagem obtidas por meio de reprogramação direta, como células-tronco neurais induzidas (iNSCs), que podem ser derivadas dos intermediários instáveis, ignorando a pluripotência etapa^9,10,11.

Tanto o iPSCs quanto o inscs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (pbmncs) e vários outros tipos de células^12,13,14, reduzindo assim a imunogenicidade das células transplantadas em grande grau. Além disso, comparado com iPSCs, os iNSCs são inerentes com risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade linhagem-comprometida, somente capaz de diferenciar-se em neurônios e em glia¹¹. Nos estudos iniciais, os iPSCs humano ou camundongo e os inscs foram gerados a partir de fibroblastos obtidos a partir de biópsias cutâneas, o que é um procedimento invasivo^14,15. Com este respeito, os PBMNCs são uma fonte de célula de partida atraente por causa do processo de amostragem menos invasivo, e a facilidade de obter um grande número de células dentro de um curto período de tempo de expansão¹⁶. Os estudos de reprogramação inicial empregaram sistemas integrativos de entrega, como vetores lentivirais ou anti-retrovirais, que são eficientes e fáceis de implementar em muitos tipos de células¹⁷; no entanto, esses sistemas de parto podem causar mutações e reativação de transgenes residuais, que apresentam problemas de segurança para fins terapêuticos clínicos¹². O vírus de Sendai (SeV) é um vírus de RNA não integrativo com um genoma de sentido negativo, único que não se integra no genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para reprogramar^{18 ,19}. Os vetores de SeV recombinantes estão disponíveis que contêm fatores de reprogramação, incluindo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-Myc humanos em seus quadros de leitura abertos. Além disso, os vetores virais SeV podem ser melhorados através da introdução de mutações sensíveis à temperatura, para que possam ser rapidamente removidas quando a temperatura da cultura é aumentada para 39 ° c²⁰. Neste artigo, descrevemos um protocolo para reprogramar PBMNCs para iNSCs usando o sistema SeV.

Muitos estudos relataram a derivação dos neurônios da ESCS humana ou iPSCs usando vários métodos^6,8,21. No entanto, há uma escassez de protocolos descrevendo a diferenciação de neurônios da da iNSCs em detalhes. Neste protocolo, descreveremos a geração eficiente de neurônios da do iNSCs usando um método de dois estágios. Os precursores neuronais DA DA podem ser transplantados para o estriado de modelos de mouse PD para avaliações de segurança e eficácia. Este artigo apresentará um protocolo detalhado que cubra vários estágios da geração de pilhas de haste neural induzidas pelo vírus de Sendai, diferenciação de inscs em neurônios da da, estabelecimento de modelos do PD do rato, à transplantação de precursores do da no estriado dos modelos de PD. Usando este protocolo, pode-se gerar iNSCs de pacientes e doadores saudáveis e derivar neurônios DA DA que são seguros, padronáveis, escalonáveis e homogêneos para fins de transplante celular, ou para modelar PD em um prato e investigação dos mecanismos início e desenvolvimento da doença subjacente.

Protocolo

Todos os procedimentos devem seguir as diretrizes do Comitê institucional de ética em pesquisa humana. O consentimento informado deve ser obtido de pacientes ou voluntários saudáveis antes da coleta de sangue. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da instituição e foi realizado de acordo com as diretrizes da instituição para o cuidado e uso de animais.

1. recolha, isolamento e expansão de PBMNCs

1. Coleção de PBMNCs
   1. Colete 10-20 mL de sangue venoso periférico do doador por punção venosa com um frasco de conservante de heparina sódica.
      Nota: as amostras de sangue devem ser armazenadas ou enviadas à temperatura ambiente (RT). Processe as amostras de sangue dentro de 24 h.
2. Preparação do meio de cultura
   1. Prepare o meio livre de soro (SFM) combinando os seguintes componentes: 245 mL do meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 mL de F-12 de presunto, 5 mL de insulina-transferrina-selênio-X suplemento (ITS-X), 5 mL de solução de stock de 100x glutamina (tabela de Materiais), 5 ml de concentrado lipídico quimicamente definido, 2,5 g de soro fetal bovino, 0, 25 g de ácido ascórbico e 9 μL de 1-tioglicerol. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
      PRECAUÇÃO: o ácido ascórbico e o 1-tioglicerol são tóxicos por contacto com a pele e inalação.
   2. Para preparar o meio de células mononucleares (MNC), complementar o meio SFM com 10 ng/mL de interleucina humana 3 (IL-3), 2 U/mL de eritropoietina (EPO), 100 ng/mL fator de células-tronco humanas (SCF), 40 ng/mL fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF-1), 100 μg/mL holo-transferrina e 1 dexametasona μM. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
      Nota: Prepare o meio imediatamente antes de usar.
3. Isolamento de PBMNCs
   1. Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
   2. Transferir o sangue periférico (PB) para um tubo cônico de 50 mL e diluir o PB com um volume igual de soro fisiológico tamponado de Dulbecco estéril (D-PBS).
   3. Prepare 15 mL de meio de gradiente de densidade esterilizado (tabelas de materiais) em outro tubo cônico de 50 ml.
      Nota: Mantenha o meio de gradiente de densidade e o PB em RT para permitir um melhor isolamento dos PBMNCs.
   4. Incline o tubo cônico contendo o meio de gradiente de densidade em um ângulo de 45 ° e, em seguida, lentamente e cuidadosamente coloque 30 mL de PB diluído no meio de gradiente de densidade.
      Nota: Tome cuidado e permita que o PB corra lentamente para baixo do lado do tubo cônico na camada média do gradiente de densidade. Os glóbulos vermelhos depositam na parte inferior do tubo. Incline o tubo com cuidado para minimizar o rompimento da interface da camada.
   5. Centrifugue os tubos a 800 x g durante 15 min em RT com o travão de centrifugador fixado na posição "off". Aspirar a camada de plasma superior amarela e descartá-la. Em seguida, transfira a camada de película fina branca e turva contendo MNCs com uma pipeta de 10 mL para um novo tubo cônico de 50 mL.
      Nota: a comutação do travão do centrifugador é importante para o isolamento das MNCs.
   6. Adicionar 30 mL de D-PBS ao tubo com MNCs e centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione 45 mL de D-PBS para re-suspender as células. Centrifugador a 400 x g durante 10 min a 4 ° c.
      Nota: o travão do centrifugador deve ser ligado para este e as seguintes etapas de centrifugação. À medida que as pelotas de células são densas, adicione 1-2 mL de D-PBS para resuspender suavemente as pelotas e, em seguida, adicionar D-PBS a 45 mL.
   7. Descarte o sobrenadante e Resuspenda as células com 5 ml de D-PBS e conte as células ao vivo com o método de exclusão azul de Tripan.
   8. Depois de deixar de lado as MNCs necessárias para a expansão, congele as células restantes para uso futuro.
      Nota: pelo menos 5 x 10⁶ MNCs podem ser congelados em um frasco com 1 ml de meio de congelação (tabela de materiais). O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Expansão das MNCs
   1. No dia-14, as MNCs de sementes em uma densidade de 2-3 x 10⁶ células por mililitro em um poço de seis poços placas com 1,5 ml de pré-aquecido (37 ° c) MNC médio. Incubar a 37 ° c, 5% CO₂ por 2 dias.
   2. No dia-11, colete as células e o meio com uma pipeta esterilizada e transfira para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as pilhas em 250 x g por 5 minutos em RT. descarte o sobrenadante e Resuspenda as células em 1 ml de meio MNC pré-aquecido (37 ° c).
   3. Conte as células viáveis com azul de Tripan. Semeie as MNCs com uma densidade de 1 x 10⁶ células por mililitro em meio de MNC pré-aquecido e incubar a 37 ° c, 5% co₂ por 3 dias.
      Nota: espera-se que o número total de células pode diminuir no dia-11.
   4. No dia-8, repita os passos 1.4.2-1.4.3 e cultura das células para 3 dias.
   5. No dia-4, repita as etapas 1.4.2-1.4.3 e cultura das células por 3 dias.
      Nota: após 14 dias de cultura, um número igual ou maior de MNCs deve permanecer na cultura.

2. reprogramação de PBMNCs para iNSCs por SeV infecção

1. Preparação de solução e meio de cultura
   1. Prepare uma solução de estoque de poli-D-lisina (PDL) dissolvendo 100 mg de PDL com 100 mL de H₂o a uma concentração de 1 mg/ml. Conservar a-20 ° c em alíquotas de 1 mL.
   2. Prepare uma solução de insulina dissolvendo 100 mg de insulina em 20 mL de 0, 1 N HCl para uma concentração de 5 mg/mL. Conservar a-20 ° c em alíquotas de 1 mL.
   3. Para preparar 200 mL de meio basal iNSC, combine 96 mL de DMEM-F12 e 96 mL de meio básico (tabela de materiais) com 2 ml de solução de estoque de glutamina 100x, 2 ml de aminoácido não essencial (neaa), 2 ml de suplemento de N2 e 2 ml de suplemento B27. Adicionar 10 ng/mL fator inibitório de leucemia humana recombinante, 3 μM CHIR99021 e 2 μM SB431542 antes da utilização. Filtre o suporte e guarde-o a 4 ° c.
      Nota: Use o meio dentro de 2 semanas. Adicionar fator inibitório de leucemia humana recombinante, CHIR99021 e SB431542 imediatamente antes do uso.
2. Reprogramação de PBMNCs para iNSCs por SeV infecção
   1. Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
   2. No dia 0, colete as células no meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e Resuspenda as células com 1 ml de meio MNC pré-aquecido.
   3. Conte as células viáveis com azul de Tripan. Resuspenda as células com meio MNC pré-aquecido (37 ° c) a uma concentração de 2 x 10⁵ células por poço em placas de 24 poços.
   4. Depois de remover os tubos SeV de-80 ° c de armazenamento, descongelar os tubos contendo SeV em banho de água de 37 ° c para 5-10 s e, em seguida, permitir-lhes descongelar at RT. Uma vez descongelados, coloque-os no gelo imediatamente.
   5. Adicione o Sev que codifica o Klf4 humano, Oct3/4, SOX2 e c-Myc aos poços, em um multiplicidade da infecção (moi) de 10. Centrifugue pilhas com as placas em 1.000 x g por 30 minutos para facilitar o acessório das pilhas. Deixe as células e sobrenadantes nas placas. Coloc as placas na incubadora em 37 ° c, 5% CO₂.
      Cuidado: todos os procedimentos envolvendo SeV devem ser realizados em um armário de segurança, e todas as pontas e tubos devem ser tratados com etanol ou lixívia antes da eliminação.
   6. No dia 1, transfira o meio e as células para um tubo de centrifugação de 15 mL. Enxague o poço com 1 mL de meio MNC. Centrifugue a suspensão da pilha em 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e Resuspenda as células com 500 μL de meio de MNC pré-aquecido fresco em placas de 24 poços.
      Nota: Use uma placa baixa do acessório 24-well para impedir o acessório de todas as pilhas antes de chapeamento em PDL/laminin.
   7. No dia 2, diluir 1 mL de 1 mg/mL de PDL com 19 mL de D-PBS a uma concentração de 50 μg/mL. Cubra 6 placas de poço com 50 μg/mL de PDL por pelo menos 2 h em RT.
   8. Diluir 200 μL de 0,5 mg/mL de laminina com 20 mL de D-PBS a uma concentração de 5 μg/mL. Aspirar PDL nas placas de 6 poços, e secar no banco limpo vertical.
   9. Revestimento 6-placas de poço com 5 μg/mL de laminina e incubar para 4-6 h a 37 ° c. Lave com D-PBS antes de usar.
   10. No dia 3, a placa as pilhas transdoadas obtiveram na etapa 2.2.6 no meio do iNSC em placas de 6 poços PDL/laminina-revestidas.
       Nota: Mova as placas suavemente, se necessário, depois de as células serem colocadas em placas revestidas com PDL/laminina, tentando não perturbar o acessório das células.
   11. No dia 5, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 ° c) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
       Nota: espera-se que as células passarão por morte drástica (> 60%).
   12. No dia 7, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 ° c) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
   13. Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio gasto com meio de iNSC pré-aquecido (37 ° c) fresco todos os dias. Monitore o surgimento de colônias do iNSC. Escolha e transfira clones de iNSC para expansão em cerca de 2-3 semanas. Pegar colônias com morfologia adequada usando pipetas de vidro queimado, excluindo quaisquer células possivelmente contaminantes, e aspirar as colônias com 200 μL de pontas.
       Nota: os iNSCs caracterizados podem ser congelados para uso futuro com 2-5 colônias em um frasco. O meio de congelação inclui o meio basal livre do soro (tabela de materiais) e o dimetil sulfóxido misturado em uma relação de 9:1, que deve ser preparado imediatamente antes do uso. O protocolo pode ser pausado aqui.

3. diferenciação de iNSCs para neurônios dopaminérgicos

1. Preparação de solução e meio de cultura
   1. Prepare 200 mL de meio basal de diferenciação iNSC combinando 192 mL de DMEM-F12 com 2 mL de solução de estoque de glutamina 100x, 2 mL de NEAA, 2 mL de suplemento de N2 e 2 mL de suplemento B27.
      Nota: Use o meio dentro de 2 semanas.
   2. Prepare o meio do estágio I da diferenciação do iNSC suplementando o meio basal da diferenciação de iNSC com 1 μM SAG1 e 100 ng/mL FGF8b.
      Nota: Use o meio dentro de 2 semanas.
   3. Prepare o meio do estágio II da diferenciação de Insc completando o meio basal da diferenciação de Insc com o monofosfato cíclico da adenosina de 0,5 milímetros (acampamento), o ácido ascórbico de 0,2 milímetros, o dapt de 10 μm, o fator neurotrófico derivado do cérebro de 10 ng/ml (BDNF), 10 ng/ml glial derivado fator neutrophic (GDNF) e 1 ng/mL que transforma o fator de crescimento βIII (TGF-βIII).
      Nota: Use o meio dentro de 2 semanas.
2. Revestimento dos pratos de cultura
   1. Ultravioleta-esterilizar um banco limpo antes de usar. Esterilizar todas as superfícies e equipamentos com 75% de álcool. Esterilizar todas as pontas usando uma autoclave.
   2. Para o revestimento PDL, pelo menos um dia antes de re-chapeamento das células, diluir 1 mL de 1 mg/mL PDL com 19 mL de D-PBS para uma concentração de 50 μg/mL. Cubra as coberturas de vidro de 12 mm que foram esterilizadas com álcool a 75% nas placas de 24 poços com 50 μg/mL de PDL em RT por pelo menos 2 h.
   3. Para o revestimento de laminina, diluir 200 μL de laminina de 0,5 mg/mL com 20 mL de D-PBS a uma concentração de 5 μg/mL. Aspirar PDL e secar os poços no banco limpo. Cubra as coberturas de 12 mm com laminina 5 μg/mL e incubar por 4-6 h a 37 ° c. Lave com D-PBS antes de usar.
3. Células de passagem para diferenciação.
   1. Quando a confluência de iNSCs cultivadas atinge 70-90%, aspirar meio da placa de cultura, e adicionar 1 mL de D-PBS para lavar as células. Adicionar 1 mL de reagente de dissociação de células pré-aquecido (37 ° c) (tabela de materiais) por poço e incubar a 37 ° c durante 3 min para dissociar as células.
   2. Após a incubação por 3 min, as células tornaram-se semiflutuantes; Adicionar 3 mL de pré-aquecido (37 ° c) DMEM-F12 médio por poço, e células de pipeta para cima e para baixo para dissociar as pelotas de célula em células individuais.
   3. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 250 x g durante 3 min. Aspire o sobrenadante, resuspenda as células com o volume adequado de meio Insc pré-aquecido (37 ° c) de acordo com o número de células.
   4. Conte as células usando o método de exclusão azul de Tripan. Placa 5 x 10³ células por 12 mm de lamínula de vidro em 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% co₂.
4. Diferenciar iNSCs em neurônios dopaminérgicos.
   1. Comece a diferenciação 24 h após re-plating as pilhas em COVERSLIP PDL/laminin-revestidos. Aspirar meio de cultura, lavar as células uma vez com D-PBS e, em seguida, adicionar 600 μL de estágio de diferenciação pré-aquecido I médio por poço em placas de 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% CO₂.
   2. Mude o meio todos os dias do dia 1 para o dia 10 durante o primeiro estágio de diferenciação.
   3. No dia 10, aspirar o meio de cultura, e lavar as células uma vez com D-PBS. Adicionar 600 μL de meio de diferenciação pré-aquecido (37 ° c) estágio II por poço em placas de 24 poços e incubar a 37 ° c, 5% CO₂.
   4. Mude o meio todos os dias do dia 11 para o dia 25 durante a segunda fase de diferenciação. As células diferenciadas podem ser fixadas por paraformaldeído em diferentes pontos temporais para análise.
   5. Para a coloração imunofluorescente, lave as células com D-PBS três vezes suavemente nos pontos de tempo escolhidos dentro do dia de diferenciação 11 a 25.
   6. Pipete 300 μL de surfactante não iônico (tabela de materiais) em 100 ml de PBS para fazer um surfactante não iônico de 0,3% em PBS.
      Cuidado: o surfactante nonionic é tóxico pelo contato e pela inalação da pele.
   7. Fixar as células com 4% paraformaldeído por 10 min em RT. Em seguida, lave com 0,3% em PBS três vezes.
      Cuidado: o paraformaldeído é tóxico por contato com a pele e inalação.
   8. Bloqueie as células em 3% de soro de burro por 2 h em RT.
   9. Diluir o anticorpo primário em 1% de soro de burro em uma concentração adequada e triturar suavemente para misturar. Adicionar 300 μL da solução de anticorpos primários a cada poço da placa de 24 poços. Incubar as células a 4 ° c durante a noite. Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes.
   10. Diluir o anticorpo secundário em 1% de soro de burro em uma concentração apropriada e triturar suavemente para misturar. Adicionar 300 μL da solução de anticorpos secundários a cada poço da placa de 24 poços. Incubar as células em RT por 2 h, protegida da luz.
   11. Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes. Diluir 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) com PBS com diluição 1:500. Incubar as células em cada poço da placa de 24 poços com 300 μL de DAPI diluída durante 15 min em RT, protegida da luz. Lave as células com 0,3% de surfactante não iônico em PBS três vezes.
   12. Retire suavemente as coberturas dos poços de placas com fórceps. Seque no escuro durante a noite no RT. Monte um microscópio de fluorescência.

4. estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned

1. Para gerar modelos de mouse PD para transplante de células, use camundongos adultos machos SCID-bege pesando 20-25 g para injeção de 6 OHDA.
2. Preparação de medicamentos para cirurgia
   1. Prepare uma solução de ácido ascórbico 0,2% dissolvendo 0,2 g de ácido ascórbico em 100 mL de soro fisiológico esterilizado (0,9%) e armazene em-80 ° c até o uso. No dia da cirurgia, diluir 0,2% de solução de ácido ascórbico em 10 vezes para obter uma solução de ácido ascórbico 0, 2%.
      Nota: o ácido ascórbico é adicionado para evitar a oxidação de 6 OHDA para uma forma inativa.
   2. Para preparar uma solução de 6 OHDA, pesar a quantidade apropriada de 6 OHDA em um tubo esterilizado de 1 mL e, em seguida, adicionar algum volume de ácido ascórbico de 0, 2% para fazer uma solução de 5 μg/μL 6-OHDA. Vortex a mistura até que seja dissolvido. Coloque o 6-OHDA no gelo até o uso.
      Nota: 6 OHDA é a temperatura e sensível à luz. Tenha cuidado para proteger a solução da luz e mantê-lo no gelo antes de usar.
3. Prepare o equipamento cirúrgico esterilizado por autoclavagem antes da cirurgia. Limpe todos os equipamentos e áreas de superfície com etanol ao configurar o quadro estereotódico. Configurar uma gaiola de recuperação do mouse uma lâmpada de aquecimento.
4. Conduza a cirurgia para estabelecer modelos unilaterais do rato de 6 OHDA-lesioned.
   1. Pesar cada rato, gravar o peso e calcular a quantidade de droga que precisa ser administrado. Cada rato recebe 0,5 mg/kg de atropina 20 min antes das operações. Anestesie o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina.
   2. Administrar 0,5 mg/kg de atropina por injecção intraperitoneal.
   3. Anestesie o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injecção intraperitoneal 20 min após a administração de atropina.
   4. Coloque o mouse em uma câmara fechada. Após 3-5 min, o mouse será profundamente anestesiado sem resposta à pinça da perna traseira.
      Nota: espera-se que o rato que recebeu anestesia experimentaria um período de excitação.
   5. Raspar a cabeça do mouse e aplique pomada olho eritromicina nos olhos do mouse para a proteção do desenvolvimento de úlceras corneanas.
   6. Coloque o mouse sobre o aparelho estereotódico. Fixe o rato com as barras do incisivo firstly. Insira os copos de ouvido corretamente para fazer a cabeça do mouse em uma posição plana e segura.
   7. Esterilizar a cabeça do rato com iodo povidona e álcool isopropílico. Corte uma incisão sagital (~ 1,5 cm) na pele da cabeça com uma lâmina de bisturi, e expor o crânio. Ajuste a barra do incisivo e as barras da orelha para reduzir a diferença da altura entre o Bregma e o lambda a menos de 0,1 milímetros.
      Nota: o rato Bregma está localizado na interseção de suturas coronal e sagital, e lambda está na interseção de lambdóide e suturas sagital.
   8. Mova lentamente e abaixe a ponta da agulha para Bregma e trate o Bregma como um ponto zero. Mova a ponta para uma posição com coordenadas de A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm em relação à Bregma. Retrair a ponta e marcar o ponto. Burr um pequeno buraco no crânio.
   9. Extraia 2 μL de solução de 5 μg/μL 6-OHDA para a microseringa (tabela de materiais). Retorne a agulha ao ponto marcado, e insira a agulha em D/V-3,2 mm.
   10. Injete 2 μL de solução de 5 μg/μL 6-OHDA (total de 10 μg) a uma taxa de 1 μL/min. Após a injeção de 6 OHDA estiver concluída, deixe a agulha no lugar por mais 5 min. Em seguida, retrair a agulha de injecção lentamente.
   11. Feche a incisão com suturas e aplique a pomada do olho de eritromicina nos olhos do rato. Entregar 0,5 mL de soro fisiológico por via subcutânea para evitar a desidratação, e aplicar uma pomada antibiótica diretamente sobre a pele suturada.
   12. Retire o rato do aparelho estereotódico e coloque-o na gaiola de recuperação. Coloque o mouse para trás e permitir o acesso a alimentos e água até que recupere a consciência. Trate o rato com analgésico na água potável diária pós-cirurgia por 2-3 dias, e uma dosagem recomendada de ibuprofeno é 0, 3 mg/g de peso corporal por dia.
   13. Inspecione o rato diariamente após a cirurgia.

5. avaliação comportamental após lesioning unilateral de 6 OHDA

1. De duas a três semanas após a cirurgia, realize a avaliação comportamental para estimar os sintomas de DP. Pesar cada rato, registar o seu peso e calcular a quantidade de droga que deve ser administrada (0,5 mg/kg de apomorfina antes da avaliação).
2. Administrar 0,5 mg/kg de apomorfina por injecção subcutânea antes da avaliação e colocar o rato num cilindro de vidro.
3. Após um período de 5 min de habituação, contar o número de rotações contralateral e ipsilateral em relação ao lado da lesão por minuto e registrar sua atividade com uma câmera de vídeo.
4. Camundongos com rotação contralateral menos rotações ipsilaterais > 7 rpm/min são considerados lesionados com sucesso e selecionados como candidatos para experimentos de transplante celular. Retorne os ratos para as gaiolas de Habitação após um descanso de 30 min.
   Nota: se o rato foi lesados com sucesso, o rato injetado 6 OHDA mostrará um viés maior em girar para o lado contralateral desde que o agonista da da ativa o estriado desnervado supersensitive do lado lesados predominantly.
5. Realizar a avaliação comportamental uma semana antes e 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas após o transplante de células.

6. transplante celular de precursores DA DA

1. Prepare a suspensão celular para transplante. Para a Engraftment celular, suspender 2 x 10⁵ precursores da misturado por precursores D10 e D13 da na proporção de 1:7 em 4 μL de 5 g L^-1 de glicose em solução salina equilibrada (tabela de materiais) de tampão de transplante.
2. Realize cirurgia de transplante celular seguindo os procedimentos descritos na seção 4,4, exceto que 6 OHDA é substituída pela suspensão ou tampão DA célula precursor DA DA.
3. Realizar a avaliação comportamental 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas após o transplante celular de precursores da DA seguindo os procedimentos descritos na seção 5. Conte o número de rotações contralaterais induzidas pela apomorfina em relação ao lado da lesão por minuto e registre sua atividade com uma câmera de vídeo.
   Nota: após o transplante, uma taxa reduzida de rotações contralaterais sugere uma função motora melhorada.
4. Em 4, 8, 12, e 16 semanas após a transplantação da pilha, perfuse o rato a anestesia profunda com o paraformaldeído de 4% até que o corpo do rato se torne duro e o fígado do rato se torne pálido.
5. Separe o cérebro do mouse suavemente e colocar o cérebro em 4% paraformaldeído a 4 ° c durante a noite.
6. No segundo dia, coloque o cérebro em 30% de sacarose para a desidratação até que o cérebro afunda para o fundo.
7. Corte os cérebros a 40 μm de espessura usando um micrótomo congelante.
8. Realize imunomarcação conforme descrito anteriormente nas etapas 3.4.5-3.4.12.

Resultados

Aqui, nós relatamos um protocolo que cubra estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para tratar modelos do paládio. Primeiramente, os PBMNCs foram isolados e expandidos, e reprogramados em iNSCs pela infecção de SeV. Uma representação esquemática dos procedimentos com expansão de PBMNC e indução de iNSC é mostrada na Figura 1. No dia-14, os PBMNCs foram isolados usando um meio de gradiente de densidade (tabela de materiais). Antes da centrifugação, o sangue diluído...

Discussão

Aqui nós apresentamos um protocolo que cobria estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para modelos do paládio. Os aspectos críticos deste protocolo incluem: (1) isolação e expansão de pbmncs e reprogramação de pbmncs em inscs pela infecção de Sev, (2) diferenciação de inscs aos neurônios de da, (3) estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned e comportamento avaliação e (4) transplante celular de precursores DA DA e avaliação comportamental.

Neste protocolo, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo cônico de 15 ml	Corning	430052
1-Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145	Tóxico para inalação e contato com a pele
Placa de 24 poços	Corning	3337
Tubo cônico de 50 ml	Corning	430828
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381
Placa de 6 poços	Corning	3516
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Reagente de dissociação celular
Apomorfina	Sigma-Aldrich	A4393
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A92902	Tóxico com contato com a pele
Suplemento B27	Invitrogen	17504044
BDNF	Peprotech	450-02	Fator neurotrófico derivado do cérebro
Tubos de coleta de sangue contendo heparina sódica	BD	367871
BSA	yisheng	36106es60	Soro bovino fetal
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Dibutiriladenosina monofosfato cíclico
CellBanker 2	ZENOAQ	100ml	Usado como meio de congelamento para PBMNCs
Concentrado lipídico quimicamente definido	Invitrogen	11905031
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
Coverslip	Fisher	25 * 25-2
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417-10mg
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Soro de burro	Jackson	017-000-121
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Eritropoietina Humana
FGF8b	Peprotech	100-25
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	P=1.077, gradiente de densidade médio
GDNF	Peprotech	450-10	Fator neurotrófico derivado da glia
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 &vezes; Solução conservada em estoque da glutamina
Ham's-F12	Gibco	11765-054
HBSS	Invitrogen	14175079	Solução de sal
equilibrada Fator inibidor da leucemia humana	Millpore	LIF1010
SCF recombinante humano	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Insulina-como o crescimento humano fator
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Interleucina humana 3
IMDM	Gibco	215056-023	Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin	Roche
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Suplemento de insulina-transferrina-selênio-X
Substituição do soro	knockout Gibco	10828028	Soro livre meio basal
Laminin	Roche
Microsseringa	Hamilton	7653-01
N2 suplemento	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Aminoácido não essencial
Neurobasal	Gibco	10888	Meio básico
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	Poli-D-lisina
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Operação Gênica	04-0010-10mg	Armazenar da luz a -20?
Vírus Sendai	Life Technologies	MAN0009378
sacarose	baiaoshengke
TGFβ?	Peprotech	100-36E	Fator de crescimento transformador   β?
Transferrina	R& D Systems	2914-HT-100G
Triton X 100	baiaoshengke		Surfactante não iônico
Trypan blue	Gibco	T10282
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126