Summary
Vi introduserer en reproduserbar og stabil optisk opptaks metode for hjerne skiver ved hjelp av spennings følsomt fargestoff. Artikkelen beskriver spennings følsomme fargestoff flekker og opptak av optiske signaler ved hjelp av konvensjonelle hippocampus Slice forberedelser.
Abstract
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (VSD) tenkelig av hjerne skive forberedelser er en nyttig verktøyet å vurdere det funksjonell connectivity inne neural kretsløpene. På grunn av brøk endring i lyssignalet, har det vært vanskelig å bruke denne metoden som en kvantitativ analysen. Denne artikkelen beskriver spesielle optikk og Slice håndtering systemer, som gjør denne teknikken stabil og pålitelig. Denne artikkelen demonstrerer stykket håndtering, farging, og innspillingen av VSD-beiset hippocampus skiver i detalj. Systemet opprettholder fysiologiske forhold i lang tid, med gode flekker, og hindrer mekaniske bevegelser av stykket under opptakene. Videre gjør det farging av skiver med en liten mengde av fargestoff. Optikk oppnå høy numerisk blenderåpning ved lav forstørrelse, noe som gjør opptak av VSD signal ved maksimal bildefrekvens på 10 kHz, med 100 piksel x 100-piksel romlig oppløsning. På grunn av høy bildefrekvens og romlig oppløsning, tillater denne teknikken anvendelse av post-innspillingen filtre som gir tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for å vurdere endringer i nevrale kretser.
Introduction
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (vsd) tenkelig av bulk-flekkete hjerne skive forberedelser har bli en nyttig kvantitative verktøyet å vurdere dynamikken i neural kretser1,2,3,4 . Etter analysen av endringene i optiske egenskaper på grunn av membran eksitasjon5,6,7, VSD Imaging ble først beskrevet i begynnelsen av 1970-tallet av Cohen ogandre 6,8, 9.; Det er en egnet metode for å overvåke hjernens funksjoner i sanntid som fargestoff direkte sonder membranen potensielle endringer (dvs. den primære signal av neurons).
De tidligste VSDs hadde den ønskelige egenskaper for å forstå hjernens system, slik som en rask tid-konstant å følge den raske Kinetics av neuronal membran potensielle hendelser, og linearitet med endring i membran potensial9, 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15. ligner på andre Imaging eksperimenter, krever denne teknikken et bredt spekter av spesifikke stemming, slik som kameraer, optikk, programvare, og skive fysiologi, for å oppnå de ønskede resultater. På grunn av disse tekniske fallgruvene, de forventede fordelene ved første innsats ikke nødvendigvis materialisere for de fleste laboratorier som ikke er spesialister på denne teknikken.
Den primal årsaken til den tekniske problemer var lav følsomhet i VSD mot membranen potensielle endringen når den brukes til bulk farging av Slice forberedelser. Størrelsen på det optiske signalet (dvs. brøk endringen i fluorescens) er vanligvis 10-4-10-3 av kontrollen (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskala av membran potensiell endring i en Nevron er ca millisekunder til noen hundrevis av millisekunder. For å måle endringer i membranen potensialet i Nevron, kameraet brukes for innspillingen skal kunne erverve bilder med høy hastighet (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomheten til VSD og hastigheten som trengs for å følge det nevrale signalet krever en stor mengde lys som skal samles på kameraet i høy hastighet, med et høyt signal-til-støy-forhold (S/N)2,16.
Optikk av opptaks systemet er også et kritisk element for å sikre innsamling av tilstrekkelig lys og for å forbedre S/N. Forstørrelsen oppnås ved optikk er ofte overdrevent lav, for eksempel 1X til 10X, for å visualisere en lokal funksjonell nevrale krets. For eksempel, for å visualisere dynamikken i hippocampus krets, en forstørrelse på ca 5 ville være egnet. Slike lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor vil avansert optikk være gunstig for slike opptak.
I tillegg er stykket fysiologi også viktig. Siden Imaging analyse krever skiver for å være intakt, forsiktig skive håndtering er nødvendig17. Videre er tiltak tatt for å opprettholde skive levedyktighet for en lengre tid er viktig18.
Denne artikkelen beskriver protokollen for utarbeidelse av skiver, VSD farging og målinger. Artikkelen skisserer også forbedringer til VSDs, tenkelig enhet og optikk, og andre ytterligere forbedringer til det eksperimentelle systemet som har aktivert denne metoden skal brukes som en grei, kraftig og kvantitativ analysen for å visualisere modifikasjon av hjernensfunksjoner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også bli mye brukt for langsiktige potensiering i CA1 området av hippocampus skiver1. Videre er denne teknikken også nyttig i optisk innspilling av membran potensialer i en enkelt nerve celle26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimenter ble utført i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og use Committee of Tokushima Bunri University. Følgende protokoll for klargjøring av sektor er nesten en standard prosedyre27 , men endringene har vært protokollene for farging og innspilling med VSD.
1. forberedelse før dagen av eksperimentet
- Klargjør lager A (tabell 1), lager B (tabell 2) og lager C (tabell 3) løsninger og oppbevares i kjøleskap.
- Forbered 1 L av kunstig spinalvæske (ACSF) (Tabell 4, se trinn 3) og oppbevar den i kjøleskapet.
- Forbered 1 L av modifisert ACSF (tabell 5) og oppbevar den i kjøleskapet.
- Dispensere 500 μL alikvoter av Foster storfe serum (FBS) i 2 mL hetteglass og oppbevares i en fryser.
- Oppløse 4% av agar pulver i ACSF (ca. 120 mL) i en mikrobølgeovn og hell den i en 90 mm disponibel Petri parabolen. Agar platen bør være nedkjølt før videre bruk.
- Plasser følgende elementer i en fryser på dagen før eksperimentet: et kirurgisk brett, en slicer container og en aluminium kjøle blokk (120 x 120 x 20 mm3).
- Kontroller at det er tilstrekkelige plexiglass ringer med membran filtre for Slice håndtering system17,28 (se trinn 6,12).
- Oppløse 2% av agar pulver i 50 mL av 3 M KCl i en mikrobølgeovn. Ta rundt 85 μL av den varme agar-KCl dissolvent i 200 μL-spisser ved hjelp av en micropipette for jordings elektroden. Løsne spissen inn i den fortsatt varme agar 3 M KCl gel. Gjenta trinnet for å fylle ca 20-40 tips med 2% agar.
2. utarbeidelse av VSD (di-4-ANEPPS) lagerløsning
- Forbered 1 mL 10% polyethoxylated Castor olje løsning med ultra-rent vann.
- Tilsett 1 mL etanol i et hetteglass med di-4-ANEPPS (5 mg hetteglass), Vortex og sonikere i 10 min. Løsningen vil bli en dyp rød farge med mulige små rester av di-4-ANEPPS krystaller.
Merk: Etanol brukes i dette trinnet skal være fersk åpnet. - Overfør løsningen til en 2 mL microtube med en O-ring. Snurr ned løsningen og tilsett 500 μL av 10% polyethoxylated Castor olje løsning.
Merk: Fargestoffet er svært lipofile. DMSO og poloksamer kan også brukes til å oppløse di-4-ANEPPS men i form av det optiske signalet ved endring i membran potensial, fant vi at bruk av etanol-polyethoxylated Castor olje gir et bedre signal til støyforhold. Dette kan være relatert til overføringshastigheten av løsemiddel til cellemembranen. - Vortex og sonikere til fargestoffet er helt oppløst.
- Unngå eksponering for lys og oppbevar den i et kjøleskap. Må ikke oppbevares i fryseren. Aksjen kan vare i noen måneder.
Merk: På dagen for eksperimentet følger du trinnene 3-9.
3. daglig tilberedning av ACSF (1 L) (tabell 4)
- Veie NaCl, NaHCO3, og glukose i en kolbe.
- Tilsett 950 mL destillert vann til flasken og begynn bobler med 95% O2/5% co2 gass.
- Tilsett 2,5 mL lager en løsning på flasken og ruge i ca 10 min ved romtemperatur.
- Tilsett 2,5 mL lager C løsning på flasken.
- Legg destillert vann for å gjøre løsningen til 1 L.
4. daglig utarbeidelse av farging VSD Ssolution
- Sonikere en 500 μL hetteglass med FBS og VSD lagerløsning (trinn 2) i en ultra-sonicator i 5 min.
- Tilsett 500 μL av ferskt tilberedte ACSF i hetteglasset med FBS.
- Tilsett 20 (i tilfelle mus) eller 40 (i tilfelle rotter) μL av VSD lagerløsning på hetteglasset.
- Ultra-sonikere og Vortex hetteglasset til løsningen blir blek oransje.
5. forberedelse til kirurgi
- Ta 100 mL kjølt ACSF separat i en 300 mL rustfritt stål beholder, et 300 mL beger, og en plastbeholder, og legg dem i en fryser. Hell 150 mL avkjølt modifisert ACSF (tabell 2) i et annet beger og legg den i fryseren. Vent til løsningene er kjølt; tiden det tar, skal måles og fastslås på forhånd.
- Fold å bryte en barberhøvel blad (karbonstål, industriell klasse 0,13 mm tykk, blad på begge sider) i halvparten for sliceren.
Merk: Den andre halvdelen kan brukes til disseksjon med en skikkelig blad holder. - Forbered en blokk fra ACSF 4% agar plate med en justering jig (figur 1).
- Forbered en fuktig inkubasjons kammer (et grensesnitt type kammer, en modifisert 1,2 L tett forseglet boks med en silikon pakking) for å holde hjernen skiver fysiologisk levende (figur 2); Tilsett ACSF i en liten beholder og med 95% O2/5% co2 gass, og fyll en 90 mm x 20 mm Petri rett med ACSF på toppen.
Merk: En mindre Petri parabol (60 mm x 20 mm) bør plasseres i midten av 90 mm parabolen å støtte et filter papir på parabolen. - Sett esken på en oppvarmings enhet og vent i 20 minutter for å varme den opp til 28 ° c.
- Legg knust is i beholderen av sliceren. Plasser følgende instrumenter i et rustfritt stål moms (liten) på is: skalpell, blad holder, ring pinsett, agar blokk, og en fase av slicer. Hold frosne ACSF og modifisert ACSF på is og boble med 95% O2/5% co2 gass (aka. carbogen).
- Plasser følgende instrumenter i en moms (Large): saks (stor, liten), pinsett, en slikkepott, en skje, og Diagonal tang.
6. kirurgi (mus)
- Bedøve musen ved hjelp av isoflurane i en avtrekks hette. Vurdere nivået av anestesi ved å sjekke pedalen refleks av dyret på tå knipe.
- Halshugge musen og senk hodet i iskaldt ACSF i et kirurgisk brett i rustfritt stål.
- Pakk hjernen innen 1 min og plasser den i et beger med kjølt ACSF i 5 min.
- Ta hjernen ut av begeret og bruk en skalpell til å trimme hjerne blokken (figur 3a).
- Plasser hjernen blokken på en 4% agar blokk (trinn 5,3, figur 3b). Begge halvkuler kan monteres på en agar blokk. Tørk av overflødig ACSF fra blokken med et filter papir.
- Påfør tynt klebemiddel (super lim) til slicer-tabellen. Plasser agar blokken på den og tørk av overflødig klebemiddel ved hjelp av et filter papir.
- Påfør forsiktig en liten mengde iskald ACSF (~ 5 mL) ved hjelp av en pipette fra toppen av hjernen-agar blokk. Dette vil bidra til å stivne overflødig super lim og hindre limet fra å dekke hjernen og forstyrre kutting.
- Fest slicer-tabellen til slicer-skuffen (figur 3c) og hell den endrede ACSF.
- Sett sliceren til en langsom hastighet, med kniv frekvensen på maksimum.
- Sett skive tykkelsen til 350-400 μm og start kutting (figur 3c). Plasser skivene på hjørnet av skive skuffen i en sekvens, slik at dybden av skiver lett kan skilles. Vanligvis tre til fem skiver kan fås fra en halvkule.
- Skjær av hjernestammen delen ved hjelp av en 30 G nål (figur 3D).
Merk: Mikrokirurgi på hjernen skive som et kutt mellom CA3-CA1 grensen bør gjøres på dette stadiet under et kikkert mikroskop, om nødvendig. - Ved hjelp av en liten spiss pensel, plasser stykket på midten av membran filteret (0,45 μm porer, PTFE-membran, 13 mm diameter) holdt med plexiglass ring17 (15 mm ytre diameter, 11 mm indre diameter, 1 mm tykkelse, figur 3e). Plasser ringen i fuktig gjenvinnings kammeret (figur 2) og fest dekselet for å holde det indre trykket høyt.
Merk: Skivene vil holde seg til membranen innen 30 min og kan håndteres med ringene i de påfølgende trinnene i innspillingen kammeret. Det er ikke nødvendig å bruke vekter eller andre tiltak for å holde stykket på plass. - Juster retningen og plasseringen av stykket i ringen for å sikre at det er godt sentrert og har en konsistent retning (se trinn 9,3).
- La prøven ved 28 ° c i 30 min, og deretter ved romtemperatur i minst 10 til 30 min for gjenvinning av skiver.
Merk: Skivene kan nå beholde god fysiologisk tilstand minst for 15 t.
7. farging og skylling av skiver (mus)
- Påfør forsiktig 100-110 μL av farge oppløsningen (trinn 4) på hver skive på ringen ved hjelp av en micropipette. Åtte til ni skiver kan være beiset med en farge løsning utarbeidet i trinn 4. La skivene i 20 min for farging.
- Forbered 50-100 mL ACSF i en beholder og sett ringen med skiver av prøven i den for å skylle farge oppløsningen.
- Oppbevar det skylt stykket til et annet inkubasjons kammer. Vent mer enn 1 time for å bli frisk før eksperimentet.
Merk: Inkubasjons kammeret kan løsnes fra gassen og flyttes til innspillingsstedet i en tett lukket tilstand. Stykket kan være i live i minst 20 min uten gassforsyning. Dette er nyttig i tilfelle du trenger å flytte stykket til et annet sted for opptak.
8. daglig utarbeidelse av eksperimentelle apparater
- Slå på forsterkeren, datamaskinen og kamera systemet, og kontroller at programvaren kjører.
- Plasser ACSF i en 50 mL slange og boble med carbogen.
- Bruk en peristaltisk pumpe for å sirkulere ACSF. Juster strømningshastigheten til ca. 1 mL/min.
- Juster høyden på inntaks pipette slik at væskenivået inne i eksperiment kammeret alltid er konstant.
Merk: Nivået på løsningen er viktig å oppnå et stabilt opptak, derfor bør justeringen gjøres ved hjelp av en micromanipulator. - Installer jordelektroden består av gul chip fylt med 3 M KCl agar (2%) (trinn 1,8) til en holder med en AG-AgCl ledning med en liten mengde av 3 M KCl-oppløsning.
- Fyll en liten mengde ACSF (omtrent to tredjedel av volumet) i glass elektroden (1 mm ytre diameter, 0,78 mm indre diameter trukket med en micropipette avtrekker) ved hjelp av en konisk tynn tubed gul tupp og legg den i elektrodeholderen.
- Fest holderen til stangen som er montert i manipulator. Sørg for å bruke en forsterker som elektrode motstanden er ca. 1 MΩ.
Merk: Lang skaft bred åpning (4-8 μm åpning) patch type elektrode bør være bra for felt opptak og som et stimulerende elektrode.
9. starte en opptaks sesjon
- Ta en skive forberedelse fra fuktig kammer med tang.
- Plasser stykket raskt på et eksperimentelt kammer under mikroskopet (Figur 4).
- Skyv kanten av ringen godt inn i silikon O-ring. Vær forsiktig så du ikke bryte membranen eller bunnen av eksperimentet kammeret.
Merk: Retningen av stykket bør tas i betraktning med hensyn til retning av stimulerende og opptak elektroder i synsfeltet. Den sunne skive bør holde seg til membranen filteret så det er ikke nødvendig å bruke andre enheter for å fikse skiver som vekter og nylon maskene. - Plasser spissen på den stimulerende elektroden og den potensielle Innspillings elektroden på stykket under mikroskopet med overført lys.
- Bruk elektrofysiologisk opptakssystem til å kontrollere responsen. Bekreft den vanlige (ikke-farget) elektrofysiologisk innspillingen med gitt konfigurasjon.
Merk: Innspillingen elektroden kan utelates, men er nyttig å sjekke fysiologi av stykket. - Juster den eksitasjon lysstyrken til ca. 70-80% av maksimal kapasitet ved kameraet som tilsvarer 13-15 mW/cm2 ved prøven ved prøvetaking ved 10 kHz med 5x objektiv objektiv med vann nedsenking og 1X plan Apo tube linse. Den eksitasjon lys bølgelengden er 530 NM, og utslipps filteret må være > 590 NM.
Merk: Bruk en lukker for å minimere mengden av eksitasjon lys. Kontinuerlig lys eksponering kan svekkes skive fysiologi. Den mulige skadelige effekten av lyset avhenger av intensiteten og varigheten av lyset. Bruk elektrofysiologisk opptak for å bedømme effekten av lys. I tilfelle av styrken av 13-15 mW/cm2, om 1 s eksponering bør være den øvre grensen av toleranse. - Juster fokuset med anskaffelses systemet ved hjelp av lysrør kilden fordi fokuset kan være forskjellig avhengig av bølgelengden og starte oppkjøpet.
- Undersøk dataene i et bilde anskaffelses program.
Merk: Vi brukte originale microprogramming pakke av numerisk analyseprogramvare for detaljert analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 viser den representative optiske signal ved elektrisk stimulering av Schaffer sikkerhet i området CA1 av en mus hippocampus skive. De påfølgende bildene i figur 5a viser det optiske signalet før eventuelle romlige og timelige filtre ble brukt, mens figur 5B viser de samme dataene etter å ha brukt et 5 x 5 x 5 kubikk filter (en Gaussian kernel convolution, 5 x 5 romlig-og 5 til Temporal-dimensjon) to ganger. På grunn av den høye bildefrekvens (0,1 MS/Frame) og høy romlig oppløsning (100 piksler x 100 piksler), gjorde anvendelsen av filteret ikke endre signalet, men filtrert ut støyen, som også kan observeres i den tiden kurset registrert i piksler i en enkelt rettssak ( Figur 5C, ingen filter; Figur 5D, med filter; og figur 5e, lagt).
Figur 6 sammenligner vanlig respons i areal CA1 av en hippocampus skive mellom mus (figur 6a) og rotte (figur 6b). Som det fremgår av figuren, hyperpolarizing respons på grunn av hemmende innganger er tydelig i rotte hippocampus skive ved påføring av samme stimulans til Schaffer sikkerhet nær CA1/CA3 grensen. Den lille hyperpolarizing respons er observert i den Fjern siden av CA1 etter 24 MS i musen hippocampus skive, men mer massive hyperpolarizing respons overtok depolariserende respons i rotte hippocampus skive. VSD-avbildning kan tydelig vise forskjellen mellom mus-og rotte hippocampus skiver.
Figur 1 : En illustrasjon av agar blokken brukes til å montere hjernevev for kutting og en jig å gjøre blokken. (A) en skjematisk illustrasjon av hjernen blokken og 4% agar blokk (B). (C, D) Fotografi av en justerbar jig laget av en plexiglass plate (5 mm tykk hver) for å gjøre agar blokk. Ved utarbeidelse av agar blokken, den øvre og nedre platene skal stables som vist i D. (E) ved å sette inn et blad i den lange tynne spor (1) og (2), den trekantede delen er kuttet ut, sporet (3) brukes til å trimme hele dybden av blokken. (4) fjerning av den øvre platen gjør det mulig å skjære ut av de ikke-nødvendige delene. Bruk 1 og 2 spor, gjør bare 5 mm dype kutt, slik at resultatet av blokken er som vist i (A) og (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : En illustrasjon av grensesnittet type incubating kammer brukes til å opprettholde skive fysiologi. (A) oversikt over systemet. (B) interiør detaljer. (C) illustrasjon av gjenvinnings kammeret. Prøven skal plasseres på et filter papir plassert på en ACSF-fylt 90 mm og 60 mm Petri parabolen. Sistnevnte parabolen er å støtte filteret papir. Rettene og ACSF bobler beholder holdes på plass med en plexiglass plate. Filteret papiret bør ikke berøre veggen av luften stramt boksen eller beholderen. Luften tilføres gjennom en boblende flaske som inkorporerer fuktet gasser i kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hippocampus Slice forberedelser fra en mus hjernen. (A) den isolerte mus hjernen bør kuttes først på den stiplede linjen (A), deretter (b). Til slutt bør kuttet gjøres langs linjen (c). Snittet skal være vinkelrett på bunnen. (B) hjerne blokken skal monteres på en agar blokk. (C) agar-blokken bør plasseres på sliceren. (D) resulterende skive. Overflødig vev bør kuttes på den stiplede linjen. (E) stykket skal plasseres i midten av membran filteret med en plexiglass holder (ytre diameter 15 mm, innvendig diameter 11 mm, PTFE-filteret på 13 mm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Opptakssystem for optiske signaler fra Slice forberedelser. (A) et fotografi av mikroskopet som brukes til å avbilde stykkene i det nåværende manuskriptet. Den optikk består av en objektiv linse (5x NA 0.60), et speil boks for dichroic filter (580 NM), og en projeksjon (tube) linse (PLAN APO x 1.0). Et høyhastighetskamera er festet på toppen av projeksjons linsen gjennom en c-mount. Det er en annen vanlig USB-kamera for observasjon. Eksitasjon lys er innført ved hjelp av fiberoptikk. (B) fotografi av linsene som er kompatible med speilet boksen. (C) skjematisk diagram av opptaks systemet. Bilde systemet og elektrofysiologisk opptakssystem styres av en PC. LED-belysning system med en foto-diode feedback kontrollsystemet ble brukt som lyskilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representative optisk signal i området CA1 av en mus hippocampus skive i en enkelt rettssak. (A) de påfølgende bildene viser utbredelsen av neuronal signalet ervervet på bildefrekvensen på 0,1 MS/Frame langs Schaffer sikkerhet veien før du bruker noen romlige og timelige filtre (hver 0,2 ms). Eksitasjon var 530 NM og utslipp ble > 590 NM. (B) de samme dataene etter en anvendelse av en tredimensjonal Gaussian kernel av 5 x 5 x 5 to ganger. (C, D) Spor av optiske signaler i representative piksler [hver to piksler (36 μm) langs en linje i midten av CA1 vises i kvadratet i A, * betegner pikselen i stratum pyramidale] fra dataene som vises i A og B. (E) det lagt signal fra optiske signalene i C og D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Sammenligning av optisk signal mellom mus og rotte hippocampus skiver. Representanten påfølgende bilder på elektrisk stimulering av Schaffer sikkerhet sti nær CA3/CA1 grensen av en mus (a) og rotte (B) hippocampus skive. Video 1 viser musen hippocampus skive og video 2 viser rotta hippocampus skive. Tiden-løpet av det optiske signalet i midten av CA1 på stratum pyramidale (St. Pyr.) og stratum radiatum (St. rad.) vises på høyre side av figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Siste mM | Vekt | |
| NaH2PO4 • 2h2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4• 7H2O | 2 mM med | 9,86 g |
| KCl | 2,5 mM | 3,73 g |
| Tilsett H2O for å gjøre 50 ml |
Tabell 1: lager A.
| Siste mM | Vekt | |
| MgSO4• 7H2O | 2 mM med | 12,32 g |
| Tilsett H2O for å gjøre 50 ml |
Tabell 2: lager B.
| Siste mM | Vekt | |
| CaCl2• 2h2O | 2 mM med | 5,88 g |
| Tilsett H2O for å gjøre 50 ml |
Tabell 3: Stock C.
| Endelig (mM) | Vekt | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| Glukose | 10 mM av | 1,8 g |
| Lager A | 2,5 mL | |
| Tilsett ca 950 mL av H2O og Bubble med blandet gass (95% O2/5% co2) (10 min) | ||
| Stock C (CaCl2) | 2 mM med | 2,5 mL |
| Tilsett H2O for å gjøre 1 000 ml | ||
Tabell 4: daglig utarbeidelse av ACSF.
| Endelig (mM) | Vekt | |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| Sukrose | 205,35 mM | 70,29 g |
| Glukose | 10 mM av | 1,8 g |
| Lager A | 2,5 mL | |
| Stock B | 2,0 mL | |
| Tilsett ca 900 mL av H2O og Bubble med blandet gass (95% O2/5% co2) (10 min) | ||
| Stock C | 0,4 mM | 0,5 mL |
| Tilsett H2O for å gjøre 1 000 ml | ||
Tabell 5: modifisert ACSF (skjære løsning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stykket fysiologi er avgjørende for å samle riktig signal. Bruken av ring membran filtersystemet i denne protokollen sikrer at stykket forblir sunt og un-forvrengt gjennom prosedyren2,16,17. Andre systemer kan brukes til å beholde skive fysiologi under innspillingen, men stykket bør ikke bli deformert til enhver tid som tenkelig behov hver eneste del av stykket for å være sunn. Det ring-membran filtersystemet er også bedre for farging, da dette hjelper oss å minimere volumet av farging løsningen som kreves. Det er også viktig å kontrollere intensiteten av eksitasjon lys, som det skal være lav i forhold til tid-brøk. Den kontinuerlige belysningen kan skade prøven; Derfor er riktig bruk av lukkeren nødvendig.
Toksisitet av VSD er ofte diskutert29, men det er et resultat av ikke-lineær multiplikasjon av fargestoff konsentrasjon, eksitasjon lys intensitet og varighet av eksponering for lyset. Farge prosedyren som vises i denne protokollen, forårsaket ikke målbare endringer i de fysiologiske parametrene til stykket, som for eksempel input-output-relasjonene for felt potensielle innspillinger og de på den langsiktige potensiering (LTP), paret-puls tilrettelegging (PPF). Forringelse av stykket fysiologi er betydelig spesielt under kontinuerlig belysning16, men det kan styres ved å overvåke feltet potensial. Ved å bruke disse forholdsreglene kan vi ta opp LTP med kontinuerlig optisk innspilling ved hjelp av VSD i mer enn 12 timer24, som kan sammenlignes med de best conditioned in vitro-eksperimentene.
Under innspillingen, luften bord kunne være nyttig, bortsett fra isolasjon fra annet anordninger burde få tillatelse med hensyn til det lav forstørrelsen av det optisk. Men mekaniske forstyrrelser er en av de viktigste årsakene bak dårlig tenkelig. Hvis den betydelige mengden av falskt signal i bildet består av motsatte tegn på kanten av objektet, og dermed forskjellen på lysstyrken, er det mest sannsynlig forårsaket av mekaniske forstyrrelser. Bevegelsene til prøven og væsken er de hyppigste årsakene til bevegelses støy, og derfor bør unngås eller minimali.
VSD-signalet (delvis endring i lys intensiteten) er lite (10-3 til 10-4 i den første fluorescens). For å oppdage en så liten endring, bør fluorescens overstige 105 til 106 fotoner ved detektoren i brøkdel av tiden for å overvinne effekten av Foton-shot støy. Videre, for å følge neuronal aktivitet, bør bildefrekvensen være rask, nær den tiden konstantene som trengs for å utføre elektrofysiologisk opptak som det rundt kHz rekkevidde. En kombinasjon av disse to forholdene krever mengden av fluorescens som er langt mer omfattende enn andre typer fluorescerende bilder. Dette krever en høy numerisk blenderåpning i hele optikk, og det vanlige mikroskopet er ikke det beste alternativet. Større elev og blenderåpning er nødvendig som vist i Figur 4.
Recoding systemet skal matche med større Foton godt dybde, rask bildefrekvens, og lavt støynivå. Valget er stort sett avhengig av hastigheten på nevrale system. Det hurtigere signal som det hippocampus signal Transduction nødvendig spesialisert lynrask, lav-bråk system. Imidlertid, det langsom signal som det langsom spre av aktivitet inne det barken kunne være oppdaget benytter det vanlig bortsett fra naturvitenskapelig grade kamera.
Valget av lyskilden er også kritisk. Valget av lyset avhenger av dens intensitet, stabilitet, og området av belysning. I tilfelle av lav forstørrelse Wide-feltet Imaging, punkt lyskilde som buer og lasere må utvide, noe som gjør det vanskelig å bruke disse kildene. Buer, som kvikksølv og Xenon-lamper, er den lyse lyskilde, men vanligvis er ikke stabile. Men den siste utviklingen av Xenon lys kan overvinne problemet. Halogenlampen er stabil og har et større område av filament som lett kan matche med vid felt bildebehandling, men er begrenset i styrken, spesielt ved 530 NM. Den nylige utviklingen av Power LED har gjort oss i stand til å bruke den som den potensielle lyskilde, men det må ha tilbakemelding stabilisator på grunn av temperatur avhengig het. Lasere kan brukes, men den høye coherency resulterer i en flekkete støy, som vanligvis er uakseptabelt for bred-felt bildebehandling.
VSD Imaging-protokollen som presenteres i denne artikkelen, måler en verdi i forhold til hvile betingelsen. Absolutt måling av membranen potensialet kan ikke utføres ved hjelp av gjeldende teknikk. Ratiometrisk Imaging og fluorescens levetid målinger kan brukes til å vurdere den absolutte membran potensialer.
Imaging av hjerne skiver bulk-farget med VSD ved lav forstørrelse kan demonstrere sub-terskel membran potensielle endringer i mikro-krets interaksjoner av hjernen. Slike funksjonelle omfang om sammenhengen mellom mikro-kretser i sanntid oppløsning vil være nyttig i mange områder av hjernen forskning, spesielt for å analysere patologiske aspekter mest sannsynlig forårsaket av slike eksitatoriske og hemmende funksjonell forbindelser mellom ulike hjerneområder. Dette programmet vil være avgjørende for å undersøke endringer i nevrale kretser knyttet til visse typer nevropsykiatriske sykdommer30,31,32.
Utviklingen av genetisk kodet spenning indikator33,34 er fremtiden retning for optiske membran potensielle innspillinger som vil bane vei for attraktive anvendelser av celle type-spesifikk analyse av nevrale hendelser på krets nivå.
Det er mye rom for forbedring i optikk, spesielt for å visualisere bredt felt funksjonelle forbindelser. Våre romanen konfokalmikroskopi optikk35 vil muliggjøre høy hastighet og High-S/N ratio innspillingen av VSD signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
TT mottok JSP KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskudd fra helse-, arbeids-og Velferdsdepartementet (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
