Summary
Vi introducerar en reproducerbar och stabil optisk inspelnings metod för hjärn skivor med spännings känsligt färg ämne. Artikeln beskriver spännings känslig färg färgning och inspelning av optiska signaler med hjälp av konventionella Hippocampus slice preparat.
Abstract
Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av hjärnan slice preparat är ett användbart verktyg för att bedöma den funktionella anslutningen i neurala kretsar. På grund av den fraktionerad förändring i ljus signalen, har det varit svårt att använda denna metod som en kvantitativ analys. Den här artikeln beskriver speciella optik och segment hanterings system, som gör denna teknik stabil och pålitlig. Den nuvarande artikeln visar slice hantering, färgning och inspelning av VSD-färgade Hippocampus skivor i detalj. Systemet upprätthåller fysiologiska förhållanden under lång tid, med bra färgning, och förhindrar mekaniska rörelser av segmentet under inspelningarna. Dessutom, det möjliggör färgning av skivor med en liten mängd av färg ämnet. Optiken uppnår hög numerisk bländare vid låg förstoring, vilket möjliggör inspelning av VSD-signalen vid maximal bild hastighet på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumslig upplösning. På grund av den höga bild hastighet och rumslig upplösning, denna teknik tillåter tillämpning av post-inspelningsfilter som ger tillräcklig signal-brus-förhållande för att bedöma förändringar i neurala kretsar.
Introduction
Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av bulk-betsad Brain slice preparat har blivit ett användbart kvantitativt verktyg för att bedöma dynamiken i neurala kretsar1,2,3,4 . Efter analysen av förändringar i optiska egenskaper på grund av membran excitation5,6,7, VSD Imaging beskrevs första gången i början av 1970-talet av Cohen och andra6,8, 9.; Det är en lämplig metod för att övervaka hjärnans funktioner i real tid som färg ämne direkt sonder membranet potentiella förändringar (dvs, den primära signalen för nerv celler).
De tidigaste VSDs besatt önskvärda egenskaper för att förstå hjärnans system, såsom en snabb tid-konstant att följa den snabba kinetiken av neuronala membran potentiella händelser, och linearitet med förändringen i membranet potential9, 10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14 (på) , 15. liknar andra Imaging experiment, kräver denna teknik ett brett spektrum av specifika stämningar, såsom kameror, optik, program vara och slice fysiologi, för att uppnå önskat resultat. På grund av dessa tekniska fall gro par, de förväntade fördelarna under de första insatserna inte nödvändigt vis materialisera för de flesta av de laboratorier som inte specialiserade på denna teknik.
Den primala orsaken till den tekniska svårigheten var den låga känsligheten hos VSD mot membranet potentiell förändring när den tillämpas på bulk färgning av slice preparat. Storleken på den optiska signalen (dvs. fraktionerad förändring i fluorescens) är vanligt vis 10-4-10-3 av Control (F0) signal under fysiologiska förhållanden. Tids skalan för membranpotential förändring i en neuron är cirka millisekunder till några hundra millisekunder. För att mäta förändringar i neuronpotentialen i neuron, bör kameran som används för inspelningen kunna förvärva bilder med hög hastighet (10 kHz till 100 Hz). Den låga känsligheten hos VSD och den hastighet som krävs för att följa den neurala signalen kräver en stor mängd ljus som ska samlas på kameran med hög hastighet, med ett högt signal-brus-förhållande (S/N)2,16.
Optiken i inspelnings systemet är också en kritisk faktor för att säkerställa insamling av tillräckligt ljus och för att förbättra S/N. Förstoringen uppnås av optiken är ofta överdrivet låg, såsom 1X till 10X, för att visualisera en lokal funktionell neurala kretsen. Till exempel, för att visualisera dynamiken i hippocampus kretsen, en förstoring av cirka 5 skulle vara lämplig. Sådan låg förstoring har låg fluorescens effektivitet; Därför skulle Avancerad optik vara fördelaktigt för sådan inspelning.
Dessutom är segmentfysiologi också viktigt. Eftersom bild analysen kräver att skivorna är intakta behövs noggrann segment hantering17. Dessutom är de åtgärder som vidtagits för att bibehålla segmentets lönsamhet under en längre tid viktiga18.
I den här artikeln beskrivs protokollet för beredning av skivor, VSD-färgning och mätningar. Artikeln beskriver också förbättringar av VSDs, Imaging Device, och optik, och andra ytterligare förfiningar till det experimentella systemet som har möjliggjort denna metod som skall användas som en enkel, kraftfull och kvantitativ analys för att visualisera modifiering av hjärnans funktioner19,20,21,22,23,24,25. Tekniken kan också användas i stor utsträckning för långsiktig potentiering i CA1 området av Hippocampus skivor1. Dessutom är denna teknik också användbar i optisk inspelning av membran potentialer i en enda nervcell26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur försök utfördes enligt protokoll som godkänts av djur omsorgs-och användnings kommittén vid Tokushima bunri University. Följande protokoll för segment beredning är nästan en standard procedur27 , men ändringarna har varit protokoll för färgning och inspelning med VSD.
1. förberedelser inför dagen för experiment
- Förbered beståndet A (tabell 1), lager B (tabell 2) och lager C (tabell 3) lösningar och förvara i kyl skåp.
- Förbered 1 L av artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) (tabell 4, se steg 3) och förvara den i kyl skåpet.
- Förbered 1 L modifierad ACSF (tabell 5) och förvara den i kyl skåpet.
- Dispensera 500 μL Ali kvoter av fetalt bovint serum (FBS) i 2 mL injektions flaskor och förvara i en frys.
- Lös 4% av agar pulver i ACSF (ca. 120 mL) i en mikrovågsugn och häll den i en 90 mm disponibel petriskål. Agarplattan ska förvaras i kyl skåp före vidare användning.
- Placera följande objekt i en frys dagen före försöket: en kirurgisk bricka, en utsnitts behållare och ett aluminium kylblock (120 x 120 x 20 mm3).
- Se till att det finns tillräckligt med plexiglasringar med membran filter för segment hanterings system17,28 (se steg 6,12).
- Lös 2% av agar-pulvret i 50 mL 3 M KCl i en mikrovågsugn. Ta cirka 85 μL av den varma agar-KCl-utlösnings ventilen i 200 μL-spetsar med hjälp av en mikropipett för jord elektroden. Lossa spetsen i den stilla varma agar 3 M KCl gel. Upprepa steg för att fylla ca 20-40 tips med 2% agar.
2. beredning av VSD (di-4-ANEPPS) stam lösning
- Förbered 1 mL 10% polyetoxilerad ricinolja lösning med ultrarent vatten.
- Tillsätt 1 mL etanol till en injektions flaska med di-4-ANEPPS (5 mg injektions flaska), vortexoch Sonikera i 10 min. Lösningen kommer att förvandlas till en djupröd färg med möjliga små rester av di-4-ANEPPS kristaller.
Anmärkning: Etanol som används i detta steg bör vara nyöppnad. - Överför lösningen till ett 2 mL mikrorör med O-ring. Snurra lösningen och tillsätt 500 μl av 10% polyetoxylerad ricinolja lösning.
Anmärkning: Färgen är mycket lipofila. DMSO och poloxamer kan också användas för att lösa upp di-4-ANEPPS men när det gäller den optiska signalen vid förändring i membranpotential, fann vi att användningen av etanol-polyethoxylated ricinolja ger en bättre signal-brus-förhållande. Detta kan relateras till överföringshastigheten av lösnings medel till cell membranet. - Vortex och sonikera tills färgen har helt upplöst.
- Undvik exponering för ljus och förvara den i kyl skåp. Förvara inte i frysen. Beståndet kan pågå i några månader.
Anmärkning: På dagen för experimentet, Följ stegen 3-9.
3. daglig beredning av ACSF (1 L) (tabell 4)
- Väg NaCl, NaHCO3och glukos i en kolv.
- Tillsätt 950 mL destillerat vatten till kolven och börja bubblande med 95% O2/5% co2 gas.
- Tillsätt 2,5 mL av beståndet en lösning till kolven och inkubera i ca 10 min vid rums temperatur.
- Tillsätt 2,5 mL lager C-lösning till kolven.
- Tillsätt destillerat vatten för att göra lösningen till 1 L.
4. daglig beredning av infärgning VSD Ssolution
- Sonikera en injektions flaska med 500 μL FBS och VSD stam lösning (steg 2) i en ultra-sonikator för 5 min.
- Tillsätt 500 μL nypreparerade ACSF i injektions flaskan med FBS.
- Tillsätt 20 (i fråga om möss) eller 40 (vid råttor) μL VSD-stam lösning till injektions flaskan.
- Ultra-Sonikera och Vortex flaskan tills lösningen blir blek orange.
5. förberedelse för kirurgi
- Ta 100 mL kyld ACSF separat i en 300 mL rostfri behållare, en 300 mL bägare, och en plastbehållare, och placera dem i en frys. Häll 150 mL kyld modifierad ACSF (tabell 2) i en annan bägare och placera den i frysen. Vänta tills lösningarna är kylda; den tid som tas ska mätas och bestämmas i förväg.
- Vik för att bryta ett rakblad (kolstål, industriell kvalitet 0,13 mm tjock, blad på båda sidor) i hälften för utsnittet.
Anmärkning: Den andra halvan kan användas för dissektion med en ordentlig blad hållare. - Bered ett block från ACSF 4% agar-plattan med en justerjigg (figur 1).
- Förbered en fuktig inkubations kammare (en gränssnitts typ kammare, en modifierad 1,2 L tätt förseglad låda med en silikon packning) för att hålla hjärnan skivor fysiologiskt levande (figur 2); Tillsätt ACSF i en liten behållare och karbonat med 95% O2/5% co2 gas, och fyll en 90 mm x 20 mm PETRISKÅL med acsf i till toppen.
Anmärkning: En mindre petriskål (60 mm x 20 mm) bör placeras i mitten av 90 mm skålen för att stödja ett filter papper på skålen. - Placera boxen på en uppvärmnings anordning och vänta i 20 minuter för att värma upp den till 28 ° c.
- Lägg krossad is i behållaren av utsnittet. Placera följande instrument i ett rost fritt stål (Small) på is: skalpell, blad hållare, ring pincett, agar block, och en etapp av slicer. Håll fryst ACSF och modifierad ACSF på is och bubbla med 95% O2/5% co2 gas (aka. carbogen).
- Placera följande instrument i en moms (stor): sax (stor, liten), pincett, en spatel, en sked, och diagonala tång.
6. kirurgi (möss)
- Anesthetize musen med isofluran i en draghuv. Bedöm nivån på anestesi genom att kontrol lera pedal reflex av djuret på tå nypa.
- Hals huggningen musen och sänk huvudet i Ice-Cold ACSF i en rostfri kirurgisk bricka.
- Extrahera hjärnan inom 1 min och placera den i en bägare som innehåller kyld ACSF i 5 min.
- Ta ut hjärnan ur bägaren och trimma hjärn blocket med hjälp av en skalpell (figur 3a).
- Placera hjärn blocket på ett 4% agar-block (steg 5,3, figur 3b). Båda halvkloten kan monteras på ett agarblock. Torka av överskottet ACSF från blocket med ett filtrerpapper.
- Applicera tunt lim (superlim) på utsnitts bordet. Placera agarblocket på den och torka överflödigt lim med hjälp av ett filter papper.
- Applicera försiktigt en liten mängd iskalla ACSF (~ 5 mL) med en pipett från toppen av hjärnan-agar blocket. Detta kommer att bidra till att stelna överskott Super lim och förhindra limmet från att täcka hjärnan och störa skivning.
- Fixa utsnitts tabellen till utsnitts facket (figur 3c) och häll den modifierade acsf.
- Ställ in utsnittet till en låg hastighet, med blad frekvensen högst.
- Ställ in segment tjock leken på 350-400 μm och börja skivning (figur 3c). Placera sektorerna i hörnet av segment facket i en sekvens så att segmentets djup lätt kan särskiljas. Vanligt vis tre till fem skivor kan erhållas från en halvklotet.
- Skära av hjärn stammen portion med en 30 G nål (figur 3D).
Anmärkning: Mikrokirurgi på hjärnan slice såsom en nedskärning mellan CA3-CA1 gränsen bör göras i detta skede under ett binokulärt Mikroskop, om det behövs. - Använd en liten tippad pensel, placera segmentet på mitten av membran filtret (0,45 μm porer, PTFE-membran, 13 mm diameter) som hålls med Plexiglasringen17 (15 mm ytterdiameter, 11 mm innerdiameter, 1 mm tjocklek, figur 3e). Placera ringen i den fuktiga återvinnings kammaren (figur 2) och fäst locket för att hålla det inre trycket högt.
Anmärkning: Skivorna kommer att fastna på membranet inom 30 min och kan hanteras med ringarna i de efterföljande stegen i inspelnings kammaren. Det finns ingen anledning att använda vikter eller andra åtgärder för att hålla segmentet på plats. - Justera riktningen och positionen för segmentet i ringen för att säkerställa att den är välcentrerad och har en jämn riktning (se steg 9,3).
- Lämna provet vid 28 ° c i 30 min, och sedan vid rums temperatur i minst 10 till 30 min för återvinning av skivor.
Anmärkning: Skivorna kan nu behålla ett bra fysiologiskt tillstånd på minst 15 timmar.
7. färgning och sköljning av skivorna (möss)
- Applicera försiktigt 100-110 μL av infärgnings lösningen (steg 4) på varje skiva på ringen med en mikropipett. Åtta till nio skivor kan färgas med en Färgnings lösning beredd i steg 4. Låt skivorna stå i 20 minuter för färgning.
- Förbered 50-100 mL ACSF i en behållare och Lägg ringen med skivat prov i den för att skölja Färgnings lösningen.
- Förvara sköljskiva i en annan inkubations kammare. Vänta mer än 1 timme för återhämtning innan experimentet.
Anmärkning: Inkubations kammaren kan lossna från gasen och flyttas till inspelnings platsen i ett tätt förseglat tillstånd. Segmentet kan förbli vid liv i minst 20 min utan gas försörjning. Detta är användbart om du behöver flytta segmentet till en annan plats för inspelning.
8. daglig beredning av experimentell apparatur
- Slå på förstärkaren, datorn och kamera systemet och kontrol lera att program varan är igång.
- Placera ACSF i en 50 mL tub och bubbla med carbogen.
- Använd en peristaltisk pump för att cirkulera ACSF. Justera flödes hastigheten till cirka 1 mL/min.
- Justera sug pipettens höjd så att vätske nivån i experiment kammaren alltid är konstant.
Anmärkning: Nivån på lösningen är viktig för att få en stabil inspelning, därför bör justeringen göras med hjälp av en micromanipulator. - Montera jord elektroden som består av gult chip fyllt med 3 M KCl-agar (2%) (steg 1,8) till en hållare med en AG-AgCl tråd med liten mängd 3 M KCl lösning.
- Fyll en liten mängd ACSF (ungefär två-tredjedel av volymen) i glas elektroden (1 mm ytterdiameter, 0,78 mm innerdiameter dragen med en mikropipett avdragare) med en avsmalnande tunn tubädd gul spets och placera den i elektrod hållaren.
- Fäst hållaren på staven som är monterad i manipulatorn. Se till att använda en förstärkare som elektrod motståndet är ca 1 MΩ.
Anmärkning: Den långa skaft breda öppningen (4-8 μm öppning) patch typ elektrod bör vara bra för fält inspelning och som en stimulerande elektrod.
9. starta en inspelningssession
- Ta en skiva beredning från fuktig kammaren med pincett.
- Placera snabbt segmentet på en experimentell kammare under mikroskopet (figur 4).
- Tryck in kanten på ringen ordentligt i silikon O-ringen. Var noga med att inte bryta membranet eller botten av experiment kammaren.
Anmärkning: Segmentets riktning bör beaktas med hänsyn till riktningen på de stimulerande och inspelnings bara elektroderna i synfältet. Den friska slice bör hålla sig till membranet filtret så det finns ingen anledning att använda andra enheter för att fixa skivor som vikter och nylonnät. - Placera spetsen på den stimulerande elektroden och fältpotentialen för inspelnings elektrod på segmentet under Mikroskop med genomlysning.
- Använd det elektrofysiologiska inspelnings systemet för att kontrol lera responsen. Bekräfta den vanliga (icke-färgade) elektrofysiologiska inspelningen med given konfiguration.
Anmärkning: Inspelnings elektroden kan utelämnas men är användbar för att kontrol lera segmentets fysiologi. - Justera excitation ljusintensiteten till cirka 70-80% av den maximala kapaciteten på kameran som motsvarar 13-15 mW/cm2 på preparatet vid provtagning vid 10 kHz med 5x vatten nedsänkning objektiv och 1x plan APO rör lins. Magnetiseringen ljus våglängd är 530 nm, och utsläppet filtret måste vara > 590 Nm.
Anmärkning: Använd en slutare för att minimera mängden excitation ljus. Kontinuerlig ljus exponering kan försämra segmentets fysiologi. Den möjliga skadliga effekten av ljuset beror på intensiteten och varaktigheten av ljuset. Använd Elektrofysiologisk inspelning för att bedöma ljusets effekt. I händelse av styrkan hos 13-15 mW/cm2, bör ca 1 s exponering vara den övre gränsen för toleransen. - Justera fokus med förvärvs systemet med Lys rörs ljus källa eftersom fokus kan vara olika beroende på våglängd och starta förvärvet.
- Granska data i ett program för bild insamling.
Anmärkning: Vi använde ursprungliga microprogramming paket av numeriska analys program för detaljerad analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 visar den representativa optiska signalen vid elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter i område CA1 av en mus Hippocampus skiva. De på varandra följande bilderna i figur 5a visar den optiska signalen innan några rumsliga och temporala filter tillämpades, medan Figur 5b visar samma data efter applicering av ett 5 x 5 x 5 Kubikfilter (en Gaussian kernel-faltning, 5 x 5 spatial-och 5 till temporala dimensionen) två gånger. På grund av den höga bild hastigheten (0,1 MS/frame) och hög rumslig upplösning (100 pixlar x 100 pixlar), ändrade inte tillämpningen av filtret signalen utan filtrerade bullret, vilket också kan observeras i den tid kurs som registrerats i pixlar i en enda studie ( Figur 5C, inget filter; Figur 5D, med filter; och figur 5E, ovanpå).
Figur 6 jämför det typiska svaret i område CA1 av en Hippocampus skiva mellan mus (figur 6a) och råtta (figur 6b). Som framgår av figuren, hyperpolariserande svar på grund av hämmande ingångar är uppenbar i råtta Hippocampus skiva vid tillämpning av samma stimulans till Schaffer säkerheter nära CA1/CA3 gränsen. Den lilla hyperpolariserande svar observeras i distala sidan av CA1 efter 24 MS i musen Hippocampus skiva, men mer massiva hyperpolariserande svar övertog depolariserande svar i råtta Hippocampus skiva. Den VSD Imaging kan tydligt visa skillnaden mellan mus och råtta Hippocampus skivor.
Figur 1 : En illustration av agarblocket som används för att montera hjärn vävnad för skivning och en Jigg för att göra blocket. Aen schematisk illustration av hjärn blocket och 4% agar-blocketb. (C, D) Fotografi av en justerbar jigg gjord av en Plexiglasplatta (5 mm tjock vardera) för att göra agarblocket. Vid beredning av agarblocket ska de övre och nedre plattorna staplas enligt D. (E) genom att sätta in ett blad i de långa tunna skårorna (1) och (2), den triangulära delen skärs ut, skåran (3) används för att trimma hela djupet av blocket. (4) avlägsnandet av den övre plattan gör det möjligt att skära ur de icke nödvändiga delarna. Använd kort platsen 1 och 2 och gör endast 5 mm djupa snitt så att blocket blir så som visas i (A) och (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : En illustration av den inkubationskammare av gränssnitts typ som används för att bibehålla segmentfysiologi. (A) översikt över systemet. (B) inrednings detaljer. Cillustration av återvinnings kammaren. Preparatet ska placeras på ett filter papper placerat på en ACSF-fylld 90 mm och 60 mm petriskål. Den sistnämnda skålen är att stödja filter papper. Rätterna och ACSF bubblande container hålls på plats med en Plexiglasplatta. Filter papperet ska inte vidröra väggen i lufttät lådan eller behållaren. Luften tillförs genom en bubblande flaska som innehåller fuktade gaser i kammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Hippocampal skiva preparat från en mus hjärna. (A) den isolerade mus hjärnan bör först skäras på den streckade linjen (a) och sedan (b). Slutligen bör snittet göras längs linjen (c). Snittet ska vara vinkel rätt mot botten. Bhjärn blocket skall monteras på ett agarblock. Cagarblocket skall placeras på utsnittet. (D) resulterande skiva. Överskotts vävnaden ska klippas vid den streckade linjen. (E) segmentet ska placeras i mitten av membran filtret med en plexiglashållare (ytterdiameter 15 mm, innerdiameter 11 mm, PTFE-membranfiltret på 13 mm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Inspelnings system för optiska signaler från segment preparat. (A) ett fotografi av mikroskopet som används för att avbilda skivorna i det aktuella manuskriptet. Optiken består av en objektiv lins (5x NA 0,60), en spegel låda för Dichroic filter (580 nm), och en projektion (rör) lins (PLAN APO x 1.0). En höghastighets kamera fästs på projektionsylens ovansida genom en c-fattning. Det finns en annan vanlig USB-kamera för observation. Excitation ljus introduceras med hjälp av fiberoptik. (B) fotografi av de linser som är förenliga med spegel lådan. CSchematiskt diagram över inspelnings systemet. Bild systemet och det elektrofysiologiska inspelnings systemet styrs av en PC. LED belysnings system med en fotodiod feedback styr system användes som ljus källa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativ optisk signal i område CA1 av en mus Hippocampus skiva i en enda studie. (A) de på varandra följande bilderna visar spridningen av den neuronala signalen som erhållits vid bild Rute frekvensen på 0,1 MS/Frame längs med den säkerhet som finns i Schaffer innan några rumsliga och temporala filter appliceras (varje 0,2 MS). Excitation var 530 nm och utsläppet var > 590 Nm. B) samma uppgifter efter applicering av en tredimensionell Gaussisk kärna på 5 x 5 x 5 två gånger. (C, D) Spåren av optiska signaler i de representativa pixlarna [varje två pixlar (36 μm) längs en linje i mitten av CA1 visas på torget i A, * betecknar pixeln i stratum pyramidale] från de data som visas i A och B. (E) den överlagda signalen från optiska signaler i C och D. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Jämförelse av optisk signal mellan mus och råtta Hippocampus skivor. Den representativa på varandra följande bilder på elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter vägen nära CA3/CA1 gränsen av en mus (a) och råtta (B) Hippocampus skiva. Video 1 visar mus Hippocampus slice och video 2 visar råtta Hippocampus skiva. Tids förloppet för den optiska signalen i mitten av CA1 på stratum balsa (St. pyr.) och stratum radiatum (St. rad.) visas till höger om figuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Slutlig mM | Vikt | |
| Nä2Po4 • 2H2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4• 7h2O | 2 mM | 9,86 g |
| KCl | 2,5 mM | 3,73 g |
| Tillsätt H2O för att göra 50 ml |
Tabell 1: lager A.
| Slutlig mM | Vikt | |
| MgSO4• 7h2O | 2 mM | 12,32 g |
| Tillsätt H2O för att göra 50 ml |
Tabell 2: lager B.
| Slutlig mM | Vikt | |
| CaCl2• 2H2O | 2 mM | 5,88 g |
| Tillsätt H2O för att göra 50 ml |
Tabell 3: lager C.
| Final (mM) | Vikt | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | på 26 mM | 2,18 g |
| Glukos | 10 mM | 1,8 g |
| Lager A | 2,5-100 mL | |
| Tillsätt ca 950 mL H2O och bubbla med blandad gas (95% o2/5% co2) (10 min) | ||
| Lager C (CaCl2) | 2 mM | 2,5-100 mL |
| Tillsätt H2O för att göra 1 000 ml | ||
Tabell 4: daglig beredning av ACSF.
| Final (mM) | Vikt | |
| NaHCO3 | på 26 mM | 2,18 g |
| Sackaros | 205,35 mM | 70,29 g |
| Glukos | 10 mM | 1,8 g |
| Lager A | 2,5-100 mL | |
| Lager B | 2,0-100 mL | |
| Tillsätt ca 900 mL H2O och bubbla med blandad gas (95% o2/5% co2) (10 min) | ||
| Lager C | 0,4 mM | 0,5-100 mL |
| Tillsätt H2O för att göra 1 000 ml | ||
Tabell 5: modifierad ACSF (skär lösning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Segmentfysiologi är avgörande för att samla in rätt signal. Användningen av ring membran filter systemet i detta protokoll säkerställer att segmentet förblir friskt och oförvrängt under hela proceduren2,16,17. Andra system kan användas för att behålla segmentfysiologi under inspelningen, men segmentet bör inte få deformeras när som helst eftersom bilden behöver varje del av segmentet för att vara felfri. Ring-membran filter systemet är också bättre för färgning, eftersom detta hjälper oss att minimera volymen av infärgning lösning som krävs. Det är också viktigt att kontrol lera intensiteten av excitation ljus, eftersom det bör vara låg med avseende på tids fraktionen. Den kontinuerliga belysningen kan skada preparatet. Därför är det nödvändigt att använda slutaren på lämpligt sätt.
Toxiciteten hos VSD har ofta diskuterats29, men det är ett resultat av icke-linjär multiplikation av färg ämnet koncentration, excitation ljusintensitet, och varaktigheten av exponering för ljuset. Det infärgnings förfarande som visas i detta protokoll ledde inte till några mätbara förändringar i segmentets fysiologiska parametrar, såsom input-output-relationerna för de fältpotentiella inspelningarna och de på den långsiktiga potentieringen (LTP), Parade puls och underlättande (PPF). Försämringen av segmentsfysiologi är betydande, särskilt under kontinuerlig belysning16, men det kan hanteras genom att övervaka fältpotentialen. Genom att använda dessa försiktighets åtgärder kan vi registrera LTP med kontinuerlig optisk inspelning med VSD i mer än 12 h24, vilket är jämförbart med de bäst konditionerade in vitro-experimenten.
Under inspelningen kan luft bordet vara användbart, men isolering från andra enheter bör tillåtas på grund av den låga förstoringen av optiken. Mekaniska störningar är dock en av de viktigaste orsakerna bakom dålig avbildning. Om den betydliga mängden av falsk signal i bilden består av motsatta tecken vid kanten av objektet, alltså skillnaden i ljus styrka, är det troligen orsakas av mekaniska störningar. Rörelserna av preparatet och vätska är de vanligaste orsakerna till rörelse ljud, och därmed bör undvikas eller minimaliserade.
VSD-signalen (fraktionerad förändring i ljusintensiteten) är liten (10-3 till 10-4 av den initiala fluorescensen). För att upptäcka en sådan liten förändring, bör fluorescens överstiga 105 till 106 fotoner på detektorn i bråk delen av tiden för att övervinna effekten av Photon-shot buller. Dessutom, för att följa den neuronala aktiviteten, bör bild Rute hastigheten vara snabb, nära de tidskonstanter som behövs för att utföra Elektrofysiologisk inspelning som den runt kHz-området. En kombination av dessa två villkor kräver den mängd fluorescens som är mycket mer omfattande än andra typer av fluorescerande Imaging. Detta kräver en hög numerisk bländare i hela optiken, och den vanliga Mikroskop är inte det bästa alternativet. Större elev och bländare behövs som visas i figur 4.
Omkodning systemet bör matcha med de större fotonen väl djup, snabb bild hastighet, och låg ljud nivå. Valet beror främst på hastigheten på neurala systemet. Den snabbare signalen såsom Hippocampus signaltransduktion behöver specialiserade Ultrafast, låg-brus-system. Men den långsamma signalen som den långsamma spridningen av aktivitet i cortices kan upptäckas med hjälp av den vanliga men vetenskapliga grade kameror.
Valet av ljus källa är också kritiskt. Valet av ljus beror på dess intensitet, stabilitet, och området för belysning. När det gäller fotografering med bred bilds fält i låg förstoring måste punkt ljus källa som bågar och lasrar expandera, vilket gör det svårt att använda dessa källor. Bågar, såsom kvicksilver och Xenon-lampor, är den ljusa ljus källan men oftast inte är stabila. Men den senaste utvecklingen av Xenon-ljus kan övervinna problemet. Halogenlampan är stabil och har ett större område av glöd tråden som lätt kan matcha med wide-fält avbildning, men är begränsad i styrkan speciellt vid 530 nm. Den senaste tidens utveckling av Power LED har gjort det möjligt för oss att använda den som den potentiella ljus källan, men den måste ha feedback stabilisator på grund av temperatur beroendet. Lasrar kan användas men den höga enhetlighet resulterar i en fläckig buller, vilket är vanligt vis oacceptabelt för wide-fält Imaging.
VSD-bildprotokollet som presenteras i den här artikeln mäter ett värde i förhållande till vilo villkoret. Absolut mätning av membranpotentialen kan inte utföras med den nuvarande tekniken. Ratiometriska Imaging och fluorescens livstids mätningar kan användas för att bedöma de absoluta membranpotentialerna.
Avbildning av hjärn skivor bulk-färgade med VSD vid låg förstoring kan visa sub-tröskel membran potentiella förändringar i mikro-kretsar interaktioner i hjärnan. Sådana funktionella omfattning om sambandet mellan mikro-kretsar i real tid upplösning kommer att vara användbart i många områden av hjärn forskning, särskilt för att analysera de patologiska aspekter som sannolikt orsakas av sådana excitatoriska och hämmande funktionella kopplingar mellan olika hjärn områden. Denna ansökan kommer att vara avgörande för att undersöka förändringar i neurala kretsar relaterade till vissa typer av neuropsykiatriska sjukdomar30,31,32.
Utvecklingen av den genetiskt kodade spännings indikatorn33,34 är den framtida riktningen för optiska membran potentiella inspelningar som kommer att bana väg för attraktiva tillämpningar av celltypspecifik analys av neurala händelser på krets nivå.
Det finns mycket utrymme för förbättringar i optiken, särskilt för visualisering av wide-fält funktionella anslutningar. Vår roman konfokal optik35 kommer att möjliggöra hög hastighet och hög-S/N-förhållande inspelning av VSD-signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
TT mottog JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 och JP15K00413) från MEXT och bidrag från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] och H30 [18062156]). Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelsk språkiga redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
