Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Taylor McFadden; Rishi  K. Devulapalli; Timothy J. Jarome

doi:10.3791/59695

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Artigo de método

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

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DOI:

10.3791/59695

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21 de maio de 2019

Taylor McFadden¹ , Rishi K. Devulapalli² , Timothy J. Jarome¹^,²

¹Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, ²School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Resumo

O sistema do ubiquitin-proteasome é um regulador chave da degradação da proteína e de uma variedade de outros processos celulares nos eukaryotes. No cérebro, aumentos na atividade de ubiquitina-proteasome são críticos para a formação de plasticidade sináptica e memória e alterações aberrantes neste sistema estão associados a uma variedade de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos. Um dos problemas no estudo do funcionamento do ubiquitina-proteasome no cérebro é que ele está presente em todos os compartimentos celulares, nos quais as metas proteicas, o papel funcional e os mecanismos de regulação podem variar muito. Como resultado, a capacidade de comparar diretamente a segmentação de proteínas de ubiquitina cerebral e a atividade catalítica de Proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares dentro do mesmo animal é fundamental para compreender plenamente como a UPS contribui para a plasticidade sináptica, memória e doença. O método descrito aqui permite a coleta de frações sinápticas nucleares, citoplasmáticas e brutas do mesmo cérebro de roedores (Rat), seguidas pela quantificação simultânea da atividade catalítica do Proteassoma (indiretamente, proporcionando atividade do núcleo Proteassoma apenas) e marcação de proteínas de ubiquitina específica de ligação. Assim, o método pode ser usado para comparar diretamente as mudanças subcelulares na atividade do ubiquitin-proteasome em regiões diferentes do cérebro no mesmo animal durante a plasticidade sináptica, a formação da memória e Estados diferentes da doença. Este método também pode ser utilizado para avaliar a distribuição subcelular e a função de outras proteínas dentro do mesmo animal.

Introdução

O sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) é uma complexa rede de estruturas proteicas interconectadas e ligases que controla a degradação da maioria das proteínas de vida curta nas células¹. Neste sistema, as proteínas são marcadas para a degradação ou outros processos/destinos celulares pelo pequeno modificador ubiquitina. Uma proteína alvo pode adquirir 1-7 modificações de ubiquitina, que podem se unir em um dos sete sítios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) ou o N-terminal metionina (M1; conhecido como linear) na ubiquitina anterior². Algumas dessas tags de poliubiquitina são específicas da degradação (K....