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Artigo de método

Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin

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DOI:

10.3791/59712

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31 de maio de 2019

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1Department of Chemistry, Carleton University Ottawa, 2London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada

Neste artigo

Resumo

Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.

Resumo

Os produtos naturais são frequentemente biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de um único composto. Devido a suas características estruturais comuns, muitos compostos dentro da mesma classe sofrem a fragmentação similar de MS/MS e têm diversos íons idênticos do produto e/ou perdas neutras. O objetivo da filtragem de fragmentação diagnóstica (DFF) é detectar eficientemente todos os compostos de uma determinada classe em um extrato complexo, selecionando conjuntos de dados não direcionados de LC-MS/MS para espectros MS/MS que contenham íons de produto específicos de classe e/ou perdas neutras. Este método é baseado em um módulo DFF implementado dentro da plataforma MZmine de código aberto que requer extratos de amostra ser analisado por aquisição dependente de dados em um espectrómetro de massa de alta resolução, como Quadrupole Orbitrap ou Quadrupole massa de tempo de vôo Analisadores. A principal limitação desta abordagem é que o analista deve primeiro definir quais íons de produto e/ou perdas neutras são específicos para a classe alvo de produtos naturais. DFF permite a descoberta subseqüente de todos os produtos naturais relacionados dentro de uma amostra complexa, incluindo novos compostos. Neste trabalho, demonstramos a eficácia do DFF através da triagem de extratos de Microcystis aeruginosa, uma flor de algas nocivas proeminente causando cianobactérias, para a produção de microcistinas.

Introdução

A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)1. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único2. Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilham características-chave de fragmentação MS/MS, incluindo íons de produtos compartilhados e/ou perdas neutras. A capacidade de amostras complexas de tela para compostos que possuem íons de produto de classe específica e/ou perdas neutras é uma estratégia poderosa para detectar classes inteiras de compostos, potencialmente levando à descoberta de novos produtos naturais3, 4. º , 5. º , 6. por décadas, os métodos de espectrometria de massa, como a digitalização de perda neutra e a digitalização de íons precursores realizados em instrumentos de baixa resolução permitiram a detecção de íons com a mesma perda neutra ou íons de produto. No entanto, os íons ou transições específicas precisavam ser definidos antes da realização dos experimentos. Como espectrómetros de massa de alta resolução tornaram-se mais populares em laboratórios de pesquisa, amostras complexas são agora comumente rastreadas usando métodos de aquisição (DDA) não direcionados e dependentes de dados. Em contraste com a perda neutra tradicional e a varredura do íon do precursor, os compostos estruturalmente relacionados podem ser identificados pela análise do borne-aquisição7. Neste trabalho, demonstramos uma estratégia que desenvolvemos denominado filtragem de fragmentação diagnóstica (dff)5,6, uma abordagem direta e fácil de usar para detectar classes inteiras de compostos dentro de matrizes complexas. Este módulo DFF foi implementado na plataforma de código aberto, MZmine 2 e disponível baixando MZmine 2,38 ou lançamentos mais recentes. DFF permite aos usuários a tela eficientemente conjuntos de dados DDA para MS/MS espectros que contêm íons do produto (s) e/ou perda neutra (es) que são diagnósticos para classes inteiras de compostos. Uma limitação de DFF é íons do produto característico e/ou as perdas neutras para uma classe de compostos devem ser definidas pelo analista.

Por exemplo, cada uma das mais de 60 micotoxinas fumonisicas diferentes identificadas8,9possuem uma cadeia lateral tricarballylic, que gera um íon de produto m/z 157, 142 (C6H5O5-) após fragmentação do [M-H]- Ion4. Portanto, todas as fumonisinas putativas em uma amostra podem ser detectadas usando DFF por meio da triagem de todos os espectros MS/MS dentro de um conjunto de dados DDA que contenham o íon de produto m/z 157, 142 proeminente. Da mesma forma, os compostos sulados podem ser detectados pela triagem de conjuntos de dados DDA para espectros MS/MS que contêm uma perda neutra diagnóstica de 79,9574 da (SO3)3. Esta abordagem também foi aplicada com sucesso para a detecção de novos peptídeos cíclicos5 e produtos naturais que contêm resíduos de triptofano ou fenilalanina6.

Para demonstrar a efetividade do DFF e sua facilidade de uso dentro da plataforma MZmine10, aplicamos essa abordagem à análise de microcistinas (MCS); uma classe de mais de 240 toxinas estruturalmente relacionadas produzidas por cianobactérias de água doce11,12,13.

As cianotoxinas mais comumente relatadas são MCs, com o congéner MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) mais freqüentemente estudado (Figura 1). MCs são heptapeptides não-ribossômicos monocílicos, biossintetizados por múltiplos gêneros de cianobactérias, incluindo Microcystis, Anabaena, no, e Planktothrix12,13. Os MCs são compostos por cinco resíduos comuns e duas posições variáveis ocupadas por aminoácidos L. Quase todos os MCs possuem um resíduo característico do ácido β-aminoácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) na posição 511.  As vias de fragmentação MS/MS do MCS são bem descritas14,15; o resíduo de Adda é responsável para o íon proeminente do produto de MS/MS, m/z 135, 803+ (c9H11O+) assim como outros íons do produto que incluem m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (Figura 2). Conjuntos de dados de DDA não direcionados de extratos celulares de Microcystis aeruginosa podem ser rastreados para todas as microcistinas presentes usando esses íons diagnósticos, dado que as microcistinas têm um resíduo de Adda.

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Protocolo

1. preparação de cromatografia líquida não direcionada (LC)-conjuntos de dados MS/MS

Nota: DFF pode ser realizado usando qualquer espectrómetro de massa de alta resolução e método analítico otimizado para uma classe alvo de analitos. MC otimizado LC-MS/MS condições no Espectrómetro de massa Orbitrap estão listados na tabela de materiais.

  1. Transferindo MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    Nota: os dados de exemplo CPCC300. Raw podem ser encontrados em https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. No menu suspenso métodos de dados brutos , selecione a opção de importação de dados brutos .
    2. Escolha o arquivo (s) de dados a ser analisado. Arquivos simples ou múltiplos podem ser importados.
  2. Opcional Se o formato de dados do fornecedor não for suportado pelo MZmine, use o Proteowizard16 para gerar arquivos de dados centrados. mzml.
    1. Escolha o filtro de picking de pico para aplicar o algoritmo de centriding fornecido pelo fornecedor.

2. filtragem de fragmentação diagnóstica de arquivos DDA importados

  1. Usando o cursor, selecione e realce o arquivo de dados na coluna arquivos de dados brutos da tela mzmine principal.
  2. No menu suspenso Visualização , selecione a opção de filtragem de fragmentação de diagnóstico .
  3. Na caixa de diálogo DFF que aparece (Figura 3), insira as seguintes opções:
    1. Tempo de retenção – use o intervalo automático ou defina o intervalo de tempos de retenção em minutos quando a classe de analitos de destino elute.
    2. Precursor m/z -use auto Range ou defina a faixa m/z da classe de analisadores segmentadas, incluindo a possibilidade de vários compostos carregados quando apropriado.
    3. m/z tolerância – Insira a precisão de massa MS/MS realizável do MSinstrument; 0, 1 m/z ou 3,0 ppm é apropriado para uma plataforma Orbitrap. Se somente os íons diagnósticos do produto serão investigados, entrada 0,0 na opção diagnóstica do valor da perda neutra (da) . Inversamente, se somente as perdas neutras diagnósticas serão investigadas, entrada 0,0 na opção diagnóstica dos íons do produto (m/z) .
    4. Íons de produto de diagnóstico (m/z) – entrada do produto específico de classe Ion (s) m/z. Separe vários íons de produto com uma vírgula.
      Nota: inserir vários íons de produto visualizará espectros que contenham todos os íons de produtos listados.
    5. Valor de perda neutra diagnóstica (da) – Introduza a classe de perda neutra específica (es). Separe múltiplas perdas neutras com uma vírgula.
      Nota: a Incolocação de múltiplas perdas neutras visualizará espectros que contenham todas as perdas neutras listadas. A incolocação de íons de produtos diagnósticos e perdas de neutros visualizará espectros que satisfaçam todos os critérios.
    6. Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – como% do pico de base dos espectros MS/MS, definir a intensidade mínima para os íons do produto de diagnóstico e/ou perdas neutras a serem consideradas.
    7. Arquivo de saída Peaklist – selecione um caminho e um nome de arquivo para gerar os resultados.
    8. Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF aparecerá ao concluir com êxito as etapas acima
      Observação: dois arquivos de dados. csv serão gerados. {Arquivo de saída Peaklist}. csv contém o precursor m/z, números de digitalização e tempos de retenção das varreduras. Isso pode ser usado em módulos MZmine existentes, incluindo métodos de dados brutos > detecção de pico > detecção de pico direcionada para gerar cromatogramas de íons extraídos de precursores que PREENCHERAM os critérios dff definidos. {Arquivo de saída do Peaklist} _ Data. csv contém o precursor m/z, o íon do produto m/z e os tempos de retenção para permitir a geração de plotagens dff fora do mzmine.

3. exemplo de uso de DFF para análise de microcistina

  1. Preparação da amostra
    1. Esterilizar 250 mL de frascos de Erlenmeyer contendo 30 mL de meio de MA estéril17 ou outros meios de crescimento de cianobactérias (BG-11) equipados com uma rolha de espuma.
    2. Inoculate meios de crescimento esterilizados com uma cultura de cianobactérias para aproximadamente 5 × 105 células ml-1 condições assépticas. Monitore a densidade da pilha com um Hemocytometer. Neste exemplo, cresça a estirpe de M. aeruginosa CPCC300 fotoautotrophically em 27 ° c, iluminado com luz fluorescente branca fresca (30 μe M-2 s-1) usando uma luz de 12 h: regime escuro de 12 h. Gire as células uma vez por dia.
    3. Separe as células do meio de cultura após 26 dias por filtração a vácuo usando 47 mm de diâmetro GF/C vidro filtro de microfibra papéis.
    4. Adicionar 3 mL de 80% de metanol (AQ) a células colhidas em 14 ml de tubo (s) de ensaio.
    5. Vortex e, subsequentemente, proceda o tubo (s) de teste contendo células de cianobactérias para 30 s cada. Conservar os tubos de ensaio a-20 ° c durante 1 h. devolver o tubo de ensaio à temperatura ambiente e permitir que a amostra (s) descongele durante 15 min.
    6. Repita o passo 3.1.5 duas vezes adicionais para efetivamente lyse as células.
    7. Filtre o extrato (s) de células de cianobactérias resultantes através de um filtro (s) de seringa de PTFE de 0,22 μm.
    8. Extrato seco (s) com um evaporador a uma temperatura de 30 ° c usando um fluxo suave de gás nitrogênio. Armazene o extrato seco a-20 ° c até a análise LC-MS/MS.
    9. Reconstituir o resíduo seco com 500 μL de 90% de metanol (AQ) e vórtice por 30 s num frasco de HPLC âmbar antes da análise.
  2. Analise o extrato de cianobactérias usando um método de aquisição DDA em um espectrómetro de massa de alta resolução.
    Nota: as condições otimizadas de LC-MS para a análise de MC usadas aqui são alistadas na tabela de materiais.
  3. Prepare os DataFile (s) DDA e importe para MZmine seguindo as etapas 1,1 e 1,2.
  4. Selecione os DataFiles e inicie os módulos DFF seguindo as etapas 2.1-2.2.
  5. Para a análise de MC, use as seguintes configurações dentro do módulo DFF (Figura 3).
    1. Tempo de retenção – Insira o intervalo de 2, 0 a 6, 0 min.
    2. Precursor m/z – entrada m/z intervalo de 430, 0 a 1200, 0.
    3. m/z tolerância – aplique a tolerância m/z de 0, 1 m/z ou 3,0 ppm.
    4. Íons diagnósticos do produto (m/z) -entrada m/z de 135, 803, 163,1114 como os íons diagnósticos do produto
    5. Valor de perda de diagnóstico neutro (da) – entrada 0,0 para definir que não há perdas de diagnóstico neutro estão sendo usados.
    6. Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – use 15, 0 como o limiar de intensidade mínima
    7. Arquivo de saída Peaklist – defina o arquivo de saída como putative_MCs. csv.
  6. Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF (Figura 4) aparecerá após concluir com êxito as etapas acima

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Resultados

A parcela de DFF gerada após a análise de M. aeruginosa CPCC300 é mostrada na Figura 4. O eixo xdeste gráfico é o m/z dos íons precursores que satisfizeram os critérios definidos do dff, enquanto o eixo ymostra o m/z de todos os íons do produto dentro dos espectros MS/MS do MCS. Para esta análise, os critérios para detecção de MC incluíram íons precursores dentro da faixa de m/z de 440-1200, tempos de rete...

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Discussão

DFF é uma estratégia direta e rápida para a detecção de classes inteiras de compostos, especialmente relevantes para a descoberta de compostos de produtos naturais. O aspecto mais importante do DFF é definir os critérios específicos de fragmentação MS/MS para a classe de compostos de destino. Neste exemplo representativo, o DFF foi utilizado para detectar todos os resíduos de Adda contendo MCs presentes em extrato celular M. aeruginosa . Embora a grande maioria dos MCs contenha um resíduo de Adda, outros resíduo...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Os autores agradecem Heather Roshon (centro de cultura phycological canadense, Universidade de Waterloo para fornecer a cultura do cianobactérias estudada e sawsan abusharkh (Universidade de Carleton) para a assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300CULTURA FICOLÓGICAhttps://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/
software Mzmine 2
http://mzmine.github.io/LC-MS
Q-Exactive OrbitrapThermo-Equipadocom fonte de ionização HESI
1290 UHPLCAgilentEquipado com bomba binária, amostrador automático, compartimento de coluna
ColunaC18Agilent959757-902Eclipse Plus C18 RRHD coluna (2.1 × 100 mm, 1.8 μ m)
< forte > solventes < / forte >
Optima LC-MS grau MetanolFisherA456-4
OptimaLC-MS grau AcetonitrilaFisherA955-4
OptimaLC-MS grau ÁguaFisherW6-4
LC-MS grau Ácido fórmicoFisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Indústrias CientíficasSI-0236
Centrífuga Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436
Outros
Frascos de HPLC âmbar 2 mL/capsAgilent5182-0716/5182-0717
0.2-μ m Filtros de seringa PTFEPall Corp.4521
Filtros de microfibra de vidro Whatman 47mm GF/ASigma-AldrichWHA1820047
Media
MA media (pH 8,6) (quantidade/L)Watanabe, M. F. & Oishi, S. Efeitos de fatores ambientais na toxicidade de uma cianobactéria (Microcystis aeruginosa) em condições de cultivo. Microbiologia aplicada e ambiental. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)· 4H2O, 50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3, 100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3, 50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4, 40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2· 6H20, 50 mgde Sigma-AldrichM2393
Glicerofosfato de sódio, 100 mgde Sigma-AldrichG9422
H3BO3, 20 mgde Sigma-AldrichB6768
Bicina, 500 mgde Sigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV) solução metálica, 5 mL
Traga o seguinte para 1 L com ddH2O
NaEDTA· 2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 · 6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2· 4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2· 6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4· 2H2OBaker3764
Cyanobacteria BG-11 50X Solução de água doceSigma-AldrichC3061-500mL
CENTRO CANADENSE DE CPCC300

Referências

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