Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin

Summary

Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.

Abstract

Os produtos naturais são frequentemente biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de um único composto. Devido a suas características estruturais comuns, muitos compostos dentro da mesma classe sofrem a fragmentação similar de MS/MS e têm diversos íons idênticos do produto e/ou perdas neutras. O objetivo da filtragem de fragmentação diagnóstica (DFF) é detectar eficientemente todos os compostos de uma determinada classe em um extrato complexo, selecionando conjuntos de dados não direcionados de LC-MS/MS para espectros MS/MS que contenham íons de produto específicos de classe e/ou perdas neutras. Este método é baseado em um módulo DFF implementado dentro da plataforma MZmine de código aberto que requer extratos de amostra ser analisado por aquisição dependente de dados em um espectrómetro de massa de alta resolução, como Quadrupole Orbitrap ou Quadrupole massa de tempo de vôo Analisadores. A principal limitação desta abordagem é que o analista deve primeiro definir quais íons de produto e/ou perdas neutras são específicos para a classe alvo de produtos naturais. DFF permite a descoberta subseqüente de todos os produtos naturais relacionados dentro de uma amostra complexa, incluindo novos compostos. Neste trabalho, demonstramos a eficácia do DFF através da triagem de extratos de Microcystis aeruginosa, uma flor de algas nocivas proeminente causando cianobactérias, para a produção de microcistinas.

Introduction

A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)¹. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único². Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilha....

Protocol

1. preparação de cromatografia líquida não direcionada (LC)-conjuntos de dados MS/MS

Nota: DFF pode ser realizado usando qualquer espectrómetro de massa de alta resolução e método analítico otimizado para uma classe alvo de analitos. MC otimizado LC-MS/MS condições no Espectrómetro de massa Orbitrap estão listados na tabela de materiais.

1. Transferindo MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
   Nota: os dados de exemplo CPCC300. Raw podem ser encontrados em https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
   1. No menu suspenso métodos de dados brutos , selecione....

Results

A parcela de DFF gerada após a análise de M. aeruginosa CPCC300 é mostrada na Figura 4. O eixo xdeste gráfico é o m/z dos íons precursores que satisfizeram os critérios definidos do dff, enquanto o eixo ymostra o m/z de todos os íons do produto dentro dos espectros MS/MS do MCS. Para esta análise, os critérios para detecção de MC incluíram íons precursores dentro da faixa de m/z de 440-1200, tempos de rete.......

Discussion

DFF é uma estratégia direta e rápida para a detecção de classes inteiras de compostos, especialmente relevantes para a descoberta de compostos de produtos naturais. O aspecto mais importante do DFF é definir os critérios específicos de fragmentação MS/MS para a classe de compostos de destino. Neste exemplo representativo, o DFF foi utilizado para detectar todos os resíduos de Adda contendo MCs presentes em extrato celular M. aeruginosa . Embora a grande maioria dos MCs contenha um resíduo de Adda, outros resíduo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300	CULTURA FICOLÓGICA		https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)		software	http://proteowizard.sourceforge.net/
software Mzmine 2
http://mzmine.github.io/LC-MS
Q-Exactive Orbitrap	Thermo-Equipado	com fonte de ionização HESI
1290 UHPLC	Agilent		Equipado com bomba binária, amostrador automático, compartimento de coluna
Coluna	C18Agilent	959757-902	Eclipse Plus C18 RRHD coluna (2.1 × 100 mm, 1.8 μ m)
< forte > solventes < / forte >
Optima LC-MS grau Metanol	Fisher	A456-4
OptimaLC-MS grau Acetonitrila	Fisher	A955-4
OptimaLC-MS grau Água	Fisher	W6-4
LC-MS grau Ácido fórmico	Fisher	A11710X1-AMP
Vortex-Genie 2	Indústrias Científicas	SI-0236
Centrífuga Sorvall Micro 21	Thermo Scientific	75-772-436
Outros
Frascos de HPLC âmbar 2 mL/caps	Agilent	5182-0716/5182-0717
0.2-μ m Filtros de seringa PTFE	Pall Corp.	4521
Filtros de microfibra de vidro Whatman 47mm GF/A	Sigma-Aldrich	WHA1820047
Media
MA media (pH 8,6) (quantidade/L)			Watanabe, M. F. & Oishi, S. Efeitos de fatores ambientais na toxicidade de uma cianobactéria (Microcystis aeruginosa) em condições de cultivo. Microbiologia aplicada e ambiental. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)· 4H2O, 50 mg	Sigma-Aldrich	C2786
KNO3, 100 mg	Sigma-Aldrich	P8291
NaNO3, 50 mg	Sigma-Aldrich	S5022
Na2SO4, 40 mg	Sigma-Aldrich	S5640
MgCl2· 6H20, 50 mg	de Sigma-Aldrich	M2393
Glicerofosfato de sódio, 100 mg	de Sigma-Aldrich	G9422
H3BO3, 20 mg	de Sigma-Aldrich	B6768
Bicina, 500 mg	de Sigma-Aldrich	RES1151B-B7
	P(IV) solução metálica, 5 mL
Traga o seguinte para 1 L com ddH2O
NaEDTA· 2HO	Sigma-Aldrich	E6635
FeCl3 · 6H2O	Sigma-Aldrich	236489
MnCl2· 4H2O	Baker	2540
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152
CoCl2· 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Na2MoO4· 2H2O	Baker	3764
Cyanobacteria BG-11 50X Solução de água doce	Sigma-Aldrich	C3061-500mL