Method Article

Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença1. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influenciar a composição bacteriana e a diversidade da microbiota intestinal. Assim, as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana têm atraído a atenção crescente da pesquisa4,5,6,7,8,9.

É difícil avaliar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana in vivo devido à bioética e restrições econômicas. Por exemplo, experimentos que investigam as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana não podem ser realizados sem a permissão da administração de alimentos e drogas, e o recrutamento de voluntários é caro. Conseqüentemente, os modelos animais são usados frequentemente para tais investigações. No entanto, o uso de modelos animais é limitado devido a diferentes composições de microbiota e diversidade em comunidades animais vs. humanas associadas. Um método alternativo in vitro para explorar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana é através do uso de experimentos de cultura de lotes.

Os exopolissacarídeos (EPSs) são prebióticos que contribuem significativamente para a manutenção da saúde humana10. Os EPSS distintos que consistem em composições e em estruturas diferentes do monossacarídeos podem expor funções distintas. As análises prévias determinaram a composição de BIF EPSs, que são o xenobiótico representativo apontado no estudo atual11. No entanto, os efeitos metabólicos associados ao hospedeiro não foram considerados em relação à composição e diversidade do EPS.

O protocolo descrito aqui usa a microbiota fecal de 12 voluntários para fermentar bif EPSs. A cromatografia de camada fina (TLC), o sequenciamento do gene 16S rRNA de alta taxa de transferência e a cromatografia gasosa (GC) são então usadas em combinação para investigar as interações entre EPSs e microbiota intestinal humana. As vantagens distintas deste protocolo em comparação com experimentos in vivo são seu baixo custo e evitação de efeitos interferentes do metabolismo do hospedeiro. Além disso, o protocolo descrito pode ser utilizado em outros estudos que investiguem interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana.

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Protocol

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Este protocolo segue as directrizes do Comitê de éticas da Universidade de Hunan da ciência e da engenharia (Hunan, China), e da Universidade de Zhejiang GongShang (Zhejiang, China).

1. preparação de bactérias

  1. Preparação do caldo médio Bifidobacterium
    1. Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: extrato de carne, 5 g/L; extrato de levedura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glicose, 10 g/L; K2HPO4, 2, 4 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solução salina, 40 mL (CaCl2. 2h2O, 0,25 g/L; KH2po4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); e resazurina, 0,4 mL (2,5 mg/L). Ajuste o pH a 6,8 com NaOH de 2 M.
    2. Autoclave a 121 ° c por 15 min e permitir que o caldo esfrie até a temperatura ambiente (RT) em condições anaeróbias (10% H2, 10% co2, 80% N2). Adicionar filtro-esterilizado cysteine-HCl (0,5 g/L) e mupirocina (5 mg/L) para o meio.
  2. Adicionar uma alíquota (50 μL) de Bifidobacterium longum congelado a um tubo de cultura com 5 ml de caldo médio Bifidobacterium em condições anaeróbias, em seguida, cultura em uma incubadora anaeróbia para 24 h a 37 ° c.

2. preparação de EPSs bifidobacterianos

  1. Preparação do meio de agar PYG
    1. Combine o seguinte: peptona, 20 g/L; extrato de levedura, 10 g/L; glicose, 5 g/L; NaCl, 0, 8 g/L; CaCl2, 0, 8 g/L; MgSO4· 7h2O, 0, 8 g/L; K2HPO4, 0, 4 g/L; KH2po4, 0, 4 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Ajuste o pH para 7,2 usando NaOH de 10 M.
    2. Autoclave a mídia em 121 ° c por 15 min e arrefecer a ~ 50 ° c. Em seguida, por 1 L de meio, adicione 0,5 mL de solução de vitamina K1 com filtro esterilizado (1 g de vitamina k1 dissolvida em 99 mL de etanol a 99%), 5 ml de solução de hemina (0,5 g de hemina dissolvida em 1 ml de NaOH 1 mol/L , em seguida, trouxe até 100 mL com água destilada), e 0,5 g de cisteína-HCl.
    3. Antes de derramar as placas PYG, Adicionar filtro-esterilizado 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-GAL, 0, 6 g/L), LiCl · 3H2o (5,7 g/l) e mupirocina (5 mg/l) para o meio.
      Nota: X-GAL e LiCl. 3H2o permitem a identificação de colônias de B. longum em placas através de alterações de coloração.
  2. Inocular 20 μL de estirpes de B. longum (passo 1,2) para placas de PYG e colocar numa incubadora anaeróbia a 37 ° c por 72 h.
  3. Colete colônias bacterianas mucoides das placas PYG usando uma colher de pesagem e, em seguida, Ressuspender completamente em 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) usando um oscilador vortex.
    Nota: as misturas bacterianas e EPS devem ser rerespirados completamente por vortexing ou pipetagem para cima e para baixo repetidamente até que as fibras sejam completamente dissolvidas em PBS.
  4. Centrifugar a suspensão a 6.000 x g durante 5 min.
  5. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para um novo tubo de centrifugação e misture completamente com três volumes de etanol 99% frio por inversão repetida e mistura.
  6. Centrifugue a mistura a 6.000 x g durante 5 min e retire completamente os sobrenadantes.
  7. Remova os precipitados dos tubos de centrifugação raspando e secando os extratos do EPS durante a noite usando um vácuo da velocidade.

3. preparação do meio de fermentação

  1. Preparação do meio de cultura básico VI
    1. Combine o seguinte: peptona, 3 g/L; triptona, 3 g/L; extrato de levedura, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; sais biliares n º 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4,5 g/L; 1 mL de Tween 80; CaCl2. 6h2O, 0,2 g/L; KH2po4, 0,4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0, 1 g/L; e NiCl2· 6h2o, 0, 92 g/L. ajustar o pH para 6,5 com 1 M HCL.
    2. Prepare o haemin e o cisteína como feito na seção 2,1 e adicione após o autoclavagem e refrigerar.
  2. Prepare mídia de cultura que contenha diferentes fontes de carbono com uma mídia base VI. Antes da autoclavagem, adicione 8 g/L de fibras de BIF EPS ao VI médio, compreendendo o grupo VI_Bif. Além disso, adicione 8 g/L de amido ao meio VI para representar o grupo VI_Starch. Finalmente, o VI médio sem adição de uma fonte de carbono é usado como o controle (grupo VI).
    Nota: o bif EPS e o amido são dissolvidos primeiramente na água quente usando um agitador magnético, misturado então com o meio preparado de VI.
  3. Autoclave todos os meios a 121 ° c por 15 min e permitem esfriar a RT.
  4. Transfira uma subamostra (5 mL) de cada meio para tubos de cultura em uma incubadora anaeróbia e armazene os suportes restantes a 4 ° c.

4. preparação fecal humana da amostra

  1. Colete amostras fecais frescas imediatamente após a defecação fresca de voluntários humanos adultos saudáveis usando recipientes de fezes e, subsequentemente, use para preparação de chorume.
    Nota: antes da coleta da amostra, todos os voluntários devem ser rastreados para garantir a não recepção de antibióticos, probióticos ou tratamentos prebióticos por pelo menos 3 meses antes de doar amostras. Além disso, todos os doadores devem fornecer consentimento informado e por escrito.
  2. Transfira uma amostra fecal fresca (1 g) a 10 mL do PBS anaeróbio de 0,1 M (pH 7,0) em copos de vidro, a seguir use as hastes de vidro para preparar uma pasta de 10% (w/v).
  3. Use uma peneira de 0,4 mM para filtrar a pasta fecal. Em seguida, use uma subamostra da pasta filtrada para inocular experimentos de fermentação de cultura em lote e armazene o restante em-80 ° c para análises adicionais.
    Nota: as etapas 4.2 – 4.3 são conduzidas em uma câmara anaeróbia.

5. fermentação em lote in vitro

  1. Adicionar pasta fecal filtrada (500 μL) ao meio de fermentação preparado na etapa 3,2 dentro de uma câmara anaeróbia, em seguida, incubar a 37 ° c.
  2. Colete 2 mL de amostras fermentadas a 24 h e 48 h na câmara anaeróbia e depois Centrifugue fora da câmara a 6.000 x g durante 3 min.
  3. Transfira com cuidado os sobrenadantes a um tubo de centrifugação novo que seja usado para a análise da degradação do polissacarídeo e as medidas dos ácidos gordos da curto-corrente (scfas).
  4. Armazene as pelotas da centrifugação em-80 ° c e use subseqüentemente para a extração genomic bacteriana do ADN.

6. degradação do EPS pela microbiota fecal humana

  1. Carregue 0,2 μL de sobrenadantes fermentados em placas de alumínio pré-revestidas de sílica gel-60 TLC e seque com um secador de cabelo.
  2. Desenvolver as placas em 20 mL de um ácido fórmico/n-butanol/água (6:4:1, v:v: v) solução e secar usando um secador de cabelo.
  3. Mergulhe as placas no reagente de orcinol para tingir, em seguida, seque usando um secador de cabelo.
    1. Prepare reagentes de orcinol dissolvendo 900 mg de Lichenol em 25 mL de água destilada, acrescentando 375 mL de etanol. Subsequentemente, o ácido sulfúrico concentrado deve ser lentamente adicionado e a solução completamente misturada.
  4. Placas de calor a 120 ° c por 3 min em um forno de cozimento e avaliar a degradação do EPS através da medição de bandas TLC.

7. efeitos do EPS na microbiota intestinal humana

  1. Congelar-degelo as amostras fecais originais preparadas na etapa 4,3 e amostras fermentadas preparadas na etapa 5,4.
  2. Extraia o ADN genomic bacteriano (gDNA) de todas as amostras usando um jogo genomic bacteriano da extração do ADN do tamborete que segue as instruções do fabricante.
  3. Determine as concentrações de DNA, integridades e distribuições de tamanho usando um microespectrofotômetro e eletroforese em gel de agar.
  4. Conduza o PCR de genes bacterianos do rRNA 16S do gDNA extraído usando os seguintes primers para diante e reversos previamente descritos12:
    -primer Forward (código de barras primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
    -primer reverso (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    Use as seguintes condições de ciclador térmico:
    1. 94 ° c por 5 min.
    2. 94 ° c por 30 s.
    3. 55 ° c por 30 s.
    4. 72 ° c por 1 min.
    5. Repita 2 – 4 para 35 ciclos
    6. 72 ° c por 5 min.
    7. 4 ° c segure até a remoção do termociclador.
  5. Conduza o sequenciamento de alta produtividade de produtos de PCR em uma empresa de sequenciamento de DNA usando análise de comunidade microbiana de alto débito.
  6. Obtenha sequências limpas e de alta qualidade usando o pipeline de análise quantitativa de insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME)13.
  7. Definir unidades taxonômicas operacionais (OTUs) para sequências de genes rRNA 16S com maior que 97% de similaridade de nucleotídeo utilizando ferramentas de Bioinformática como o Mothur Software Suite14.
  8. Escolha uma sequência representativa de cada OTU e use o classificador RDP junto com o banco de dados taxonômico SILVA para classificar as sequências representativas15.
  9. Calcule a cobertura de Good, as métricas de diversidade alfa (incluindo o índice de Simpson e Shannon) e a riqueza (número observado de OTUs) usando as ferramentas de Bioinformática16.

8. efeitos do EPS na produção de SCFA por microbiota intestinal humana

  1. Adicionar sobrenadantes fermentados (1 mL) preparados na etapa 5,3 a 2 mL de tubos de centrifugação.
  2. Adicione 0,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) a cada uma das amostras e misture cuidadosamente as soluções por vortexing.
  3. Centrifugue as misturas a 13.000 x g durante 20 min e transfira os sobrenadantes para tubos frescos.
  4. Concomitantemente, prepare soluções de 120 mM de ácido acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico. Em seguida, adicione 1 mL de cada ácido preparado a 1,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) e utilize como cocktails padrão.
  5. Filtre as amostras usando uma membrana de 0,22 μM.
  6. Detecte concentrações de scfa utilizando cromatografia gasosa de alta performance de acordo com os protocolos descritos anteriormente11,17.
    Nota: uma coluna de InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) é utilizada para cromatografia gasosa (GC). As concentrações de SCFA são então quantificadas com base em áreas de pico usando o método padrão interno de ponto único no pacote de software GC Solution.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A produção de EPS mucoide pode ser observada em culturas de B. longum em placas de PYG após incubação anaeróbia por 72 h (Figura 1a). A centrifugação de raspagens de cultura, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS celulose-like (Figura 1b). EPS secos e amido solúvel foram então utilizados como fontes de carbono para culturas de fermentação. O TLC foi utilizado para análise de separação e pureza de oligosacáridos devido ...

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Discussion

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Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos21, onde o mi...

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm conflitos de interesse. Os números foram citados em Yin et al. o 11.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de ciência da natureza da China (no. 31741109), a Fundação de ciência natural de Hunan (no. 2018JJ3200), e o programa de construção da disciplina característica aplicada na Universidade de ciência e engenharia de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) pela sua assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 µ m filtros de membranaMilliporeSLGP033RBUso para filtrar amostras
Peneira de 0,4 mm ThermoFischer308080-99-1Uso para preparar amostras fecais humanas
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-gal)SolarbioX1010Uso para preparar placa de cor
AcéticoSigma-Aldrich71251Amostra padrão para ágar SCFA
SolarbioYZ-1012214O componente da
câmara anaeróbicaElectrotek AW 400SGCultura de bactérias e fermentação
AutoclaveSANYOMLS-3750Uso para autoclave
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178O componente do forno de
cozimentoShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AUse para aquecer e assar
Extrato de carneSolarbioG8270O componente do meio
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™bactéria
Sais biliaresSolarbioYZ-1071304O componente do meio
butíricoSigma-Aldrich19215Amostra padrão para SCFA
CaCl2SolarbioC7250Solução salina de coluna
capilarSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm &vezes; 30 m &vezes; 0,25 μ m)Usado para detecção de SCFA
Caseína PeptonaSigma-Aldrich39396O componente do meio
CentrífugaThermo ScientificSorvall ST 8Uso para centrifugação
CoSO4.7H2OSolarbioC7490O componente do meio
CuSO4.5H2OSolarbio203165O componente do meio
Cisteína-HClSolarbioL1550O componente do meio
EtanolSigma-AldrichE7023Use para preparar vitamina K < sub > 1 < / sub>
FeSO< sub > 4 < / sub>.7H < sub > 2 < / sub>OSolarbioYZ-111614O componente do ácido
fórmicoSigma-Aldrich399388Usado para
TLC Cromatografia gasosaShimadzu CorporationGC-2010 PlusUsado para detecção de SCFA
Copo de vidroFisher ScientificFB10050Usado para preparação de pasta
GlicoseSolarbioG8760O componente do meio
HaeminSolarbioH8130O componente do HCl médio
Sigma-Aldrich30721Solução básica usada para ajustar o pH dos tampões
IsobutíricoSigma-Aldrich46935-UAmostra padrão para SCFA
Ácidos isovaléricosSigma-Aldrich129542Amostra padrão para SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Solução salina de meio
KClSolarbioP9921O componente do meio
KH2PO4SolarbioP7392Solução salina do meio
LiCl.3H2OSolarbioC8380Use para preparar a placa de cor
Extrato de carneSigma-Aldrich-Aldrich70164O componente do meio
Ácido metafosfóricoSigma-AldrichB7350Amostra padrão para SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160O componente do meio
MgSO4.7H2OSolarbioM8300Solução salina do meio
MISEQIlluminaMiSeq 300PE sequenciamentoDNA
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Solução salina do meio
MupirocinaSolarbioYZ-1448901Antibiótico
NaClSolarbioYZ-100376Solução salina do meio
NaHCO3Sigma-Aldrich792519 Soluçãosalina do meio
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Determinar as concentrações de DNA
NaOHSigma-Aldrich30620Solução básica usada para ajustar o pH dos tampões
n-butanolChemSpider71-36-3Usado para TLC
NiCl2Solarbio746460O componente do meio
OrcinolSigma-Aldrich447420Usado para preparar reagentes
de orcinolAmostra padrão PropionicSigma-Aldrich94425para SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Extrato de DNA genômico bacteriano
Pó PBS pronto para usoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Usado para preparar a suspensão lipídica
ResazurinSolarbioR8150Equipamento Anaeróbico
Concentrador de Velocidade a VácuoLABCONCOCentriVapUso para preparar EPSs
AmidoSolarbioYZ-140602Uso para a fonte de carbono
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich150692Usado para preparar reagentes
T100 PCRBIO-RADPCR amplificação
TLC folhas de alumínioMerckMillipore116835Usado para TLC
Tripticase PeptonaSigma-AldrichZ699209O componente do meio
TriptonaSigma-AldrichT7293O componente do meio
Tween 80SolarbioT8360Solução salina do meio
ValericSigma-Aldrich75054Amostra padrão para SCFA
Vitamina K < sub > 1< / sub >Sigma-AldrichV3501O componente do
oscilador de vórticeIndústrias científicasVortex.Genie2Use para vórtice
Extrato de leveduraSigma-AldrichY1625O componente do meio
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251O componente do meio
média médio média médio de do sistemade orcinol 1861096 médio

References

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