Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Summary

Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.

Abstract

Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.

Introduction

A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença¹. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão^2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influ....

Protocol

Este protocolo segue as directrizes do Comitê de éticas da Universidade de Hunan da ciência e da engenharia (Hunan, China), e da Universidade de Zhejiang GongShang (Zhejiang, China).

1. preparação de bactérias

1. Preparação do caldo médio Bifidobacterium
   1. Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: extrato de carne, 5 g/L; extrato de levedura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glicose, 10 g/L; K₂HPO₄, 2, 4 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solução salina, 40 mL (CaCl₂. 2h<....

Results

A produção de EPS mucoide pode ser observada em culturas de B. longum em placas de PYG após incubação anaeróbia por 72 h (Figura 1a). A centrifugação de raspagens de cultura, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS celulose-like (Figura 1b). EPS secos e amido solúvel foram então utilizados como fontes de carbono para culturas de fermentação. O TLC foi utilizado para análise de separação e pureza de oligosacáridos devido .......

Discussion

Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal^19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos²¹, onde o mi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 µ m filtros de membrana	Millipore	SLGP033RB	Uso para filtrar amostras
Peneira de 0,4 mm Thermo	Fischer	308080-99-1	Uso para preparar amostras fecais humanas
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-gal)	Solarbio	X1010	Uso para preparar placa de cor
Acético	Sigma-Aldrich	71251	Amostra padrão para ágar SCFA
	Solarbio	YZ-1012214	O componente da
câmara anaeróbica	Electrotek	AW 400SG	Cultura de bactérias e fermentação
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Uso para autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	O componente do forno de
cozimento	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use para aquecer e assar
Extrato de carne	Solarbio	G8270	O componente do meio
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	bactéria
Sais biliares	Solarbio	YZ-1071304	O componente do meio
butírico	Sigma-Aldrich	19215	Amostra padrão para SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Solução salina de coluna
capilar	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm &vezes; 30 m &vezes; 0,25 μ m)	Usado para detecção de SCFA
Caseína Peptona	Sigma-Aldrich	39396	O componente do meio
Centrífuga	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Uso para centrifugação
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	O componente do meio
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	O componente do meio
Cisteína-HCl	Solarbio	L1550	O componente do meio
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use para preparar vitamina K < sub > 1 < / sub>
FeSO< sub > 4 < / sub>.7H < sub > 2 < / sub>O	Solarbio	YZ-111614	O componente do ácido
fórmico	Sigma-Aldrich	399388	Usado para
TLC Cromatografia gasosa	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Usado para detecção de SCFA
Copo de vidro	Fisher Scientific	FB10050	Usado para preparação de pasta
Glicose	Solarbio	G8760	O componente do meio
Haemin	Solarbio	H8130	O componente do HCl médio
	Sigma-Aldrich	30721	Solução básica usada para ajustar o pH dos tampões
Isobutírico	Sigma-Aldrich	46935-U	Amostra padrão para SCFA
Ácidos isovaléricos	Sigma-Aldrich	129542	Amostra padrão para SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Solução salina de meio
KCl	Solarbio	P9921	O componente do meio
KH2PO4	Solarbio	P7392	Solução salina do meio
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use para preparar a placa de cor
Extrato de carne	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	O componente do meio
Ácido metafosfórico	Sigma-Aldrich	B7350	Amostra padrão para SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	O componente do meio
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Solução salina do meio
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE sequenciamento	DNA
MnSO4. H20	Sigma-Aldrich	M8179	Solução salina do meio
Mupirocina	Solarbio	YZ-1448901	Antibiótico
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Solução salina do meio
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519 Solução	salina do meio
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determinar as concentrações de DNA
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Solução básica usada para ajustar o pH dos tampões
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Usado para TLC
NiCl2	Solarbio	746460	O componente do meio
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Usado para preparar reagentes
de orcinolAmostra padrão Propionic	Sigma-Aldrich	94425	para SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extrato de DNA genômico bacteriano
Pó PBS pronto para uso	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Usado para preparar a suspensão lipídica
Resazurin	Solarbio	R8150	Equipamento Anaeróbico
Concentrador de Velocidade a Vácuo	LABCONCO	CentriVap	Uso para preparar EPSs
Amido	Solarbio	YZ-140602	Uso para a fonte de carbono
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	150692	Usado para preparar reagentes
T100 PCR	BIO-RAD		PCR amplificação
TLC folhas de alumínio	MerckMillipore	116835	Usado para TLC
Tripticase Peptona	Sigma-Aldrich	Z699209	O componente do meio
Triptona	Sigma-Aldrich	T7293	O componente do meio
Tween 80	Solarbio	T8360	Solução salina do meio
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Amostra padrão para SCFA
Vitamina K < sub > 1< / sub >	Sigma-Aldrich	V3501	O componente do
oscilador de vórtice	Indústrias científicas	Vortex.Genie2	Use para vórtice
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	Y1625	O componente do meio
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	O componente do meio