Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Resumo

A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.

Introdução

Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas¹. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade². A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resi....

Protocolo

Camundongos experimentais foram criados e mantidos em nossa colônia de camundongos. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati.

1. preparação de CFSE rotulados timócitos apoptóticos

1. Eutanizar dois ratos C57/B6 ingênuos por inalação de CO₂ por 10 min e dissecar para abrir a cavidade torácica, remover (puxar) o Timo com fórceps curvo de ponta fina no prato de Petri de cultura de tecido contendo 10 ml de meio RPMI1640.
2. Obtenha a única suspensão da pilha moendo o Timo inteiro de encontro a duas extremid....

Resultados

Análise do engulfment macrófago-negociado peritoneal de thymocytes apoptóticas. Macrófagos peritoneais e células apoptóticas foram preparadas e cocultivadas conforme descrito no protocolo. Os macrófagos foram destacados e corados com anticorpo CD11b conjugado PE por 20 min no gelo. Os macrófagos foram então lavados e processados em um citometro de fluxo. Como visto, não há nenhum macrófago positivo de CFSE no quadrante inferior direito quando nenhuma célula apoptótica foi adicionada na cultura (

Discussão

A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares¹⁷. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado¹⁸. Por outro lado, a morte celular necrótica libera sinai.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão de lise de reconhecimento	GIBCO	A10492
Anexina V / 7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anticorpo Anti-Mer	R & D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0,5 mM)	GIBCO	15575-020
Tubos FACS	BD Biosciences	352017
Lâminas foscas	Fisher Scientific	12-552-343
Soro de cavalo (inativado pelo calor)	Invitrogen	26050088
Lidocaína	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% de tampão em 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Adicione 214,3 ml de DMSO em 100mg para fazer uma solução de meia de 1mM
Meio de Tioglicolato Modificado por Brewer	BD Biosciences	243010	Prepare o tampão de tioglicolato a 3% em 1&agudo; PBS, autoclavado e armazenado no escuro por 3 meses.