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Artigo de método

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

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DOI:

10.3791/59734

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29 de maio de 2019

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1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Resumo

Os adutos do DNA e as bases oxidadas do ADN são exemplos das lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrophilic, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo. Dentre as nucleobases oxidadas, a mais estudada é a 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo), um biomarcador de dano base oxidativamente induzido no DNA. Os aldeídos e os epoxyaldehydes resultantes do processo da peroxidação do lipido são as moléculas substituição capazes de dar forma aos adutos exocíclicas mutagénicas do ADN, tais como os adutos 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine do eteno (1,n2- εdGuo) e 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que foram sugeridos como biomarcadores potenciais na fisiopatologia da inflamação. Métodos seletivos e sensíveis para sua quantificação no DNA são necessários para o desenvolvimento de estratégias preventivas para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas). Entre os métodos sensíveis disponíveis para sua detecção (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detectores de espectrometria de massas eletroquímicas ou em tandem, ensaio cometa, imunoensaios, 32P-pós-rotulagem), os mais seletivos são aqueles baseados em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-ESI-MS/MS). A seletividade é uma vantagem essencial na análise de amostras biológicas complexas e a HPLC-ESI-MS/MS evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Também auxilia na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente.

Nós apresentamos aqui métodos sensíveis, exatos e precisos da HPLC-ESI-MS/MS validados que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo e 1,n2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de A/J para a avaliação dos efeitos da exposição ambiental PM2,5 .

Introdução

Algumas espécies reativas de oxigênio (ROS) são capazes de oxidar ligações duplas de carbono de bases de DNA e alguns carbonos na fração desoxirribose, gerando bases oxidadas e quebras de fio de DNA1. Como uma molécula carregada negativamente rica em átomos de nitrogênio e oxigênio, o DNA também é um alvo para grupos eletrofílicos que reagem covalentemente com os sítios nucleofílicos (nitrogênio e oxigênio), dando produtos que são chamados de adutos de DNA2. Assim, os adutos do ADN e as bases oxidadas do ADN são exemplos de lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrofílicas, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo1, o 2. Embora as bases modificadas do ADN possam ser removidas do ADN pela base ou pelo reparo da excisão do nucleotide (BER ou NER), a indução de um desequilíbrio entre a geração e a remoção de lesões do ADN em favor do anterior conduz a um aumento líquido de seus níveis no tempo estipulado do ADN3 < /C5 >. Os resultados são o aumento das taxas de mutação do DNA, a redução da expressão gênica e a diminuição da atividade protéica2,4,5,6,7, efeitos que estão intimamente relacionados com a desenvolvimento de doenças. As mutações do DNA podem afetar diversas funções celulares, como sinalização celular, ciclo celular, integridade do genoma, estabilidade do telômero, epigenome, estrutura da cromatina, splicing de RNA, homeostase proteica, metabolismo, apoptose e diferenciação celular8 ,9. Estratégias para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas) passam pelo conhecimento das fontes de mutação, entre elas, as lesões do DNA e suas causas.

ROS gerados endogenamente em excesso, devido à exposição ao poluente, inflamação persistente, fisiopatologia da doença (por exemplo, diabetes), etc., são causas importantes de dano da biomolécula, incluindo o DNA e o dano lipídico1. Como exemplo, o radical hidroxila altamente reativo (OH) formado a partir de H2O2 redução por íons metálicos de transição (FE2 +,+ +) oxida as bases de DNA, a fração de açúcar de DNA e os ácidos graxos poliinsaturados em controle de difusão taxas de10. Entre os 80 já caracterizados nucleobases oxidadas3, o mais estudado é 8-oxo-7,8-diidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), uma lesão que é capaz de induzir transversões gt em células mamíferas10,11. É formado pela oxidação eletrônica mono da guanina, ou pelo ataque de oxigênio radical hidroxila ou singlet de guanina no DNA1. Os ácidos graxos poliinsaturados são outros alvos importantes de oxidantes altamente reativos, como •Oh, que iniciam o processo de peroxidação lipídica1,12. Ele dá origem a hidroperóxidos de ácidos graxos que podem se decompor a aldeídos eletrofílicos e epoxialdeídos, tais como malondialdeído, 4-hidroxi-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4, 5-epóxi-(2E)-decenal, hexenal, acroleína, crotonaldeído, que são capaz de formar adutos de DNA exocílicos mutagénicos, como os adutos de malondialdeído, propano ou eteno1,12,13. Os adutos de eteno 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo , Figura 1) e 1,n6-eteno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado, Figura 1 ) têm sido sugeridas como potenciais biomarcadores na fisiopatologia da inflamação14,15.

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Figura 1. Estruturas químicas das lesões de DNA quantificadas no presente estudo. dR = 2 ́-desoxirribose. Este número foi modificado de Oliveira et al.34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudos realizados no início da década de 1980 permitiram a detecção sensível de 8-oxodGuo por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção eletroquímica (HPLC-ECD). A quantificação de 8-oxodguo por HPLC-ECD em diversos sistemas biológicos sujeitados às circunstâncias oxidantes conduziu ao Recognition de 8-oxodguo como um biomarcador de dano de base oxidativamente induzido no ADN1,16. Embora robusto e permitindo a quantificação de 8-oxodguo na escala baixa de fmol17, as medidas do HPLC-ECD confiam na exatidão do tempo da retenção do analito para a identificação do analito e na definição da cromatografia para evitar interferências de outros constituintes da amostra. Como a detecção eletroquímica requer o uso de sal (por exemplo, fosfato de potássio, acetato de sódio) na fase móvel, a manutenção de condições analíticas adequadas precisa de rotina de coluna e tempo de limpeza do equipamento.

Alternativamente, o uso do DNA bacteriano da enzima de reparo do ADN glicosilase do formamidopyrimidine (fpg) e, mais tarde, o glicolisase 1 do humano 8-oxoguanine (hOGG1), para a deteção e a remoção de 8 oxogua do ADN, emergiu como uma maneira para a indução do lábil do alcalóide do ADN Sites. Os locais lábeis do alcalóide são convertidos às rupturas da costa do ADN e permitem a quantificação indireta muito elevada sensível de 8 oxoGua pela electroforese alcalina do gel da única pilha ("ensaio do cometa"). A alta sensibilidade e a realização das análises sem a necessidade de extração de DNA celular são as principais vantagens deste tipo de ensaio. Dá os níveis os mais baixos do estado estacionário de 8 oxoGua no ADN, tipicamente 7-10 vezes mais baixos do que os níveis obtidos por métodos bioanalíticos baseados no HPLC. No entanto, é uma medida indireta de 8-oxogua e algumas desvantagens são a falta de especificidade ou a eficiência desconhecida das enzimas de reparo utilizadas1,16,18.

Os imunoensaios são outro conjunto de métodos utilizados para a detecção de 8-oxoGua1 e ADUTOS de DNA exocídrico, como 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo12. Apesar da sensibilidade, uma lacuna do uso de anticorpos para a detecção de lesões de DNA é a falta de especificidade devido à reatividade cruzada a outros componentes de amostras biológicas, incluindo as bases normais de DNA1,12. Os adutos exocílicos de DNA, incluindo 1, n6-DAdo e 1, n2-dguo, também podem ser detectados e quantificados por ensaios altamente sensíveis de 32P-postetiquetagem12. A sensibilidade elevada de 32P-postrotulagem permite o uso de quantidades muito pequenas de ADN (por exemplo, 10 μg) para a deteção de aproximadamente 1 aduto por 1010 bases normais19. No entanto, o uso de radioquímicos, a falta de especificidade química e a baixa acurácia são algumas desvantagens19,20.

Uma limitação compartilhada dos métodos citados acima é a baixa seletividade ou especificidade para a detecção das moléculas desejadas. Nesse cenário, a HPLC acoplada à espectrometria de massas em tandem de ionização por electrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS3) evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva 1. º , 19 anos de , 20. vantagens dos métodos de HPLC-ESI-MS/MS são a sensibilidade (tipicamente na baixa escala do fmol) e a especificidade elevada fornecida por i) a separação cromatográfica, II) o teste padrão característico e conhecido da fragmentação da molécula dentro da massa Câmara de colisão do espectrómetro, e III) a medida exata da massa selecionada para carregar a relação (m/z) no modo múltiplo da monitoração da reação1,19. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Auxilia também na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente1,12,19,20.

Vários métodos baseados em HPLC-ESI-MS/MS têm sido utilizados para quantificação de 8-oxodguo, 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo em DNA extraído de diferentes amostras biológicas12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Partículas finas (PM2,5) transportar produtos químicos orgânicos e inorgânicos, tais como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHS), Nitro-PAHS, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, quinolinas, metais e íons solúveis em água, que podem induzir inflamação e estresse oxidativo, condições que favorecem a ocorrência de danos biomoléculas e doença30,31,32,33. Nós apresentamos aqui métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, de 1, den6-dAdo e de 1, den2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de a/J para a avaliação do efeitos do ambiente PM2,5 exposição34.

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Protocolo

Camundongos a/J machos de quatro semanas de idade, sem patógenos específicos, foram obtidos do centro reprodutor de animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, e foram tratados de acordo com o Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de São Paulo (protocolo n º 1310/09).

1. coleção de tecidos de camundongos

  1. Anestesie o animal com xilazina e cetamina. Para um rato com 30 g de peso corporal, injete uma solução (não mais de 2 mL) contendo 2,63 mg de cetamina e 0,38 mg de xilazina, intraperitonealmente.
  2. Colete sangue (0,5-1,5 mL) para análises complementares (por exemplo, atividade enzimática antioxidante, níveis de malondialdeído).
  3. Raspar o cabelo abdominal da pélvis para o processo xifóide. Faça uma incisão em uma linha média vertical na área sem pêlos. Faça incisões em linhas laterais horizontais, a fim de expor os órgãos abdominais.
  4. Corte a aorta abdominal para promover o exsanguinação e para eutanizar o animal.
  5. Retire os tecidos de interesse (neste caso, fígado, rins e pulmões).
    1. Para remover o fígado, corte a veia cava inferior e a veia hepática Portal.
    2. Para remover os rins, seção as veias renais e artérias.
    3. Para remover os pulmões, faça uma incisão nas extremidades do diafragma e circunferência perto da parede torácica. Quebre as clavículas abrindo uma tesoura no interior da cavidade torácica. Corte o osso extern do processo xiphoide em direção à traquéia, a fim de expor os pulmões e o coração.
      1. Segure o pulmão com uma pinça, seção da traquéia e os ligamentos ao redor dos pulmões. Retire cuidadosamente os pulmões bloco mais coração. Para remover os pulmões do bloco, segure o coração com uma pinça e corte todos os vasos em sua base.
  6. Lave os tecidos isolados imediatamente em solução salina fria (0,9% NaCl), transfira para tubos criogênicos e mergulhe imediatamente os tubos em nitrogênio líquido. Depois de completar o trabalho, guarde os tubos a-80 ° c.
    Cuidado: o nitrogênio líquido em contato direto com a pele, mucosa ou olhos provoca queimaduras. Use a proteção individual apropriada para evitar o contato. Trabalhe em um laboratório ventilado para evitar a asfixia devido ao vapor de nitrogênio líquido.

2. extração de DNA

Nota: o método de extração de DNA foi modificado de Loureiro et al. (2009)35 para permitir a análise das lesões estudadas.

  1. Transfira os tubos contendo os tecidos para o gelo seco.
  2. Use uma placa de cultura colocada no gelo como uma base para cortar um pedaço de tecido com um bisturi. Peso 1 g para uso imediato. O tecido remanescente deve ser mantido em gelo seco até que retorne ao armazenamento em-80 ° c.
    Nota: é importante evitar o descongelar do tecido remanescente para evitar a formação de artefatos se forem necessárias repetições das análises.
  3. A cada 1 g de tecido em 50 mL tampados tubos, adicionar 10 mL da solução de lise celular comercial contendo 0,5 mM deferoxamina e manter no gelo.
    Nota: Adicionar deferoxamina ao volume de solução para utilização imediata. Para cada 100 mL de solução, adicione 0, 328 g do sal de mesilato de deferoxamina.
  4. Homogeneizar os tecidos usando um homogeneizador de tecido até que uma solução homogênea sem fragmentos de tecido é obtida. Mantenha o tubo frio (no gelo) durante a homogeneização. Use uma velocidade baixa para evitar o aquecimento.
  5. Adicionar 150 μL de solução de proteinase K (20 mg/mL) a cada amostra homogeneizada. Agitar os tubos por inversão e mantê-los à temperatura ambiente durante a noite.
  6. Adicionar 40 μL de solução de ribonuclease A (15 mg/mL), agitar por inversão e manter os tubos à temperatura ambiente durante 2 h.
    Nota: Prepare A solução de ribonuclease A em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 5,2 para evitar a precipitação. Aqueça a solução a 100 ° c durante 15 minutos antes de utilizar para obter uma solução livre de desoxirribonuclease.
  7. Adicione 5 mL da solução comercial da precipitação da proteína, vortex vigorously, e centrifugue em 2.000 x g, 4 ° c, por 10 minutos.
  8. Transfira os sobrenadantes para 50 mL de tubos tampados contendo 10 mL de isopropanol frio. Inverta os tubos suavemente várias vezes até a observação do DNA precipitado.
    Nota: o protocolo pode ser pausado aqui, mantendo os tubos a-20 ° c.
  9. Colete o DNA precipitado usando uma pipeta Pasteur fechada no final. Transferi-lo para tubos contendo 4 mL de tampão Tris de 10 mM, 1 mM de deferoxamina, pH 7,0.
  10. Depois que o DNA é completamente dissolvido na solução acima (não vórtice), adicione 4 mL de uma solução de clorofórmio contendo 4% de álcool isoamílico.
  11. Inverta os tubos 10 vezes para a homogeneização, centrifugador em 2.000 x g, 4 ° c, por 10 minutos para separar as duas fases, e transfere a fase superior a um tubo novo.
  12. Repita as etapas 2,10 e 2,11 mais duas vezes.
  13. Adicione 8 mL de etanol absoluto e 0,4 mL de uma solução de NaCl de 5 M para precipir o DNA.
  14. Colete novamente o DNA precipitado e transfira-o para 3 mL de etanol a 70%. Repita este passo mais uma vez.
  15. Descarte a solução de etanol com cautela e inverta os tubos contendo o DNA precipitado em papel absorvente para remover o excesso da solução.
  16. Adicionar 200 μL de solução de deferoxamina a 0,1 mM para dissolver o ADN. Manter os tubos a 4 ° c até que o DNA seja completamente rehidratado (durante a noite).
  17. Determine a concentração do ADN medindo a absorvância em 260 nanômetro e sua pureza pela relação da absorvência de 260/280 nanômetro.
    Nota: para determinar a concentração de ADN, transferir uma alíquota de 10 μL da solução de ADN para 990 μL de água ultrapura (diluição de 100X). Multiplicar a absorvência a 260 nm (deve ser inferior a 1) por 50 (50 μg/mL é a concentração de DNA de dupla encalhada quando a absorvência de uma solução de comprimento de 1 cm em 260 nm é 1) e pela diluição utilizada (100x) para obter a concentração de DNA em μg/mL. Se a absorvância a 260 nm estiver acima de 1, são necessárias diluições adicionais. A relação da absorvência de 260/280 nanômetro deve ser igual ou acima de 1,8 para a pureza desejada do ADN, mas as relações em torno de 1,6 são aceitáveis.

3. hidrólise enzimática de DNA

  1. Receita de análise
    1. 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo análises: para uma alíquota contendo 150 μg de DNA, adicionar 7,5 μL de 200 mm Tris/MgCl2 tampão (pH 7,4), 1,4 μL da solução padrão interna contendo 250 fmol/μL de [15N5 ] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo e 15 unidades de desoxirribonuclease I. Ajuste o volume final para 200 μl com água ultrapura, subtraindo os volumes de enzimas a serem utilizados na etapa 3.2.1.
    2. análises de 8-oxodGuo: para uma alíquota contendo 80 μg de DNA, adicione 3,8 μL de tampão Tris/MgCl2 de 200 mm (pH 7,4), 2 μl da solução padrão interna contendo 1.000 fmol/μL de [15N5] 8-oxodguo e 8 unidades de desoxirribonuclease I. Ajuste o volume final para 100 μL com água ultrapura, subtraindo os volumes de enzimas a serem utilizados na etapa 3.2.2.
      Nota: os padrões internos [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo e [15n5] 8-oxodguo podem ser sintetizada e caracterizados como descrita35,36,37. As quantidades dos padrões internos nos volumes de amostra injetados devem ser as mesmas dos volumes de curva de calibração injetada.
  2. Incubar as amostras a 37 ° c durante 1 hora.
    1. Amostras da etapa 3,1: Adicionar 0, 6 unidades de fosfodiesterase I de Crotalus atrox e 15 unidades de fosfatase alcalina da mucosa intestinal bovina.
    2. Amostras da etapa 3,2: Adicionar 0, 32 unidades de fosfodiesterase I de Crotalus atrox e 8 unidades de fosfatase alcalina da mucosa intestinal bovina.
  3. Incubar as amostras a 37 ° c durante 1 hora.
  4. Centrifugue as amostras a 14.000 x g durante 10 minutos.
  5. Amostras da etapa 3.2.1: separe 10 μL de cada amostra para quantificação dos desoxinucleosídeos (dAdo, dGuo) por HPLC/DAD (etapa 9). Sujeitar o volume residual à extração em fase sólida (passo 4).
  6. Amostras da etapa 3.2.2: Transfira 80 μL do sobrenadante para frascos para injetáveis de 50 μL (1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo) no sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reserve os restantes 20 μL para quantificação de dGuo por HPLC/DAD (passo 9).

4. extração em fase sólida para análises de 1, n6-εdado e 1, n2-εdguo

  1. Carregar os cartuchos (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) com 1 mL da seguinte sequência de soluções: 100% metanol, água deionizada, amostra de DNA hidrolisado, água deionizada, 10% metanol, 15% metanol e 100% metanol (a ser coletado).
    Nota: não deixe os cartuchos secos entre as aplicações das diferentes soluções. Adicione a próxima solução imediatamente após a solução anterior entrar no cartucho completamente.
  2. O vácuo seca a última fração de eluição (100% metanol) contendo os adutos.
  3. Ressuscitem as amostras secas em 83,1 μL de água ultrapura imediatamente antes da análise de HPLC-ESI-MS/MS, para obter 200 fmol de cada padrão interno em 50 μL de cada amostra.

5. preparação de curvas de calibração

  1. Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 300 a 6.000 fmol de 8-oxodGuo padrão, com a quantidade fixa de 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo em cada ponto. Considere esses valores no volume injetado.
  2. Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 1 a 40 fmol de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo, com montantes fixos de 200 fmol de [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1, N 2-εdguo em cada ponto. Considere esses valores no volume injetado.
  3. Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 0, 5-1 nmol de dGuo e de dAdo. Considere esses valores no volume injetado.

6. preparação de amostras de DNA para validação de método

  1. 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo análises: Adicionar quantidades variáveis de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo (por exemplo, 1,75, 8,75, 17,5 e 35 fmol) e quantidades fixas de [15N5] 1, N6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (350 fmol) a 100 μg de DNA de timo de bezerro e realizar a hidrólise enzimática conforme descrito na etapa 3. Processe as amostras em quadruplicate em dois dias diferentes. Use as amostras para a precisão do método e a avaliação de precisão.
    Nota: o volume final dos hidrolisados de DNA será de 200 μL (etapa 3), dos quais 10 μL serão separados para quantificação de desoxinucleosídeos por HPLC/DAD (etapa 9). A solução remanescente (190 μL) será submetida à extração em fase sólida (etapa 4), a fração seca será reressuscitada em 83,1 μL (etapa 4,3), a partir da qual 50 μL serão injetados no sistema HPLC-ESI-MS/MS. As quantidades de 1,n6-Εdado e 1,n2-εdguo injetado serão 1, 5, 10 e 20 fmol, com 200 fmol de [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n 2-εdguo em cada amostra.
  2. análises 8-oxodGuo: Adicione quantidades variadas de 8-oxodGuo (por exemplo, 734, 1.468, 2.938 e 4.408 fmol) e uma quantidade fixa de [15N5] 8-oxodguo (2.000 fmol) a 100 μg de DNA de timo de bezerro e realize a hidrólise enzimática conforme descrito na etapa 3. Processe as amostras em quadruplicate em dois dias diferentes. Use as amostras para a precisão do método e a avaliação de precisão.
    Nota: o volume final dos hidrolisados do ADN será 100 μl (etapa 3), de que 50 μL serão injetados no sistema de HPLC-ESI-MS/MS. As quantidades de 8-oxodGuo injetadas serão 367, 734, 1469, e 2204 fmol, com 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo em cada amostra.
  3. Adicionar 13,125 fmol de 1,N6-εdado (para obter 7,5 fmol no volume de injeção) e 35 fmol de 1,N2-εdguo (para obter 20 fmol no volume de injeção) para oito amostras de 100 μg de DNA de timo de bezerro.
    1. Acrescente as normas internas [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) a quatro das amostras. Proceder com a hidrólise de DNA e extração em fase sólida de todas as amostras.
    2. Acrescente as normas internas [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) às outras quatro amostras.
    3. Use as amostras para calcular a recuperação dos adutos da extração em fase sólida.

7. HPLC-ESI-MS/MS análise de 8-oxodGuo

  1. Inutilizando o padrão 8-oxodGuo no equipamento, ajuste os parâmetros ESI-MS/MS para a melhor deteção de seu teste padrão da fragmentação pela monitoração múltipla da reação (MRM): m/z 284 [m + h] + → m/z 168 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
    1. Use os mesmos parâmetros para a detecção de[15N5] 8-oxodguo : m/z 289 [m + h]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
      Nota: Utilize um equipamento equivalente ou superior ao equipamento utilizado neste trabalho (consulte a tabela de materiais). Os parâmetros ESI-MS/MS foram definidos conforme descrito na tabela 1.
  2. Filtrar (usando 0,22 μm membranas porosas) e degasify (usando um sonicator) todos os solventes de HPLC à base de água.
  3. Use as seguintes condições de cromatografia para as análises, montando o sistema como mostrado na Figura 2.
    Nota: a coluna a está ligada à bomba binária. Seu eluente é direcionado para detecção e desperdício de UV nos primeiros 16 min e de 32 para 46 min da cromatografia, como mostrado na Figura 2a. Esta é a coluna através da qual a amostra é eluída imediatamente após a injeção. A coluna B está conectada à bomba isocrática e ao espectrómetro de massa. Ele recebe o eluente da coluna A apenas no intervalo de 16-32 min, quando a válvula é comutada para a posição mostrada na Figura 2b. O interruptor da válvula permite a conexão entre as duas colunas, que são eluída pelo inclinação binário da bomba. A configuração mostrada na Figura 2b permite maior separação e estreitamento do pico. Adicionalmente, apenas a fração cromatográfica de interesse atinge o espectrómetro de massas, melhorando a sensibilidade e a seletividade.
    1. Elute a 50 x 2,0 mm i.d., 2,5 μm, coluna C18 (coluna A da Figura 2) acoplado a um cartucho de segurança c18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico (solvente a) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) a uma vazão de 150 μl/min e 25 ° c.
      1. Use o seguinte programa de gradiente para a bomba binária: de 0 a 25 min, 0-15% do solvente B; 25 a 28 min, 15-80% do solvente B; 28 a 31 min, 80% do solvente B; 31 a 33 min, 80-0% do solvente B; 33 a 46 min, 0% do solvente B.
      2. Use a válvula de comutação para direcionar os primeiros 16 min de eluente ao desperdício e a fração de 16-32 min para uma segunda coluna (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, C18, coluna B da Figura 2) conectada à fonte ESI e condicionada pela bomba isocrática com uma solução de 15% me thanol em água contendo 0,1% de ácido fórmico (150 μL/min).
        Nota: antes de usar o programa da válvula de comutação da etapa 7.3.1.2, verifique se os 8-oxodguo elutos padrão da primeira coluna após 16 min. É importante fechar a válvula em 32 min para usar o gradiente da bomba binária para eluir 8-oxodguo da segunda coluna e obter um pico cromatográfico afiado. A lesão 8-oxodguo elutos da segunda coluna em aproximadamente 36 min. variações do tempo de retenção do analito podem ocorrer dependendo da coluna e do equipamento utilizado. Adaptações do programa de gradiente de solvente HPLC podem ser necessárias.

figure-protocol-1
Figura 2. Sistema de duas colunas usadas para 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo) análises. A) configuração utilizada nos primeiros 16 min e de 32 a 46 min da cromatografia; B) configuração utilizada no intervalo de 16-32 min, permitindo maior separação e estreitamento do pico na coluna B antes da eluição à fonte ESI do espectrómetro de massa. Este número foi republicado de Oliveira et al.34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. HPLC-ESI-MS/MS análise de 1, n 6 -εdado e 1, n 2 -εdguo

  1. Inutilizando os padrões 1, n6-Εdado e 1, n2-εdguo no equipamento, defina os parâmetros ESI-MS/MS para a melhor detecção de seus padrões de fragmentação por monitoramento de reação múltipla (MRM): m/z 276 [m + h]+ → m/z 160 [m 2 '-deoxyribose + h]+ para detecção de 1,N6-εdado e m/z 292 [m + h]+ → m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + h ]+ para detecção de 1,N2-εdguo.
    1. Use os mesmos parâmetros para a detecção de [15n5] 1, n6-εdado (m/z 281 [m + h]+m/z → 165 [m-2 '-deoxyribose + H]+) e [15n 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + h]+ → m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + H]+). Defina os parâmetros ESI-MS/MS conforme descrito na tabela 1.
Parâmetros ESI-MS/MS8-oxodGuoAdutos de etheno
Cortina de gás20 libras por polegada quadrada20 libras por polegada quadrada
Gás Nebulizing5550
Gás da fonte do íon50 libras por polegada quadrada40 libras por polegada quadrada
Gás de dissociação induzida por colisãoMédioMédio
Ion spray de tensão50004500
Temperatura da sonda ESI450450
Potencial de declumentação31 V, 8-oxodGuo41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo41 V, [15n5] 1, n6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15n5] 1, n2-εdguo
Energia de colisão23 eV, 8-oxodGuo25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo25 eV, [15n5] 1, n6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15n5] 1, n2-εdguo
Potencial de saída de célula de colisão16 V, 8-oxodGuo,8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo8 V, [15n5] 1, n6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15n5] 1, n2-εdguo
Potencial de entrada10 V10 V

Tabela 1. Parâmetros utilizados no equipamento ESI-MS/MS para detecção das lesões do DNA. Esta tabela foi modificada de Oliveira et al.34.

  1. Filtrar (usando 0,22 μm membranas porosas) e degasify (usando um sonicator) todos os solventes de HPLC à base de água.
  2. Use as seguintes condições de cromatografia para as análises.
    1. Elute a 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, coluna C18 acoplada a um cartucho de segurança C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de acetato de amônio de 5 mM, pH 6,6 (solvente A) e acetonitrila (solvente B) a uma vazão de 130 μL/min e 25 ° c.
      1. Use o seguinte programa de gradiente para a bomba binária: de 0 a 10 min, 0% de solvente B; 10 a 39 min, 0-20% do solvente B; 39 a 41 min, 20-75% do solvente B; 41 a 46 min, 75% do solvente B; 46 a 47 min, 75-0% do solvente B; 47 a 60 min, 0% do solvente B.
      2. Use a válvula de comutação para direcionar o primeiro 35 min de eluente ao desperdício e a fração 35-42 min para a fonte ESI. Certifique-se de que as normas aduto eluir da coluna no intervalo definido (35-42 min). Faça ajustes, se necessário.

9. quantificação de 2 '-deoxyribonucleosides normais por HPLC-UV

  1. Utilize um equipamento semelhante ao equipamento utilizado neste trabalho (consulte a tabela de materiais).
  2. Elute um 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, coluna C18 anexado a um cartucho de segurança C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico e metanol.
    1. Use o seguinte programa de gradiente: de 0 a 25 min, 0 a 18% de metanol; de 25 a 27 min, de 18 a 0% de metanol; de 27 a 37 min, 0% de metanol) a uma vazão de 1 mL/min e 30 ° c.
    2. Injetar 5 μL de cada amostra reservada para quantificação de 2 '-deoxynucleosídeos.
    3. Ajuste o detetor do paizinho em 260 nanômetro para a integração dos picos de dGuo e de dAdo.

10. quantificação das lesões do DNA

  1. Integre os picos de 8-oxodGuo, [15n5] 8-Oxodguo, 1,n6-εdado, [15n5] 1,n6-εdado, 1,n2-εdguo, e [15n5] 1,n2 -εdguo das análises HPLC-ESI-MS/MS.
    1. Calcule as proporções de área de 8-oxodGuo/[15n5] 8-oxodguo, 1, n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado, e 1,n2-εdguo/[15n5 ] 1,N2-εdguo para as curvas de calibração e as amostras.
    2. Plotar as curvas de calibração usando as proporções de área obtidas na etapa 10.1.1 no eixo y e as quantidades de analitos presentes em cada ponto no eixo x.
    3. Calcule as quantidades (fmol) das lesões em cada amostra injetada usando as relações calculadas na etapa 10.1.1 e as curvas da calibração da etapa 10.1.2.
  2. Integre os picos de dGuo e de dAdo das análises HPLC-UV.
    1. Plotar as curvas de calibração usando as áreas obtidas na etapa 10,2 no eixo y e as quantidades de analitos presentes em cada ponto no eixo x.
    2. Calcule as quantidades (nmol) de dGuo e de dAdo em cada amostra injetada usando as áreas obtidas na etapa 10,2 e as curvas da calibração da etapa 10.2.1.
  3. Calcular as quantidades (nmol) de dGuo e dAdo presentes em cada amostra injetada no sistema HPLC-ESI-MS/MS, Considerando que os valores calculados na etapa 10.2.2 estão presentes no volume amostral de 5 μL, enquanto 50 μL foram injetados no sistema HPLC-ESI-MS/MS.
    Nota: para calcular a quantidade de dGuo nas amostras utilizadas para a análise de 8-oxodGuo, basta multiplicar a quantidade (nmol/μL) obtida no passo 10.2.2 por 50. Para calcular as quantidades de dAdo e dGuo nas amostras utilizadas para análises de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo, considerar a etapa de concentração após a extração em fase sólida. O volume de 50 μL injetado no sistema HPLC-ESI-MS/MS corresponde a 114,32 μL da amostra original. Os montantes (nmol/μL) obtidos na etapa 10.2.2 devem ser multiplicados por 114,32 para obter os valores corretos.
  4. Calcule as frações molar 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdado/dado, 1,n2-εdguo/dguo. As proporções (fmol lesão/nmol deoxynucleoside normal) dão o número de lesões por 106 dguo normal ou dAdo.

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Resultados

As concentrações médias de DNA (± DP) obtidas do fígado de camundongos (tecido ~ 1 g), pulmão (tecido de ~ 0,2 g) e rim (tecido ~ 0,4 g) foram, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 e 3.223 ± 723 μg/mL no volume final de 200 μL. Um cromatograma representativo obtido por HPLC-DAD do DNA purificado é mostrado na Figura 3. A presença dos quatro 2 '-deoxynucleosides, livre dos ribonucleosides do RNA, que eluir imediatamente antes dos 2 '-deoxynucleosides ...

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Discussão

Um problema principal encontrado nas análises 8-oxodguo por métodos da HPLC é a indução possível de sua formação durante os procedimentos do workup da extração do ADN, da hidrólise do ADN, e da concentração de hidrolisados do ADN22,38. A fim de minimizar o problema da formação vesícula 8-oxodguo, recomenda-se a adição de deferoxamina a todas as soluções de extração de DNA, armazenamento e hidrólise, o uso do método de iodeto de sódio agente e evitar o fenol na ex...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 e 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 e 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) e CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira e A. A. F. Oliveira receberam bolsas de estudo da FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) e CAPES (coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva e A. P. M. Loureiro receberam bolsas do CNPq.

Algumas figuras e tabelas presentes neste trabalho foram originalmente publicadas em Oliveira A.A.F. et al. efeitos genotóxicos e epigenotóxicos em camundongos expostos a matéria particulada de partículas finas (PM2,5) da cidade de São Paulo, Brasil. Toxicologia de partículas e fibras. 15, 40 (2018).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
[15N5]-2'-desoxiadenosinaCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3895-25
[15N5]-2'-desoxiguanosinaCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3899-CA-10
acetonitrilaCarlo Erba Reagentes412413000
alcalinos fosfatase da mucosa intestinal bovinaSigmaP5521
acetato de amônioMerck101116
timo de bezerro DNASigmaD1501
solução de lise celularQIAGEN158908
clorofórmioCarlo Erba Reagentes412653
deferoxaminaSigmaD9533
desoxirribonuclease I (DNase I)Bio Basic IncDD0649
etanolCarlo Erba Reagentes414542
ácido fórmicoSigma-AldrichF0507
HPLC-ESI-MS/MS sistemaHPLC: Agilent série 1200                      ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex InstrumentsHPLC: bomba binária (G1312B), bomba isocrática (G1310A), forno de coluna com válvula de comutação de coluna (G1316B), detector de arranjo de diodos (G1315C), amostrador automático (G1367C).                                                                                                                      ESI-MS / MS: Espectrômetro de massa de armadilha de íons quadrupolo linear, modelo 4000 QTRAP.
Sistema HPLC/DADShimadzuDuas bombas (LC-20AT), detector de matriz de fotodiodos (DAD-20AV), auto-injetor (Proeminência SIL-20AC), forno de coluna (CTO-10AS/VP)
Coluna HPLC (50 x 2,0 mm i.d., 2,5 µ m, C18)Coluna de HPLC Phenomenex00B-4446-B0
(150 x 2,0 mm i.d., 3,0 µ m, C18)Coluna de HPLC Phenomenex00F-4251-B0
(250 x 4,6 mm i.d., 5,0 µ m, C18)Phenomenex00G-4252-E0
HPLC C18 cartucho de proteção (4,0 x 3,0 mm i.d.)PhenomenexAJO-4287
álcool isoamílicoSigma-AldrichM32658
álcool isopropílico (isopropanol)Carlo Erba ReagentesA412790010
cetaminaCevaNome comercial: Dopalen
cloreto de magnésioCarlo Erba Reagentes349377
cloreto de magnésioSigmaM2393
metanolCarlo Erba ReagentesL022909K7
fosfodiesterase I de Crotalus atroxSigmaP4506
solução de precipitação de proteínaQIAGEN158912
proteinase KSigma-AldrichP2308
ribonuclease ASigmaR5000
sódio cloretoSigma-AldrichS9625
SPE-C18 (Strata-X)Phenomenex8B-S100-TAK
tris(hidroximetil)-aminometanoCarlo Erba Reagentes489983
xilazinaSyntec do BrasilNome comercial: Xilazin

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