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Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

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DOI:

10.3791/59750

20 de julho de 2019

Neste artigo

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Resumo

Organelas celulares, como mitocôndrias e retículo endoplasmático (er), criam uma rede para realizar uma variedade de funções. Estas estruturas altamente curvas são dobradas em várias formas para formar uma rede dinâmica, dependendo das condições celulares. A visualização desta rede entre mitocôndria e ER foi tentada usando a imagem latente e a microscopia de luz super-resolution da fluorescência; no entanto, a resolução limitada é insuficiente para observar as membranas entre as mitocôndrias e ER em detalhes. A microscopia eletrônica de transmissão proporciona um bom contraste de membrana e uma resolução de escala nanométrica para a observação de organelas celulares; no entanto, é excepcionalmente demorado ao avaliar a estrutura tridimensional (3D) de organelas altamente curvadas. Conseqüentemente, nós observamos a morfologia das mitocôndrias e do ER através da microscopia correlativa da luz-elétron (CLEM) e das técnicas da microscopia de elétron do volume usando a peroxidase realçada 2 do ascorbato e a mancha da peroxidase do rábano. Um método de coloração em bloco, o corte de série ultrafinos (tomografia de matriz) e a microscopia eletrônica de volume foram aplicados para observar a estrutura 3D. Neste protocolo, nós sugerimos uma combinação de CLEM e de microscopia de elétron 3D para executar estudos estruturais detalhados das mitocôndria e do ER.

Introdução

As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas1. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz2; Entretanto, a microscopia recente da super-definição3 e a microscopia de elétron (em)4 estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específ....

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Protocolo

1. cultura de pilha com o transfection modelado do prato e da pilha da cultura da grade com SCO1-APEX2 e vetor do plasmídeo de HRP-KDEL

  1. Semente 1 x 105 HEK293T células, colocando-os em 35-mm de vidro grade-fundo pratos de cultura em uma atmosfera humidificada contendo 5% co2 a 37 ° c em Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino, 100 U/ml penicilina e 100 U/mL de estreptomicina.
  2. O dia após a semeadura das células, quando eles cresceram para 50%-60% confluência, introduzir o SCO1-APEX210 e HRP-KDEL12 plasmídeo para as células usando o reagente de transfecção de ac....

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Resultados

A Figura 1 descreve a agenda e o fluxo de trabalho para este protocolo. O protocolo requer 7 dias; no entanto, dependendo do tempo gasto na imagem SEM, isso pode aumentar. Para o transfection da pilha, a confluência das pilhas deve ser controlada de modo a para não cobrir a parte inferior da placa de grade inteira (Figura 1a). Uma densidade elevada da pilha poderia impedir a identificação da pilha do interesse durante o microscópio claro e a observação de EM. Nós usamos plasmídeos geneti.......

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Discussão

Determinar a localização celular de proteínas específicas em uma resolução de nanômetro usando EM é crucial para compreender as funções celulares das proteínas. Geralmente, existem duas técnicas para estudar a localização de uma proteína alvo via EM. Uma delas é a técnica imunogantiga, que tem sido usada em em desde 1960, e a outra é uma técnica utilizando Tags geneticamente codificadas recentemente desenvolvidas16. As técnicas immunogold tradicionais empregaram partículas de ouro anticorpo-conjug.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa básica de KBRI através do Instituto de pesquisa do cérebro de Coreia financiado pelo Ministry da ciência e das TIC (19-BR-01-08), e pela Fundação Nacional da pesquisa da concessão de Coreia (NRF) financiada pelo governo de Coreia (MSIT) (no. 2019r1a2c1010634). SCO1-APEX2 e HRP-KDEL plasmídeos foram gentilmente fornecidos por Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Os dados do TEM foram adquiridos nas instalações do núcleo de pesquisa cerebral da KBRI.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GlutaraldeídoEMS16200Utilizar apenas em hottes
ParaformaldeídoEMS19210Utilizar apenas em hottes
Cacodilo de sódioEMS12300
Tetróxido de ósmio 4 % solução aquosaEMS16320Utilizar apenas em hottes
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultra-micrótomo Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Acetato de uranilaEMS22400Produto químico perigoso
Citrato de chumboEMS17900
35mm Prato de lamínula quadriculadoMattekP35G-1.5-14-CGRD
Descarregador de brilhoPelcoeasiGlow
Formvar revestido de carbono Gradede cobreTed Pella01805-F
Ácido clorídricoSIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlicinaSIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidina (DAB)SIGMAD8001Produto químico perigoso
30% Solução de peróxido de hidrogênioMerck107210
Hexacianoferrato de potássio (II) tri-hidratadoSIGMAP3289
0,22 um filtro de seringaSartorius16534
Tiocarbonildi-hidrazidaSIGMA223220Use apenas em capela
de exaustão Hidróxido de potássioFluka10193426
Ácido L-aspárticoSIGMAA9256
EtanolMerck100983
Microscopia eletrônica de transmissãoFEITecnai G2
Cobertura de vidro revestida de óxido de índio e estanho (ITO)SPI06489-ABvidro frágil
IsopropanolFisher BioreagentsBP2618-1
Faca de diamanteLeicaAT-4
Microscopia de luz revestidaNikonECLipse TS100
Microscopia eletrônica de varreduraZeissAuriga

Referências

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T.

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