Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Resumo

Organelas celulares, como mitocôndrias e retículo endoplasmático (er), criam uma rede para realizar uma variedade de funções. Estas estruturas altamente curvas são dobradas em várias formas para formar uma rede dinâmica, dependendo das condições celulares. A visualização desta rede entre mitocôndria e ER foi tentada usando a imagem latente e a microscopia de luz super-resolution da fluorescência; no entanto, a resolução limitada é insuficiente para observar as membranas entre as mitocôndrias e ER em detalhes. A microscopia eletrônica de transmissão proporciona um bom contraste de membrana e uma resolução de escala nanométrica para a observação de organelas celulares; no entanto, é excepcionalmente demorado ao avaliar a estrutura tridimensional (3D) de organelas altamente curvadas. Conseqüentemente, nós observamos a morfologia das mitocôndrias e do ER através da microscopia correlativa da luz-elétron (CLEM) e das técnicas da microscopia de elétron do volume usando a peroxidase realçada 2 do ascorbato e a mancha da peroxidase do rábano. Um método de coloração em bloco, o corte de série ultrafinos (tomografia de matriz) e a microscopia eletrônica de volume foram aplicados para observar a estrutura 3D. Neste protocolo, nós sugerimos uma combinação de CLEM e de microscopia de elétron 3D para executar estudos estruturais detalhados das mitocôndria e do ER.

Introdução

As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas¹. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz²; Entretanto, a microscopia recente da super-definição³ e a microscopia de elétron (em)⁴ estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específ....

Protocolo

1. cultura de pilha com o transfection modelado do prato e da pilha da cultura da grade com SCO1-APEX2 e vetor do plasmídeo de HRP-KDEL

1. Semente 1 x 10⁵ HEK293T células, colocando-os em 35-mm de vidro grade-fundo pratos de cultura em uma atmosfera humidificada contendo 5% co₂ a 37 ° c em Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino, 100 U/ml penicilina e 100 U/mL de estreptomicina.
2. O dia após a semeadura das células, quando eles cresceram para 50%-60% confluência, introduzir o SCO1-APEX2¹⁰ e HRP-KDEL¹² plasmídeo para as células usando o reagente de transfecção de ac....

Resultados

A Figura 1 descreve a agenda e o fluxo de trabalho para este protocolo. O protocolo requer 7 dias; no entanto, dependendo do tempo gasto na imagem SEM, isso pode aumentar. Para o transfection da pilha, a confluência das pilhas deve ser controlada de modo a para não cobrir a parte inferior da placa de grade inteira (Figura 1a). Uma densidade elevada da pilha poderia impedir a identificação da pilha do interesse durante o microscópio claro e a observação de EM. Nós usamos plasmídeos geneti.......

Discussão

Determinar a localização celular de proteínas específicas em uma resolução de nanômetro usando EM é crucial para compreender as funções celulares das proteínas. Geralmente, existem duas técnicas para estudar a localização de uma proteína alvo via EM. Uma delas é a técnica imunogantiga, que tem sido usada em em desde 1960, e a outra é uma técnica utilizando Tags geneticamente codificadas recentemente desenvolvidas¹⁶. As técnicas immunogold tradicionais empregaram partículas de ouro anticorpo-conjug.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glutaraldeído	EMS	16200	Utilizar apenas em hottes
Paraformaldeído	EMS	19210	Utilizar apenas em hottes
Cacodilo de sódio	EMS	12300
Tetróxido de ósmio 4 % solução aquosa	EMS	16320	Utilizar apenas em hottes
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultra-micrótomo Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Acetato de uranila	EMS	22400	Produto químico perigoso
Citrato de chumbo	EMS	17900
35mm Prato de lamínula quadriculado	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Descarregador de brilho	Pelco	easiGlow
Formvar revestido de carbono Grade	de cobreTed Pella	01805-F
Ácido clorídrico	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glicina	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidina (DAB)	SIGMA	D8001	Produto químico perigoso
30% Solução de peróxido de hidrogênio	Merck	107210
Hexacianoferrato de potássio (II) tri-hidratado	SIGMA	P3289
0,22 um filtro de seringa	Sartorius	16534
Tiocarbonildi-hidrazida	SIGMA	223220	Use apenas em capela
de exaustão Hidróxido de potássio	Fluka	10193426
Ácido L-aspártico	SIGMA	A9256
Etanol	Merck	100983
Microscopia eletrônica de transmissão	FEI	Tecnai G2
Cobertura de vidro revestida de óxido de índio e estanho (ITO)	SPI	06489-AB	vidro frágil
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Faca de diamante	Leica	AT-4
Microscopia de luz revestida	Nikon	ECLipse TS100
Microscopia eletrônica de varredura	Zeiss	Auriga