Artigo de método

Uso do micro tomography computado do raio X com preparação ácida phosphotungstic para visualizar o tecido fibromuscular humano

DOI:

10.3791/59752

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5 de setembro de 2019

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, Anesthesia and Pain Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 3Surgical Anatomy Education Centre at the Yonsei University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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O micro tomography computado do raio X é eficaz em obter a informação tridimensional dos espécimes humanos não danificados mas tem o sucesso limitado em observar os tecidos macios. O uso do agente do contraste do ácido fosfotúngstico pode resolver esta edição. Nós implementamos este agente do contraste para examinar tecidos fibromusculares delicados humanos (o ligamento de retenção dos orbicularis).

Resumo

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A dissecção manual e a observação histológica são métodos comuns usados para investigar tecidos humanos. Entretanto, a dissecção manual pode danificar estruturas delicadas, quando o processamento e a observação histológica fornecerem a informação limitada com a imagem latente transversal. O micro tomography computado do raio X (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional sem danificar espécimes. Entretanto, mostra a eficiência limitada em diferenciar partes macias do tecido. O uso de agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), pode resolver este problema melhorando o contraste do tecido macio. Nós implementamos o microCT com o PTA para investigar o ligamento de retenção do orbicularis humano (ORL), que é uma estrutura delicada na área da órbita. Neste método, os espécimes colhidos são fixados em formalina, desidratados em soluções de etanol serial, e coradas com uma solução de PTA. Após a coloração, a varredura de microCT, a reconstrução 3D, e a análise são executadas. A pele, os ligamentos, e os músculos podem claramente ser visualizados usando este método. O tamanho da amostra e a duração da coloração são características essenciais do método. A espessura adequada do espécime foi de cerca de 5 – 7 mm, acima da qual o processo foi retardado, e a duração ótima foi de 5 a 7 dias, abaixo do qual um buraco vazio na área central ocasionalmente ocorreu. Para manter a localização e a direção de peças pequenas durante o corte, é recomendável costurar na mesma região de cada peça. Além disso, análises preliminares da estrutura anatômica são necessárias para identificar corretamente cada peça. Parafilm pode ser usado para impedir a secagem, mas o cuidado deve ser tomado para impedir a distorção do espécime. Nossa observação multidirecional mostrou que o ORL é compor de um malha multicamada de placas contínuas, um pouco do que a fio-como fibras, como relatado previamente. Estes resultados sugerem que a varredura de microCT com PTA seja útil para examinar compartimentos específicos dentro das estruturas complexas do tecido humano. Pode ser útil nas análises de tecidos de câncer, tecidos nervosos e vários órgãos, como o coração e o fígado.

Introdução

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A dissecção manual e a observação histológica são tipicamente usadas para examinar os tecidos humanos, como músculos e tecidos conjuntivos. No entanto, a dissecção manual pode facilmente danificar estruturas delicadas, e a observação histológica fornece informações limitadas sobre superfícies planas transversais1,2. Portanto, métodos melhorados são necessários para examinar os tecidos de forma mais precisa e eficiente.

A tomografia computadorizada convencional (TC) é geralmente utilizada na prática clínica, mas carece da capacidade de distinguir pequenas estruturas2,3. O micro raio X CT (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional (3D) de estruturas pequenas dos espécimes, sem destruí-los. Entretanto, microCT tem aplicações limitadas porque somente os tecidos densos podem ser visualizados claramente; Ele não pode ser usado para diferenciar os tecidos moles. Para superar esta limitação, os agentes de coloração podem ser usados. Os agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), o ácido foshomolíbdico e o iodo de Lugol, melhoram a taxa de contraste dos tecidos moles durante a digitalização4,5. Vários estudos comparando esses agentes sugerem que a PTA demonstra bom desempenho e é de fácil manuseio6,7,8.

O ligamento de retenção de orbicularis (ORL) é uma estrutura delicada em torno da órbita, que pode facilmente ser danificada durante a observação convencional9. Nós examinamos e recuperado com sucesso a informação 3D nesta estrutura usando microCT com o PTA como um agente do contraste. Este método pode ser aplicado a estudos sobre outros tecidos humanos, como o coração e o fígado, com modificações apropriadas10,11,12.

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Protocolo

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Todos os cadáveres utilizados neste estudo foram legalmente doados ao centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei.

1. obtenção de amostras

  1. Desenhe uma linha de incisão no cadáver com um lápis colorido para indicar a área de corte para a colheita da amostra. Verifique se a linha de incisão desenhada se estende medialmente a um canthus medial, lateralmente a um canthus lateral, superiormente a uma borda superior da pálpebra inferior, e inferiormente a 1 cm abaixo da linha da borda orbital.
    Nota: considere o tamanho da amostra com base no tamanho máximo de digitalização do equipamento Micro-CT (nosso equipamento poderia adquirir uma imagem com uma dimensão de objeto máximo de 7 × 7 cm). Aqui, uma amostra de aproximadamente 1 cm de largura, 3 cm de comprimento e 1,25 g de peso foi colhida da região ORL.
  2. Corte os tecidos faciais seguindo a linha da incisão com uma lâmina. Certifique-se que o corte é profundo de tal forma que a ponta da lâmina toca o osso. A amostra deve incluir a pele, o tecido subcutâneo, o músculo, a gordura e o periósteo.
  3. Fixar a amostra em formalina a 10% imediatamente e conservá-la durante 5 a 7 dias à temperatura ambiente (Figura 1a).
    Nota: os cadáveres embalsamados e frescos podem ser usados para este estudo. No entanto, a solução de fixação para cadáveres pode diferir ligeiramente da solução utilizada em um experimento biológico. Portanto, sugerimos a fixação da amostra com formalina a 10% novamente, mesmo após a obtenção da amostra de cadáveres embalsamados.

2. preparação para a coloração

  1. Após a fixação, corte a amostra em 3 peças (5 – 7 mm de espessura). Não perca a localização e a direção de cada peça durante este processo.
    Nota: o scanner microCT que usamos pode cobrir um tamanho máximo de 7 cm ³, mas a solução PTA não pode penetrar a amostra com sucesso se for muito grossa.
  2. Costurar o lado superolateral de cada peça com uma agulha e uma rosca preta de forma a que a direcção da amostra possa ser verificada mais tarde.
  3. Deshidratar a amostra em uma série de 30%, 50%, e 70% soluções de etanol para 1 dia cada.
  4. Coloque a amostra em 70% de etanol até a coloração.

3. preparação para a PTA

  1. Comece o processo de coloração PTA 1 semana antes da digitalização microCT está agendada.
  2. Prepare 210 mL de solução de etanol 70% e adicione 2,1 g de poder de PTA a ele. Misture bem usando uma coqueteleira a 55-60 RPM.
    Nota: a concentração da solução PTA deve ser de 1% em etanol.
  3. Prepare recipientes de plástico de 3 70 mL para cada peça cortada. Preencha os recipientes com a solução PTA. Mergulhe os espécimes nos recipientes e coloc os em um abanador para a penetração eficaz. Deixar as amostras por 5 – 7 dias (Figura 1b).
  4. Quando a coloração for concluída, armazene a amostra em 70% de etanol para se preparar para a digitalização.
    Nota: as amostras manchadas podem ser mantidas por vários meses, mas é recomendável que as amostras sejam escaneadas o mais rápido possível para garantir a coloração completa.

4. digitalização MicroCT

  1. Enrole a amostra com parafilm para evitar a secagem. Não enrole as amostras muito apertadas, pois isso pode levar à deformação.
  2. Abra o scanner e coloque a amostra na bandeja (Figura 2).
  3. Defina os parâmetros de digitalização da seguinte forma: tensão de fonte (kV) = 70, corrente de fonte (μA) = 114, filtro Al = 0,5 mm, tamanho de pixel de imagem (μm ²) = 20, pixels = 2240 × 2240, exposição (MS) = 500, etapa de rotação (DEG) = 0,3.
    Nota: os parâmetros podem ser modificados de acordo com as amostras e/ou scanners utilizados.
  4. Inicie a digitalização.
    Nota: a digitalização demora de 30 a 60 min, dependendo da resolução pretendida e da velocidade do scanner.

5. reconstrução e otimização de dados

  1. Execute o software de reconstrução. Selecione abrir conjunto de dados no menu ações para iniciar os arquivos digitalizados.
  2. Selecione a guia configurações na janela reconstrução . Defina os parâmetros da seguinte forma: redução de artefatos de anel = 7, correção de endurecimento de feixe (%) = 40.
    Nota: os parâmetros podem ser modificados de acordo com a amostra.
  3. Comece a reconstrução selecionando Iniciar na guia Iniciar . Os dados finais serão armazenados na pasta designada.
  4. Execute o software de redimensionamento de arquivos. Selecione o conjunto de dados de origem para iniciar os arquivos reconstruídos.
  5. Selecione jpg na guia conjunto de dados de destino .
  6. Escolha a opção de redimensionamento 1/2 com uma opção de qualidade de sem interpolação (rápida).
  7. Ajuste a barra de slides para 100 (mais alto) na guia compactação de imagem . iniciar a conversão.
    Nota: a opção de redimensionamento é evitar abrandar a velocidade do computador quando 3D processado; no entanto, ele pode resultar em uma resolução mais baixa quando redimensionado extensivamente. Sugerimos redimensionar ao meio para resolução aceitável com melhor manuseio.

6. reconstrução 3D

  1. Execute o software de renderização de volume 3D.
  2. Selecione ações > carregar dados de volume para iniciar o DataSet.
  3. Ajuste o brilho e o nível de contraste modificando a função de transferência de forma no histograma na guia Editor de função de transferência .
  4. Selecione opções > Lighting.
  5. Selecione sombras e ícones de iluminação de superfície . Estes efeitos proporcionam um tom de modelagem realista.
  6. Encontre a melhor visualização movendo-se (clique e arraste), girando (clique com o botão direito do mouse e arraste), e ampliando ou saindo do (rolar) o modelo.
  7. Deslize o plano (Shift + clique e arraste na direção interna) para mostrar as imagens seccionais (Figura 3).
  8. Ative o ícone de luz . Ajuste a barra de indicação de iluminação e encontre a melhor iluminação para visualização. Em seguida, desligue o ícone e feche a guia iluminação .
  9. Selecione opções > Mostrar > caixa de recorte para ocultar a caixa para a imagem final.
  10. Selecione ações > Salvar imagem para armazenar a imagem.

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Resultados

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A reconstrução detalhada do ORL foi alcançada pela Microtc com a preparação da PTA (Figura 4). A estrutura fibromuscular ligamentar que se estende obliquamente entre a derme e o periósteo foi distintamente observada (figura 4a). Na visão coronal (Figura 4B), a quantidade e a complexidade das fibras aumentaram lateralmente. Na visão horizontal (Figura 4C), observou-se um trabalho de malha elaborado com f...

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Discussão

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Nós implementamos o microCT com preparação do PTA no exame de tecidos macios humanos. Resumidamente, os espécimes são colhidos e fixados em formalina por alguns dias, seguidos de desidratação em soluções de etanol serial. Coloc a amostra na solução do PTA diretamente depois que a fixação do formalina pode conduzir a algum rachamento do tecido devido à desidratação rápida. Conseqüentemente, a desidratação de série é necessária antes da mancha de PTA. Em seguida, as amostras são manchadas usando a solução PTA por cerca de ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado por um subsídio de pesquisa do corpo docente da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei (6-2018-0099). Os autores agradecem às pessoas que doaram muito generosamente seus corpos para a faculdade de medicina da Universidade de Yonsei. Estamos gratos a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang por seu apoio técnico (membros da equipe do centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei). Nós somos gratos igualmente a Genoss co., Ltd. para o sistema de varredura de alta qualidade de microCT usado nesta pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
12 Tungsto(VI)ácido fosfórico n-hidrato
Ácido fosfotúngstico		Junsei84220-0410PTA em pó
CTvoxBrukerver 2.7Software de reconhecimento 3D
NreconBrukerver 1.7.0.4Software de reconstrução
SkyscanBruker1173Scanner MicroCT
TconvBrukerver 2.0Arquivo software de redimensionamento

Referências

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  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042(2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597(2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

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