As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.
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Artigo de método
Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este manuscrito descreve um ensaio de coincubação à base de cultura para detectar e caracterizar interações competitivas entre duas populações bacterianas. Este método emprega plasmíos estáveis que permitem que cada população seja diferencialmente marcada com capacidades de resistência a antibióticos distintas e proteínas fluorescentes para seleção e discriminação visual de cada população, respectivamente. Aqui, nós descrevemos a preparação e a coincubação de tensões competindo do fischeri do Vibrio , a imagem latente da microscopia de fluorescência, e a análise quantitativa dos dados. Essa abordagem é simples, produz resultados rápidos e pode ser usada para determinar se uma população mata ou inibe o crescimento de outra população, e se a competição é mediada por uma molécula diffusible ou requer contato direto com células celulares. Como cada população bacteriana expressa uma proteína fluorescente diferente, o ensaio permite a discriminação espacial de populações concorrentes dentro de uma colônia mista. Embora os métodos descritos sejam realizados com a bactéria simbiótica V. fischeri utilizando condições otimizadas para esta espécie, o protocolo pode ser adaptado para a maioria dos isolados bacterianos culturáveis.
Introdução
Este manuscrito descreve um método baseado em cultura para determinar se dois isolados bacterianos são capazes de interações competitivas. Ao estudar populações mistas, é importante avaliar em que medida os isolados bacterianos interagem, particularmente se os isolados estão competindo diretamente através de mecanismos de interferência. A competição de interferência refere-se a interações em que uma população inibe diretamente o crescimento ou mata uma população concorrente1. Essas interações são importantes para se identificar, pois podem ter efeitos profundos sobre a estrutura e a função de uma comunidade microbiana2,3....
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Protocolo
1. Prepare cepas para coincubação
- Escolha uma cepa de referência apropriada que servirá como alvo para a competição bacteriana durante o ensaio de coincubação. Consulte a discussão sobre as melhores práticas ao selecionar uma deformação de referência e como a deformação de referência impactará os resultados. Neste protocolo, V. fischeri Strain ES114 servirá como a cepa de referência.
-
Determinar quais métodos de seleção e triagem serão usados para distinguir entre os isolados em coincubação
- Tipicamente, as cepas de transformação com plasmídos estáveis contendo diferentes genes de resistência a an....
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Resultados
A fim de avaliar as interações competitivas entre populações bacterianas, foi desenvolvido um protocolo de ensaio de coincubação e otimizado para V. fischeri. Este método utiliza plasmíos estáveis que codificam genes de resistência a antibióticos e proteínas fluorescentes, permitindo a seleção diferencial e a discriminação visual de cada cepa. Analisando os dados coletados a partir do ensaio de coincubação, pode-se identificar o desfecho competitivo de uma interação e o mecanismo.......
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Discussão
O ensaio de coincubação descrito acima fornece um método poderoso para descobrir a competição interbacteriana. Essa abordagem permitiu a identificação da competição intraespecífica entre os isolados de V. fischeri e a caracterização do mecanismo competitivo19. Embora o método descrito foi otimizado para a bactéria Marinha V. fischeri, pode ser facilmente modificada para acomodar outras espécies bacterianas, incluindo isolados clínicos e ambientais. É importante notar que os mecan.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos revisores por seu feedback útil. A.N.S. foi apoiado pela Fundação Gordon e Betty Moore através de Grant GBMF 255, 3 para a Fundação de pesquisa de ciências biológicas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μ L pipeta | |||
| 100 μ L pipeta | |||
| 300 μ L pipeta | |||
| 10 μ L pipeta | |||
| 20 μ L pipeta | |||
| 200 μ L pipeta | |||
| 1.000 μ L pipeta | |||
| Placas de 24 poços | Fisher | 07-200-84 | estéril com tampa |
| Placas de 96 poços | VWR | 10062-900 | estéril com tampa |
| Calculadora | |||
| Cloranfenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL em etanol); concentração final em meio (2 μ g/mL LBS) |
| Microscópio de dissecação de fluorescência com câmera e software | |||
| Fórceps | Fisher | 08-880 | |
| Sulfato de canamicina | Fisher | BP906-5 | estoque (100 mg/mL em água, esterilizar por filtro); concentração final em meio (1 μ g/mL LBS) |
| Membrana de nitrocelulose (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0,22 μ m membrana de nitrocelulose (pk de 100) |
| Placas de Petri | Fisher | FB0875713 | estéril com tampa |
| Espectrofotômetro | |||
| Cubetas semi-micro | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μ L sistema de partida | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μ L sistema de partida | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μ L sistema de partida | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| LBS media | |||
| 1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M tampão de estoque (62 mL HCl, 938 mL DI água, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Adicionar apenas para placas) |
| Água | 950 mL | ||
| Cloreto de Sódio | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Triptona | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Extrato de Levedura | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
Referências
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....
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Reimpressões e permissões
