Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.
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Artigo de método
Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Além de mRNAs lineares, muitos genes eucaticos geram RNAs circulares. A maioria das RNAs circulares são geradas juntando-se a um site de emenda de 5' com um site de emenda upstream 3' dentro de um pré-mRNA, um processo chamado back-splicing. Essa circularização é provavelmente auxiliada por estruturas secundárias no pré-mRNA que aproximam os locais de junção. Nos genes humanos, os elementos alu são pensados para promover essas estruturas secundárias de RNA, pois os elementos alu são abundantes e exibem complementaridades de base uns com os outros quando presentes em direções opostas no pré-mRNA. Aqui, descrevemos a geração e análise de grandes elementos Alu contendo genes de repórteres que formam RNAs circulares. Através da otimização dos protocolos de clonagem, genes de repórter com comprimento de inserção de até 20 kb podem ser gerados. Sua análise em experimentos de cofecção permite a identificação de fatores regulatórios. Assim, este método pode identificar seqüências de RNA e componentes celulares envolvidos na formação de RNA circular.
Introdução
RNAs Circulares
As RNAs circulares (circRNAs) são RNAs univalentemente fechadas que são expressas na maioria dos organismos. Eles são gerados juntando um site de emenda downstream 5' a um site de emendas upstream 3', um processo chamado back-splicing(Figura 1A)1. Seqüências no pré-mRNA que exibem base complementar tão curta quanto 30-40 nt trazem locais de back-splice em alinhamento adequado para formação de cirrna2. Em humanos, os elementos Alu 1, representando cerca de 11% do genoma3, formam exten....
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Protocolo
1. Projeto das construções
- Use o navegador de genoma UCSC24 para identificar elementos repetitivos necessários para a formação de RNA circular e incorporá-los nos construtos. É importante ressaltar que os primers para amplificação precisam estar fora dos elementos repetitivos.
- Cole a seqüência circular de RNA(Figura Suplementar 1 é uma seqüência de teste) em https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start e selecione o organismo certo. Envie a seqüência e vá para a visualização do navegador, diminua o zoom de 1,5x ou conf....
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Resultados
Os genes dos repórteres permitem determinar fatores regulatórios que influenciam a formação circular de RNA. No entanto, esses genes de repórteres são grandes e contêm elementos repetitivos que muitas vezes tornam construções de DNA instáveis. Devido ao seu grande tamanho, muitas vezes é necessário excluir partes dos íntrons, o que é conseguido amplificando peças genômicas contendo os éons e partes menores de flanqueamento intrônico. Essas peças de DNA são montadas enzimáticamente, permitindo a construção sem enzimas de .......
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Discussão
Em geral, as RNAs circulares são baixas abundantes1, o que complica o estudo de sua função e formação. Semelhante às RNAs lineares13, o uso de minigenes repórter permite a identificação de fatores cis e trans-atuação que regulam a formação de RNAs circulares. Assim, essa abordagem gera hipóteses que podem ser ainda mais testadas usando os genes endógenos.
O passo mais crítico é o design do gene do repórter. A montagem enzimática de fragmentos de .......
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Divulgações
Nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa DoD conceder AZ180075. Stefan Stamm agradece jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin foi apoiada pelo DAAD, programa alemão de intercâmbio acadêmico, Justin R. Welden recebeu o Prêmio Da Universidade de Kentucky Max Steckler.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (PEI) Policiências de cloridrato | 24765-1 | ||
| Ferramenta de construção | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | |||
| NEB | E2621S | ||
| e PCR | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 local de clonagem | Polycloning | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polimerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polimerase |
| 2 | Biorad | 1725310 | Polimerase de longo alcance (NEB), iproof (BioRad) |
| Polimerase 2 | Qiagen | 206402 | Kit de polimerase de longo alcance Qiagen |
| 18080044 | Thermo Fisher | ||
| Technologies | 12183025 | Ambion da Life Technologies | |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicentro/Lucigen |
| Células estáveis competentes | NEB | C3040H | Células estáveis Bactérias |
| clonadoras padrão | NEB | C2988J | NEB5-alpha competente |
| Ferramenta Web para a conceção de primários | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Cálculos de temperatura baseados na Web | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Referências
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
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Reimpressões e permissões
