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Artigo de método

Tomografia fotoacústica de desktop com base em diodo laser pulsada para monitoramento de lavagem e lavagem de corante em vasculatura cortical de ratos

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DOI:

10.3791/59764

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30 de maio de 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Neste artigo

Resumo

Um sistema laser pulsado compacto do tomography fotoacústica do desktop (PLD-Pat) é demonstrado para A imagem latente dinâmica in vivo de alta velocidade do vasculature cortical animal pequeno.

Resumo

A imagem latente do tomography de photoacoustic (PA) (PAT) é uma modalidade biomédica emergente da imagem latente útil em várias aplicações pré-clínicas e clínicas. Personalizado-feito circular anel array-based transdutores e convencional volumoso Nd: YAG/OPO lasers inibir a tradução do sistema PAT para clínicas. Os diodos laser pulsado ultra-compactos (PLDs) estão sendo usados atualmente como uma fonte alternativa de excitação do próximo-infravermelho para a imagem latente do PA. A imagem latente dinâmica de alta velocidade in vivo foi demonstrada usando um sistema PLD-baseado compacto do PAT do desktop (PLD-PAT). Um protocolo experimental visualizado usando o sistema de desktop PLD-PAT é fornecido neste trabalho para a imagem latente dinâmica do cérebro in vivo. O protocolo descreve a configuração de sistema do desktop PLD-PAT, a preparação do animal para a imagem latente Vascular do cérebro, e o procedimento para o visualização dinâmico do verde do do indocyanine (ICG) o processo da tomada e do afastamento da tintura no vasculature cortical do rato.

Introdução

O tomography computado fotoacústico (PACT/Pat) é uma modalidade biomédica não invasora prometedora da imagem latente que combina o contraste ótico rico com a definição elevada1,2,3,4de ultrasond, 5. When um nanossegundos o laser pulsado deposita a energia na luz que absorve cromóforos atual dentro de todo o tecido biológico, aumentos locais da temperatura que conduzem à expansão e à contração termoelástico do tecido, tendo por resultado a geração de ondas de pressão. Estas ondas de pressão são conhecidas como ondas de ultra-som ou ondas fotoacústicas (PA), que podem ser detectadas por transdutores de ultra-som em torno da amostra. Os sinais de PA detectados são reconstruídos usando vários algoritmos de reconstrução6, 7, 8,9 para gerar imagens de PA transversais. A imagem latente do PA fornece a informação estrutural e funcional dos órgãos macroscópicos às organelas microscópicas devido à dependência do comprimento de onda de cromóforos endógenos atuais dentro do corpo10. A imagem latente de PAT foi usada com sucesso para a deteção1do cancro da mama, imagem latente do nó de linfa da sentinela11, mapeando do oxyhemoglobina (HbO2), deoxyhemoglobina (HBR), concentração total da hemoglobina (HBT), saturação do oxigênio (so 2) o 12 anos de , 13, angiogênese14do tumor, imagem latente inteira15do corpo do animal pequeno, e outras aplicações.

Nd: os lasers de YAG/opo são fontes convencionais da excitação para sistemas da primeira geração Pat que são amplamente utilizados na Comunidade fotoacústica para a imagem latente animal pequena e a imagem latente profunda16do tecido. Estes lasers fornecem ~ 100 pulsos de energia mJ em baixas taxas de repetição de ~ 10-100 Hz. Os sistemas da imagem latente de PAT que usam estes lasers caros e volumosos não são apropriados para a imagem latente de alta velocidade com os transdutores do único-elemento do ultra-som (SUTs), devido à taxa limitada da repetição do pulso. Isso inibe o monitoramento em tempo real das alterações fisiológicas que ocorrem em altas velocidades dentro do animal. Usando transdutores baseados em array como matrizes lineares, semicirculares, circulares e volumétricas com excitação a laser Nd: YAG, a imagem de alta velocidade é possível. No entanto, estes transdutores de matriz são caros e proporcionam sensibilidades inferiores em comparação com os SUTs; ainda, a velocidade de imagem é limitada pela baixa taxa de repetição do laser. Os sistemas do PACT do único-impulso do estado---arte com o transdutor personalizado do cheio-anel da disposição obtêm os dados do PA em 50 taxas de frame de hertz17. Estes transdutores da disposição precisam o back-end complexo que recebe a eletrônica e os amplificadores de sinal, fazendo o sistema total mais caro e difícil para o uso clínico.

Seu tamanho compacto, exigências mais baixas do custo, e uma taxa mais elevada da repetição do pulso (ordem de KHz) fazem diodos de laser pulsado (PLDs) mais prometedores para a imagem latente tempo real. Devido a estas vantagens, os PLDs são usados ativamente como uma fonte alternativa da excitação em sistemas da segunda geração PAT. Os sistemas Pat baseados em PLD foram demonstrados com sucesso para a imagem latente da taxa do elevado-frame usando os transdutores18da disposição, profundamente-tecido e imagem latente do cérebro19,20,21, diagnóstico de doença cardiovascular22 e diagnóstico de Reumatologia23. Como os SUTs são altamente sensíveis e menos dispendiosos em comparação com os transdutores de matriz, eles ainda são amplamente utilizados para imagens PAT. O sistema PLD à base de fibra foi demonstrado para a imagem latente fantasma24. Um sistema portátil de PLD-PAT foi demonstrado previamente montando o PLD dentro do varredor25da pancadinha. Com um varredor circular de SUT, a imagem latente fantasma foi executada durante 3 s do tempo da varredura, e a imagem latente in vivo do cérebro do rato foi executada durante um período de 5 s usando este sistema de PLD-PAT19.

Além disso, foram feitas melhorias para este sistema PLD-Pat para torná-lo mais compacto e criar um modelo de desktop usando oito transdutores de ultra-som de elemento único baseado em refletor acústico (sutrs)26,27. Aqui, os SUTs foram coloc em um vertical em vez do sentido horizontal com a ajuda de um refletor 90° Acoustic28. Este sistema pode ser empregado para tempos da varredura de até 0,5 s e de ~ 3 cm profundamente na imagem latente do tecido e na imagem latente animal pequena in vivo do cérebro. Neste trabalho, este sistema de desktop PLD-PAT é usado para fornecer a demonstração visual de experimentos para imagiologia cerebral in vivo em pequenos animais e para visualização dinâmica do processo de captação e liberação de indocyanina aprovada pela administração de alimentos e drogas (FDA) corante verde (ICG) em cérebros de ratos.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Tecnológica de Nanyang, Singapura (número de protocolo animal ARF-SBS/NIE-A0331).

1. Descrição do sistema

  1. Monte o laser PLD no scanner circular e monte o difusor óptico (OD) na frente da janela de saída PLD para tornar o feixe de saída homogêneo, como mostrado na Figura 1a. Conecte o PLD à unidade do excitador do laser (LDU).
    Nota: o PLD gera ~ 816 nm pulsos de comprimento de onda, pulsos de ~ 107 NS de duração, e até uma taxa de repetição de 2 KHz com uma energia máxima de pulso de ~ 3,4 mJ. O LDU consiste no refrigerador, fonte de alimentação de 12 V, fonte de alimentação de alta tensão variável para controlar o poder do laser, e o gerador da função para mudar a taxa da repetição do pulso.
  2. Monte todos os oito SUTRs em cada suporte SUTR um-por-um de tal forma que a superfície de cada refletor acústico enfrenta em direção ao centro da área de digitalização, como mostrado na Figura 1b. Ligue cada cabo SUTR ao amplificador de sinal de baixo ruído com a ajuda de cabos de ligação.
    Nota: a frequência central do transdutor de ultra-som é de 5 MHz e tem uma área ativa de 13 mm de diâmetro. Dois amplificadores cada um do ganho de 24 dB são conectados em série para cada canaleta.
  3. Ligue a fonte de alimentação do chiller e, em seguida, ligue o interruptor do chiller para definir a temperatura entre 20 ° c e 25 ° c.
  4. Ligue o fornecimento da fonte de alimentação de baixa tensão e gire lentamente o controle atual para definir o limite atual em 0,3 a. defina a voltagem para 12 V. Verifique se a corrente não excede 0,1 A.
  5. Ligue a fonte de alimentação de alta tensão. Pressione o botão "PRESET" e defina a corrente para 1 a e tensão para 0 V. Ative o botão "output": 0 V/0 A.
  6. Ligue a fonte de alimentação do gerador de funções. Pressione o botão "Recall" e escolha uma configuração de 2 KHz para gerar os pulsos de laser a esta taxa de repetição.
  7. Coloque o tanque de acrílico dentro do scanner, como mostrado na Figura 1a e encha o tanque com água de tal forma que a superfície de detecção dos sutrs são imersos completamente dentro de água.
  8. Certifique-se de que todos os SUTRs detectando superfícies estão dentro do meio de água. Ligue a fonte de alimentação do amplificador de sinal de baixo ruído.

2. preparação animal para a imagem latente do cérebro do rato

Nota: ratos fêmeas saudáveis (ver tabela de materiais) foram usados para demonstrar o sistema de desktop PLD-Pat descrito acima para a vasculatura cortical animal pequena da imagem latente.

  1. Segure o animal nas costas, prendendo o movimento da cabeça e do corpo. Anestesie o animal por injeção intraperitoneal de uma mistura de 2 mL de cetamina (100 mg/mL), 2 mL de xilazina (20 mg/mL), e 1 mL de soro fisiológico (dosagem de 0,2 mL/100 g).
    Nota: após a injecção, o dedo do pé do animal é beliscado para testar quaisquer reflexos positivos, tais como movimentos do pé ou do corpo, vocalização, ou aumentos marcados nas respirações. A ausência de tais ações reflexas confirma a anestesiação bem-sucedida do animal.
  2. Para evitar o secura devido à anestesia e à iluminação do laser, aplique muito com cuidado a pomada artificial do rasgo aos olhos do rato. Coloque o animal em posição prona no banco de trabalho e retire a pele no couro cabeludo do animal usando um aparador de cabelo e aplique suavemente o creme de depilação para a área raspada e retire a pele completamente.
    1. Após 4 – 5 min, retire o creme aplicado com um cotonete.
  3. Monte o suporte animal feito-à-medida (veja a tabela dos materiais) equipado com uma máscara de respiração (veja a tabela de materiais) em um laboratório-jaque.
  4. Coloque o animal em posição prona no suporte para que a cabeça repouse sobre a plataforma horizontal do suporte. Use a fita cirúrgica para fixar o animal ao suporte.
  5. Assegure-se de que a máscara respiratória cubra o nariz e a boca do rato para entregar a mistura da anestesia. A máscara de respiração é personalizada para se adequar à janela de imagem. 10% do cone de nariz disponível comercialmente é cortado e então conectado a um pedaço de luva.
  6. Ligue a máscara respiratória à máquina de anestesia antes de ligá-la.
  7. Ligue a máquina de anestesia e configurá-lo para entregar a mistura anestésica contendo 1,0 L/min de oxigênio com 0,75% isoflurano para a máscara de respiração animal.
    1. Prenda o oxímetro de pulso a uma das patas traseiras do animal para monitorizar a sua condição fisiológica.
  8. Aplique uma camada de gel incolor do ultra-som ao escalpe do rato usando um aplicador derrubado algodão. Ajuste a posição do laboratório-jaque ao centro do varredor e ajuste a altura do laboratório-jaque manualmente de modo que o plano da imagem latente esteja no centro do refletor acústico.

3. imagem latente dinâmica in vivo do processo da captação e do afastamento de ICG no cérebro do rato

  1. Defina os parâmetros no software de aquisição de dados (consulte a tabela de materiais) para uma verificação de aquisição de 360 °.
  2. Gire sobre a emissão do laser de PLD permitindo a saída do gerador da função (a emissão do laser começará). Então, Aumente lentamente a tensão da fonte de alimentação de alta tensão variável a 120 V para o máximo por a energia do pulso.
  3. Execute o software de aquisição de dados (consulte a tabela de materiais) programa para girar todos os oito sutrs em 360 ° ao longo de um tempo de digitalização 4 s.
    Nota: por exemplo, se os SUTRs são girados para 4S, o PLD entrega 8.000 (= 4 x 2.000) pulsos e cada SUTR recolhe 8000 A-Lines. Estas 8.000 a-Lines são reduzidas a 400 pela média sobre 20 sinais (após A média A-Lines = 8000/20 = 400). Um programa de reconstrução baseado em Delay-and-Sum volta algoritmo de projeção é usado para descobrir o raio de digitalização de cada SUTR.
  4. Desative a saída do gerador de função para desligar a emissão de laser.
  5. Usando o algoritmo de reconstrução em software de processamento de dados (ver tabela de materiais) descobrir o raio de digitalização de todos os oito sutrs por tentativa e erro, usando o algoritmo de retroprojeção.
  6. Defina os parâmetros no software de aquisição de dados (consulte a tabela de materiais) para aquisição de 45 ° ao longo de um tempo de digitalização de 0,5 s.
    Nota: por exemplo, se os SUTRs são girados para 0.5 s, o PLD entrega 1.000 (= 0,5 x 2.000) pulsos e cada SUTR recolhe 1000 A-Lines. Estas 1.000 a-Lines são reduzidas a 400 pela média sobre 20 sinais (após A média A-Lines = 1000/20 = 50).
  7. Ative a saída do gerador de função para ligar a emissão de laser.
  8. Execute o programa de aquisição de dados (consulte a tabela de materiais) para rodar todos os oito sutrs em 45 ° para obter dados de controle inicial antes da administração do ICG.
  9. Desative a saída do gerador de função para desligar a emissão de laser.
  10. Identifique a veia cauda do animal e injete 0,3 mL de ICG (ver tabela de materiais) (323 μm) na veia cauda do rato.

4.

Nota: 1,25 mg de pó de ICG foi pesado usando uma máquina de MICROPESAGEM e misturado com 5 mL de água destilada para obter uma concentração de 323 μM para a solução de ICG.

  1. Ative a saída do gerador de função para ligar a emissão de laser.
  2. Execute o software de aquisição de dados (ver tabela de materiais) programa para adquirir a-Lines sobre um 0,5 s tempo de digitalização em 45 ° rotação.

5.

Nota: as linhas adquiridas durante um tempo de digitalização de 0,5 s são usadas para gerar uma imagem de corte transversal. Há um intervalo de tempo de ~ 0.4-0.6 s entre cada varredura.

  1. Depois que a aquisição de dados for mais, usando o algoritmo de retroprojeção no software de processamento de dados (consulte tabela de materiais), reconstrua a imagem do cérebro transversal das linhas a salvas.
  2. Desligue o laser e, em seguida, desligue a máquina de anestesia, abaixe o laboratório-Jack e retire o animal do palco. Devolva o animal para a gaiola e monitore até que recupere a consciência.

figure-protocol-1
Figura 1: esquema do sistema de desktop PLD-Pat. (A) esquema do desktop PLD-Pat criado. PLD: diodo de laser pulsado, OD: difusor óptico, SUTR: refletor acústico baseado transdutor de ultra-som de elemento único, AM: máquina de anestesia, CSP: placa de digitalização circular, SM: motor deslizante, LDU: unidade de condução a laser, AMP: amplificador, DAQ: cartão de aquisição de dados. (B) arranjo circular de oito sutrs em torno do centro de digitalização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

A potencialidade do sistema desktop descrito de PLD-PAT para a imagem latente dinâmica do cérebro in vivo foi mostrada neste protocolo com resultados correspondentes. A capacidade de alta velocidade da imagem latente do sistema de desktop PLD-PAT foi demonstrada realizando a imagem latente in vivo do cérebro de ratos fêmeas saudáveis. Os sinais do PA foram coletados usando oito SUTRs que giram em 360 ° e em 45 ° em torno do cérebro do rato em velocidades da varredura de 4 s e de 0,5 s, re...

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Discussão

Este trabalho apresenta um protocolo para usar um sistema de desktop PLD-PAT para a realização de experimentos em pequenos animais como ratos para a imagem cerebral in vivo e rápido-captação dinâmica e processo de apuramento de agentes de contraste como ICG. Volumosos, caros sistemas OPO-PAT levam vários minutos (2-5 min) para adquirir uma única imagem transversal in vivo. Um sistema PLD-PAT portátil compacto, de baixo custo e de primeira geração fornece imagens in vivo transversais únicas em 5 s. Em contraste, um sistem...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros relevantes ou potenciais conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

A pesquisa é apoiada pelo Ministério da saúde de Singapura do Conselho Nacional de pesquisa médica (NMRC/OFIRG/0005/2016: M4062012). Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Chow Wai Hoong Bobby pelo apoio da oficina de máquinas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fonte de alimentação de 12 VVoltcraftPPS-11810Para fornecer tensão de operação para PLD
Refletor acústicoOlympusF102Refletor de 45 graus aumentado para o transdutor de ultrassom
Tanque de água acrílicoOficina NTUFeito sob medidaÉ usado para reter a água que atua como um meio de acoplamento acústico entre o cérebro do animal e o detector
MáquinaanestésicaMáquina de anestesia sem reinalação médica plus pte ltdcom concentrador de oxigênio.Fornece oxigênio e isoflurano ao animal
Distribuidor de animaisIn Vivos Pte Ltd, CingapuraDistribuidor de animais que fornece pequenos animais para fins de pesquisa
Oficina NTUde suporte de animaisFeito sob medidaUsado para segurar o animal em seu abdômen
Máscara de respiraçãoOficina NTUFeito sob medidaUsado junto com o suporte de animais para fornecer mistura de anestesia ao animal
de NTUde scanner circularO scanner feito sob medidaé feito de alumínio
DAQ (aquisição de dados) CardSpectrumM2i.4932-exp16 bits, 30 Ms/s, 8 canais, 1 Gs,
PCIe Software de aquisição de dadosNational Instruments Corporation, Austin, TX, EUA)NI LabVIEW 2015 SP1 (32 bits)Programa baseado em LabVIEW desenvolvido em nosso laboratório para controlar o motor de passo e adquirir os sinais PA do detector
Processamento de dados softwareMatlab (Mathworks, Natick, MA, EUA)Matlab R2015bCódigo Matlab desenvolvido no nosso laboratório para reconstrução de imagens PA transversais
Gerador de funçõesRIGOLDG1022Para alterar a taxa de repetição do PLD. Ele fornecerá sinal TTL para sincronizar o DAQ com a excitação do laser.
Amplificador de sinal de baixo ruídoGenetronFeito sob medida usando Mini-circuitos, ZFL-500LN-BNCPara receber e amplificar o sinal PA do SUTR. Seu ganho é de 24 dB.
Difusor ópticoThorlabsDG-120Usado para tornar o feixe de laser homogêneo
Diodo laser pulsadoQuantel, FrançaQD-Q1924-ILO-WATERÉ a fonte de laser de excitação com especificações de comprimento de onda de 816 nm, 3,4 mJ por energia de pulso, largura de pulso de 107 ns, taxa máxima de repetição de pulso de 2 KHz, dimensões: 13,0 x 7,6 x 5,0 cm
RatosIn Vivos Pte Ltd, SingapuraNTac:SD, Sprague Dawley / SDFeminino, peso 100± 10g, linhagem de ratos: Sprague Dawley, idade: 4-5 semanas
Motor de passo com caixa de engrenagensLIN Engineering (Servo Dynamics)Motor: CO-5718L-01P-RO, Caixa de engrenagens: DPL64/1; Fonte de alimentação PW-100-24Para mover o suporte do detector em uma geometria circular. Torque: 2,08 Nm, Inércia do rotor: 2,6 kg-cm2
Gel de ultrassomProgress/parker gel aquosônicoPA-GEL-CLEA-5000Gel de ultrassom transparente
Transdutor de ultrassomOlympusV309-SU/ U8423013Sensores ultrassônicos usados para detecção fotoacústica. Frequência central 5 MHz, 0,5 in
Fonte de alimentação variável de alta tensãoElektro-AutomatikEA-PS 8160-04 TPara alterar a potência de saída do laser
Oficina

Referências

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