Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.
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Artigo de método
Purificação de plaquetas de sangue de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plaquetas são purificadas de sangue total para estudar as suas propriedades funcionais, que devem estar livres de glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e proteínas plasmáticas. Nós descrevemos aqui a purificação das plaquetas do sangue do rato usando o meio do inclinação Three-Fold mais iohexol relativo ao volume e à centrifugação da amostra de sangue em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A recuperação/rendimento das plaquetas purificadas foi de 18,2-38,5%, e as plaquetas purificadas encontravam-se em estado de repouso, o que não continha nenhum número significativo de RBC e WBC. As plaquetas purificadas tratadas com trombina apresentaram até 93% de ativação, indicando sua viabilidade. Nós confirmamos que as plaqueta purified são suficientemente puras usando a avaliação cytometric e microscópica do fluxo. Estas plaquetas podem ser usadas para a expressão gênica, ativação, liberação de grânulos, agregação e ensaios de aderência. Este método pode ser usado para a purificação de plaquetas do sangue de outras espécies também.
Introdução
As plaquetas são um componente do sangue que funciona como um iniciador de coagulação do sangue em resposta a danos no vaso sanguíneo. Eles se reúnem no local da lesão para ligar a parede do vaso1. As plaquetas são fragmentos de anucleato de citoplasma derivados dos megacariócitos da medula óssea a influência da Trombopoietina e entram na circulação2. Eles são considerados metabolicamente ativos e capazes de detectar o ambiente extracelular ativando cascatas de sinalização intracelular que resultam em espalhamento de plaquetas, agregação e formação de plugue hemostático1,3. Além de hemostasia/trombose e cicatrização de feridas4, as plaquetas desempenham um papel importante nas respostas inflamatórias hospedeiras, angiogênese e metastatis3,5,6,7, o 8.
As plaquetas são purificadas do sangue para estudar as suas propriedades bioquímicas e fisiológicas, que devem ser livres de outros componentes sanguíneos. Desde que os glóbulos vermelhos (RBC) e glóbulos brancos (WBC) contêm significativamente mais RNA e proteínas do que as plaquetas9,10, a presença de mesmo um pequeno número destas células pode interferir com a análise transcriptômicos e proteômica de RNA e proteínas derivadas de plaquetas. Nós encontramos que as plaqueta purified ativaram com o anticorpo da ligação da trombina tal como o anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e o anti-P-Selectin mais eficientemente do que plaquetas de sangue inteiras.
Uma vez que as plaquetas são frágeis, é importante tratar as amostras o mais suavemente possível. Se as plaquetas forem ativadas, elas liberam o conteúdo do grânulo e, em última análise, degradam. Portanto, para manter as propriedades funcionais das plaquetas intactas, é importante manter a quiescência plaquetária durante o isolamento. Vários protocolos descreveram o isolamento de plaquetas de humanos, cães, ratos e primatas não humanos por vários métodos1,10,11,12. Alguns dos métodos requerem várias etapas como a coleta de plasma rico em plaquetas por centrifugação, filtração por coluna de separação, seleção negativa de plaquetas com RBC-e anticorpo específico para WBC conjugado com grânulos magnéticos, e assim por diante, que são consome muito tempo e pode degradar as plaquetas e o seu conteúdo.
Ford e seus colegas descreveram a purificação da plaqueta do sangue humano usando o meio do iohexol11. Este método utiliza um volume semelhante de amostra de sangue e meio durante a purificação. Uma vez que os seres humanos produzem um maior volume de sangue, é relativamente fácil de purificar as plaquetas.
O iohexol é um meio inerte de gradiente de densidade universal que é livremente solúvel em água e utilizado no fracionamento de ácidos nucleicos, proteínas, polissacarídeos e nucleoproteínas13,14. Tem baixa osmolaridade e é não-tóxico, tornando-se assim um meio ideal para a purificação de células vivas intactas11. É um meio não particulado; Conseqüentemente, a distribuição das pilhas em um inclinação pode ser determinada usando o Hemocytometer, o cytometer do fluxo, ou o Espectrofotômetro. Não interfere com a maioria da reação enzimática ou química das células ou fragmentos celulares após a diluição.
O rato serve como um modelo animal importante para muitas doenças humanas15,16, 17,18. Há alguns artigos publicados que descrevem a purificação de plaquetas de camundongo19,20. No entanto, o mouse produz um volume relativamente menor de sangue, o que torna difícil para purificar as plaquetas. Se o mesmo pequeno volume de meio de gradiente e amostras de sangue é usado, a camada plaquetária não pode ser claramente separada da camada de RBC-WBC após a centrifugação. Neste artigo, nós descrevemos um método rápido e simples da purificação da plaqueta do rato com o meio do inclinação do iohexol do três-dobra mais relativo ao volume da amostra de sangue e à centrifugação de baixa velocidade. Também ativamos as plaquetas purificadas com trombina e investimos sua qualidade com citometria de fluxo e microscopia.
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Protocolo
A coleta de sangue do rato deve ser conduzida com o cuidado animal institucional apropriado e aprovação do Comitê do uso.
Nota: O protocolo de purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo na Figura 1.
1. coleta de sangue
- Adicionar 25 μL de 3,2% de citrato de sódio (pH 7,2) como anticoagulante e 0,4 mM de Gly-pro-ARG-pro (GPRP) num tubo de polipropileno.
-
Colete aproximadamente 200 μL de sangue do mouse C57BL/6 usando sangramento retro-orbital.
Nota: o sangue pode ser coletado de qualquer tipo de estirpe do rato independentemente da idade ou sexo.- Utilize 2 mL de isoflurano em qualquer tipo de câmara para anestesiar o rato.
Nota: A profundidade da anestesia é verificada por sinais de respiração aumentada e diminuição do movimento. O rato não deve responder ao movimento da câmara de anestesia, ou a ser manuseado. Se o rato é responsivo ao movimento ou à manipulação, a seguir exige mais tempo para manter-se na câmara da anestesia. - 1.2.2 Abra a pálpebra direita ou esquerda do mouse e insira um tubo capilar de 7,5 cm (0,12 cm de diâmetro) no plexo vascular do olho.
- Gire o tubo capilar uma meia volta ao aplicar a pressão ao tubo capilar para quebrar os vasos e iniciar o fluxo sanguíneo. Segure o animal de cabeça para baixo sobre o frasco de coleta para ser preenchido por ação capilar.
- Uma vez que o volume de sangue apropriado é coletado, retire o tubo capilar e feche o olho aplicando a pressão suave para 30 s na pálpebra com gaze. Uma vez que o sangramento é interrompido, retorne o mouse para sua gaiola e monitor de sangramento.
- Verific os olhos para o traumatismo 1-2 dias após o sangramento retro-orbital. Retire qualquer rato do estudo mostrando sinais de trauma significativo para o olho, como resultado do procedimento e eutanizar.
Nota: O rato não deve sofrer qualquer tipo de tratamento que possa inibir as plaquetas durante pelo menos duas semanas antes da recolha de sangue. A amostra de sangue deve ser usada para a purificação da plaqueta dentro de uma hora de sangrar o rato.
- Utilize 2 mL de isoflurano em qualquer tipo de câmara para anestesiar o rato.
2. purificação de plaquetas
Nota: A purificação da plaqueta deve ser realizada à temperatura ambiente para evitar a sua degradação. Certifique-se de que a temperatura dos reagentes e dos instrumentos está entre 18 a 22 ° c. Para evitar a degradação plaquetária, a pipetagem rápida e a agitação vigorosa devem ser evitadas durante o procedimento.
- Adicionar 600 μL de meio de gradiente iohexol (12% de iohexol em pó em 0,85% de cloreto de sódio, 5 mM de tricina, pH 7,2)11 em um tubo de 1,5 ml.
- Adicionar 200 μL de amostra de sangue lentamente no lado do tubo na parte superior do meio de gradiente com uma ponta de pipeta de furo largo para que o sangue e o meio de iohexol não se misturem (Figura 2a).
- Centrifugue a amostra que contém o tubo em 400 x g por 20 min a 20 ° c em um rotor de balde oscilante com aceleração lenta e desaceleração.
- Colete a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração de camada pobre em plaquetas (total de 300 a 400 μL) usando uma ponta de pipeta de furo largo sem perturbar as camadas de RBC e WBC (Figura 2b). Transfira a amostra de plaquetas para um novo tubo.
Nota: Se a contagem de plaquetas for menor no sangue ou se for utilizado um volume menor de sangue, a camada rica em plaquetas e a camada pobre em plaquetas podem ser vistas como uma única camada. - Adicionar 1 mL de PBS à amostra de plaquetas, misturar invertendo e centrifugar a 800 x g durante 10 min a 20 ° c num rotor de balde oscilante. Elimine a solução completamente e adicione 200 μL de PBS para suspender as plaquetas com pipetagem ligeira.
Nota: Esta etapa é opcional, pois remove o gradiente médio e as proteínas plasmáticas e aumenta a sensibilidade das plaquetas aos agonistas, como a trombina. Desde que as centrífugas diferentes têm programas diferentes, a aceleração/desaceleração lentas podem ser determinadas lendo o manual do usuário do centrifugador. - Transfira 30 μL desta amostra para um novo tubo para contar as plaquetas. As plaquetas restantes podem ser usadas para ensaios bioquímicos e fisiológicos, como Ativação plaquetária, agregação, liberação de grânulos, etc.
- Para o RNA ou a extração da proteína, centrifugue a amostra da plaqueta em 800 x g por 10 minutos para pellet as plaquetas. Descarte o sobrenadante completamente sem perturbar o pellet. Adicione o volume desejado de RNA ou tampão de lise de proteína para lyse as plaquetas.
3. contando as plaquetas
- Contar todas as células sanguíneas sem diluição e plaquetas purificadas (diluídas de 2 a 5 vezes com PBS) utilizando um analisador automatizado de células. Use 30 a 50 μL de amostras para contagem.
- Calcule o número total de plaquetas multiplicando pelo volume da amostra.
- Calcule a percentagem de rendimento/recuperação de plaquetas purificadas.
- Contar o RBC e WBC na amostra de plaquetas purificada (diluído 50 a 100 vezes com PBS) com um hemocitômetro e microscópio.
4. Ativação plaquetária
- Em um tubo, adicione 1 a 2 milhões plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração (PBS com 2% de soro bovino fetal, FBS).
- Para o número múltiplo de amostras, faça uma mistura mestra de anticorpos com 1 μL (0,5 mg/mL) do seguinte: PE-Cy7 rato anti-rato TER 119, PE rato CD45, FITC rato anti-rato CD41, e APC rato anti-rato/humano CD62P (P-Selectin) para detectar RBC, WBC, plaquetas, e plaquetas ativadas, respetivamente. Adicione a mistura mestra aos tubos para manchar as pilhas. Não adicione trombina.
- Em outro tubo, adicione 1 a 2 milhões de plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração e peptídeo de 0,4 mM GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas e manchar as células seguintes passo 4,2.
Nota: GPRP deve ser adicionado à amostra antes de adicionar trombina para evitar a formação de agregados ou coágulos através da ativação plaquetária. A concentração de trombina deve ser otimizada para obter boa ativação de plaquetas. Após a ativação plaquetária, contagens de eventos são diminuídas durante a aquisição de amostras por citometria de fluxo. - Como um controle positivo, adicionar 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração em um tubo e 0,4 mM peptídeo GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas. Como controlo negativo, adicione 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração. Não adicione trombina na amostra de controle negativo. Manchar as células seguintes passo 4,2.
- Para controle de isotipo de citometria de fluxo, rótulo 5 tubos com não manchado, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Adicionar 100 μL de tampão de coloração, 1 μL de sangue e 1 μL do respectivo anticorpo aos tubos rotulados para manchar as células.
- Incubar amostras para manchar por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
- Lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo. Centrifugue a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o tampão de coloração com cuidado sem desalojar o pellet.
- Adicionar 300 μL de tampão de coloração a cada tubo, misturar suavemente e transferir para um tubo FACS. Armazene as amostras manchadas no escuro até que sejam analisadas com um citometro de fluxo.
5. análises de citometria de fluxo de plaquetas
-
Criar um novo experimento e gerar log Forward Scatter versus log Side dispersão de pontos e atribuir portões para Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquetas) e CD62P APC (plaquetas ativadas) populações de acordo com a estratégia de gating escolhida para o experiência no software FACS DIVA.
- Abra a hierarquia de população escolhendo Mostrar hierarquia de população na guia populações . Edite a hierarquia populacional verificando a estratégia de gating e renomeando corretamente as portas.
- Abra a exibição de estatísticas escolhendo criar exibição de estatísticas. Edite a exibição de estatísticas de acordo com as preferências do usuário clicando com o botão direito na exibição de estatísticas e selecionando Editar exibição de estatísticas.
- Escolha uma cor para cada portão que aprimore o aspecto visual do layout clicando duas vezes na caixa correspondente à população.
- Na janela do Citometro , clique na guia parâmetros e ajuste as tensões para parâmetros para visualizar a população de interesse nas parcelas.
- Ajuste as tensões para cada um dos parâmetros para que a população negativa possa ser distinguida da população positiva. Antes de gravar as amostras para o controlo de compensação, verifique se os controlos positivos com uma única mancha estão em escala (certifique-se de que os picos positivos são visíveis e não demasiado distantes para a direita).
Nota: Se os picos positivos estão fora de escala, as tensões devem ser ajustadas para ver as populações positivas. - Registre as células manchadas de cor única para controles de compensação (sem manchas, PE-Cy7, PE, FITC e APC).
- Se as portas de controle positivo não estiverem configuradas corretamente, ajuste-as alterando as tensões.
- Vá para experimento ≫ configuração de remuneração ≫ calcular compensação. Escolha aplicar somente na janela resultante.
- Alterne para a planilha global clicando no botão de alternância na parte superior, à esquerda da janela da planilha.
- Carregar a amostra de controle positivo e adquirir células suficientes para ajustar a compensação e as portas.
- Carregue a amostra novamente e verifique se cada parcela mostra a população de células esperada com base no anticorpo manchado de fluorocromo. Adquira e registre 100.000 eventos para amostras de sangue total e 10.000 eventos para plaquetas purificadas. Carregue as amostras uma a uma até que a aquisição seja concluída.
- Analise os dados de citometria de fluxo com o software com parcelas e portões apropriados (Figura 3)
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Resultados
O resumo da purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem a coleção do sangue do rato usando o sangramento retro-orbital na presença de um anticoagulante, adição da amostra de sangue no meio do inclinação do iohexol, centrifugação em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A qualidade das plaquetas purificadas foi avaliada com microscopia e citometria de fluxo após coloração com anticorpo para detecção de células ...
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Discussão
Comumente, as plaquetas são isoladas por centrifugação de baixa velocidade que produz plasma rico em plaquetas que contém um número significativo de células sanguíneas, detritos celulares e proteínas plasmáticas que podem interferir com os ensaios e necessidades bioquímicas e fisiológicas purificação mais adicional21. Portanto, é importante usar um método rápido e simples que pode produzir plaquetas puras sem grandes contaminantes. O protocolo aqui apresentado descreve a purificação de plaquetas d...
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um financiamento de start-up de Cincinnati Children ' s Research Foundation e uma Universidade de Cincinnati Grant Pilot translational para M.N. Gostaríamos de agradecer o Cincinnati Children ' s Hospital pesquisa fluxo cytometry núcleo para seus serviços.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| APC rato anti-camundongo/humano CD62P (P-selectina) | Thermoscientific | 17-0626-82 Marcador de | ativação de plaquetas |
| Tubo Eppendorf | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tubo para centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Item não catalogado | Análise de plaquetas e |
| tubo FACS | Fisher Scientific | 352008 | Tubos para fluxo citomtério |
| Soro fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingrediente para tampão de coloração |
| FITC rato anti-camundongo CD41 | BD Biosciences | 553848 | Marcador de plaquetas |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | Item não catalogado | Análise de plaquetas e sangue total |
| Software FlowJo | FlowJo, Inc. | Item não catalogado | Análise de plaquetas e sangue total |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Previne a formação de coágulos plaquetários |
| Hematócrito Tubo capilar | Fisher Scientific | 22-362566 | Tubo capilar de coleta de sangue |
| Hemavet | Drew Scientific | Item não catalogado Analisador de | células sanguíneas |
| Hemocitômetro | Hausser Câmara de | contagem de células | 3100 |
| Isoflurano | Baxter | 1001936040 | Uso para anestesiar microscópio de camundongo |
| (Olympus CKX41) | Olympus | Item não catalogado | Monitoramento e contagem de células |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradiente médio |
| PE rato anti-rato CD45 | BD Biosciences | 561087 | marcador WBC |
| PE-Cy7 rato anti-rato TER 119 | BD Biosciences | 557853 | marcador RBC |
| Pontas de pipeta 200 µ L, de diâmetro largo | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferência de amostras de sangue e plaquetas |
| Pontas de pipeta 1000 µ L, furo largo | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferência de amostras de sangue e plaquetas |
| Fosfato buffured salino (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Tampão para lavagem e diluição |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S7653 | Soro fisiológico |
| Citrato de sódio | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anticoagulante |
| Tampão de coloração | Interno | Item não catalogado | Tampão de lavagem e diluição |
| Água estéril | Interno | Item não catalogado | Solvente |
| Centrífuga de mesa | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Centrífuga de rotor de balde oscilante |
| Trombina | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Agonista de ativação plaquetária |
| Tricina | Tampão Sigma-Aldrich | T0377 | para meio Nycodenz |
Referências
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Reimpressões e permissões
