Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Resumo

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Resumo

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

Introdução

A análise de um gene ' a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.

O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli¹. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema

Protocolo

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPC^r, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração⁵.

1. projeto da primeira demão

1. Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc.
   Nota: As sequências de primer utilizadas neste protocolo são mostradas na tabela 1. Método de PCR de fusão em duas etapas para a geração de S. mutans hi....

Resultados

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spect.......

Discussão

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPC^r-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPC^r. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ' regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando ascendentes pode .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	Para eletroforese em gel de agarose
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Sistema de cultura anaeróbica
Anticorpo monoclonal Anti-His-Tag	MBL	D291-7	conjugado com HRP
	Thermo Fisher Scientific	23227	Medição da concentração
de proteínaCaldo de infusão cérebro-coração	Becton, Dickinson	237500	Meio de cultura bacteriana
CBB R-250	Wako	031-17922	Para coloração de biofilme
Unidade de ultrafiltração centrífuga	Sartorius	VS2032	Substituição de tampão e concentração de proteínas
Centrífuga	Kubota	7780II
Coluna cromatográfica	Bio-Rad	7321010	Para
a braçadeira de membrana de diálise	IMAC Fisher marca	21-153-100
Tubulação de diálise	Como um	2-316-06
DNA polimerase	Takara	R045A	Sequenciamento de DNA polimerase de alta fidelidade
	Eurofins Genomics
ECL substrato	Bio-Rad	170-5060	Para western blotting
EDTA (0,5 M pH 8,0)	Wako	311-90075	Preparação de tampão Tris-EDTA
Cubeta de eletroporação	Bio-Rad	1652086	0,2 cm de folga
Electroporator	Bio-Rad	1652100
Solução EtBr	Nippon Gene	315-90051	Para eletroforese em gel de agarose
Cortador de banda de gel	Nippon Genetics	FG-830
Gel kit de extração	Nippon Genetics	FG-91202	Extração de DNA de gel de agarose
Imager	GE Healthcare	29083461	Para SDS-PAGE e western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Tampão de ligação e preparação do tampão de eluição
Incubadora	Nippon Medical & Instrumentos Químicos	EZ-022	Configuração de temperatura: 4 &graus;
C Incubadora	Nippon Medical & Instrumentos Químicos	LH-100-RDS Configuração de	temperatura: 37 &graus; C
Filtro de membrana	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µ
Microcentrífuga	m Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
NaH2PO4· 2H2O	Wako	192-02815	Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
NaOH	Wako	198-13765	Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Precipitação de sulfato de amônio
Resina carregada com Ni	Bio-Rad	1560133	Para IMAC
Primers de PCR	Eurofins Genomics	Proteína personalizada
padrão	Bio-Rad	161-0381	Para SDS-PAGE e western blotting
Aparelho de filtração de solvente	As One	FH-1G
Spectinomicina	Wako	195-11531	Antibióticos; use a 100 μ g/mL
Filtro de seringa estéril	Merckmillipore	SLGV004SL	0,22 µ m de diâmetro
Streptococus mutans Δ gtfC	Cepa de estoque no laboratório.		gtfC substituído por spcr
Streptococus mutans Cepa de estoque UA159	no laboratório.		S. mutans ATCC 700610, estirpe selvagem
Sacarose	Wako	196-00015	Para desenvolvimento de biofilme
TAE (50 &vezes)	Nippon Gene	313-90035	Para eletroforese em gel de agarose
Termociclador	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA preparação de tampão

Kit de ensaio de proteína BCA de diâmetro