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Artigo de método

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

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DOI:

10.3791/59804

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14 de setembro de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Resumo

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

Introdução

A análise de um gene ' a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.

O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli1. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema1. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método2do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN3 (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).

Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente4,5. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.

No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans6. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPCr)7 loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico6. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)2,5 . A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.

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Protocolo

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPCr, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração5.

1. projeto da primeira demão

  1. Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc.
    Nota: As sequências de primer utilizadas neste protocolo são mostradas na tabela 1. Método de PCR de fusão em duas etapas para a geração de S. mutans his-gtfc é esquematicamente ilustrado na Figura 2.
    1. Primers de design(gtfc-Reverse e SPCr-Forward) para a fixação de sua seqüência de codificação de Tags, interpor entre o gene gtfc e o SPCr (Figura 2a).
      1. Inclua o vinculador GS e sua sequência de codificação de tag em ambos os primers Gtfc-Reverse e SPCr-Forward, nos quais 24 bases nas regiões 5 ' são complementares entre si.
        Nota: a seqüência do aminoácido do vinculador GS e sua Tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-
      2. Projete um primer gtfc-forward para direcionar o gene gtfc no genoma de S. mutans WT > 1 KB a jusante do gene e o SPCr-Reverse primer para atingir a região de flanqueamento a jusante do SPCr no S. mutans ∆gtfc. Ajuste a temperatura dederretimento 8 (Tm) dos primers gtfc-Forward e SPCr-reverso para combinar com as temperaturas de derretimento do gtfc-reverso e do SPCr- primers Forward, respectivamente.
    2. Projete primers aninhados (aninhados-Forward e Nested-reverso) para o segundo PCR (Figura 2b).
    3. Primers do projeto (Gtfc-para diante e colônia-reverso) específicos para o ADN genomic do transformante (Figura 2C; os primers são usados para a PCR da colônia).
      Nota: Os amplicões straddle a beira entre gtfc e SPCr. O primer Gtfc-Forward pode ser aplicado como primer dianteiro.
    4. Projete primers (up-Forward e para baixo-reverso) para a confirmação final da geração de S. mutans his-gtfc (Figura 2C; o produto do PCR amplificado pelos primers é usado para arranjar em seqüência do ADN).

2. extração de DNA genômica de S. mutans

Nota: Cada cepa de S. mutans deve ser cultivada em meio de infusão de coração cerebral (BHI) a 37 ° c em condições anaeróbias. As cepas mutantes de s. mutans ∆Gtfc e s. mutans his-gtfc são cultivadas em BHI suplementado com 100 μg/ml de Spectinomicina.

  1. Streak s. Mutans WT e s. mutans ∆gtfc separadamente para cada uma das placas de agar BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
  2. Escolha colônias únicas de s. Mutans WT ou s. mutans ∆gtfc usando um palito esterilizado e inoculado em 1,5 ml de caldo BHI. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
    Nota: As colônias podem ser usadas como fonte de DNA de modelo para a primeira PCR (etapa 3,1).
  3. Transfira 1 mL de cada cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a cultura por 1 minuto em 15.000 x g.
  4. Retire o sobrenadante e adicione 1 mL do tampão Tris-EDTA (pH 8,0) para suspender o pellet celular.
  5. Centrifugar a suspensão durante 1 min a 15.000 x g. Retire o sobrenadante. Ressuscitem o pellet celular em 50 μL de tampão Tris-EDTA (pH 8,0).
  6. Aqueça a suspensão usando uma incubadora do bloco por 5 minutos em 95 ° c. Centrifugar a suspensão durante 5 min a 15.000 x g.
  7. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (o sobrenadante servirá como DNA de modelo para a primeira PCR).

3. amplificação do PCR

Nota: A tabela 1, tabela 2e tabela 3 resumem os primers, reagentes e ciclos de amplificação de PCR, respectivamente.

  1. Realize a primeira PCR utilizando o genoma s . Mutans WT e s. mutans ∆gtfc como modelos de PCR. Amplificar as regiões abrigando a parte a jusante do gene Gtfc e aqueles que abriam o SPCr usando os primers descritos na etapa 1.1.1.2 (Figura 2a).
  2. Electrophorese cada produto do PCR no gel do agarose de 1%. Extirpar os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 BP e 2.000 BP. purifique os fragmentos dos géis usando o método de extração de gel baseado em membrana de sílica.
    Nota: Os procedimentos básicos para o PCR9, a electroforese10do gel do ADN, e a purificação11 do ADN são detalhados em outra parte.
  3. Realize uma segunda PCR utilizando os produtos da primeira PCR (aproximadamente equimolar) como modelos de PCR com os primers aninhados-Forward e Nested-reverso (Figura 2b).
  4. Electrophorese um décimo da mistura do PCR no gel do agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 BP.
  5. Precipitate o produto restante do PCR.
    Nota:     a purificação do produto do PCR não é necessária, porque os amplicões não específicos gerados pelo segundo PCR não interferem com o recombination homous.
    1. Adicionar água nuclease-livre à mistura de PCR e trazer o volume total para 100 μL, seguido por 0,1 volume (10 μL) de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes (250 μL) de etanol absoluto. Misture e guarde a mistura durante 10 min à temperatura ambiente (RT).
    2. Centrifugue a amostra durante 20 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de 70% de etanol para lavar o pellet de DNA.
    3. Centrifugue a amostra durante 5 min a 15.000 x g a 4 ° c. Descarte o sobrenadante. Secar ao ar e dissolver o pellet de DNA com 10 μL de água sem nuclease.

4. transformação celular

  1. Prepare o WT s. Mutans competente para introduzir o segundo produto de PCR seguindo os passos descritos na publicação anterior5. Armazene as células a-80 ° c.
    Nota: Para este experimento, as células de s. Mutans WT já foram preservadas em-80 ° c para gerar s. mutans ∆gtfc.
  2. Misturar 5 μL do segundo produto de PCR concentrado para a alíquota de 50 μL de células de gelo-frias competentes congeladas anteriormente. Adicione a mistura em cubos de electroporação. Dê um único pulso elétrico (1,8 quilovolts, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) às pilhas usando o instrumento do Electroporation.
  3. Ressuscitem as células em 500 μL de caldo BHI. Imediatamente, espalhe 10 – 100 μL da suspensão para as placas de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar as placas por 2 – 6 dias a 37 ° c até que as colônias tenham crescido suficientemente para serem colhidas.

5. verificação darecombinação e do armazenamento de Gome

  1. Realize PCR de colônia, usando primers gtfC-Forward e Colony-Reverse para a tela para a recombinação. Electrophorese cada produto do PCR da colônia em um gel do agarose. Confirme o fragmento de DNA de aproximadamente 1.500 BP.
  2. Escolha uma das colônias positivas usando um palito esterilizado e subcultura as células durante a noite em 2 mL de caldo BHI contendo Spectinomicina.
  3. Misture 0,8 mL de cultura bacteriana com 0,8 mL de glicerol de 50% estéril e estoque a-80 ° c ou-20 ° c.
  4. Transfira os restantes 1 mL de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Repita os passos 2.3 – 2.7 para extrair o DNA genómico das células.
  5. Execute o PCR usando os primers up-Forward e down-Reverse e o ADN genomic como um molde. Repita o passo 3,2 para purificar o produto de ADN amplificado dos géis.
  6. Determine a seqüência do ADN do amplicon purified pelo sequenciamento do ADN.
    Nota: Certifique-se de confirmar a geração de S. mutans his-gtfc por sequenciamento de DNA.

6. purificação de polyhistidine-Tagged GTF-SI

  1. Streak S. mutans his-gtfc em uma placa de agar BHI contendo Spectinomicina. Incubar-os durante a noite a 37 ° c.
  2. Pegue uma única colônia usando um palito esterilizado e células de subcultura em 3 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
  3. Prepare dois frascos cônicos com 1 L de caldo BHI sem Spectinomicina. Inocular 1 mL da suspensão da cultura durante a noite em 1 L do caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
  4. Concentrado de proteínas do sobrenadante de cultura por precipitação de sulfato de amônio.
    Nota:     extrato de corpos celulares se uma proteína alvo é intracelular. Os procedimentos básicos para a precipitação do sulfato do amónio são detalhados em outra parte12.
    1. Centrifugue a suspensão da cultura bacteriana durante 20 min a 10.000 x g a 4 ° c. Recupere o sobrenadante de cultura em uma taça de vidro de 3 litros.
    2. Adicionar 1.122 g de sulfato de amônio a 2 L do sobrenadante (80% de saturação) com agitação vigorosa utilizando um agitador magnético. Deixe o precipitado formar por 4 h ou mais a 4 ° c com agitação.
      Nota: a formação do precipitado pode ser continuada durante a noite.
    3. Centrifugue a solução precipitada com sulfato de amónio a 15.000 x g durante 20 min a 4 ° c. Decantar o sobrenadante.
    4. Colete o precipitado com uma espátula e transfira para uma taça de vidro de 200 mL. Ressuscita os pellets em 35 mL de tampão de ligação (50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).
    5. Dialyze a suspensão de encontro a 2.500 mL do tampão de ligação usando uma tubulação regenerada da diálise da celulose, em 4 ° c, com agitação. Substitua a solução de diálise após 2 h e continue a diálise durante a noite.
    6. Substitua novamente a solução de diálise. Continuar a Dialize para um adicional de 2 h.
  5. Centrifugue a suspensão Dialítica a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana usando equipamento de filtração por sucção. Transfira o filtrado para um balão de 75 cm2 .
  6. Fractionate o GTF-SI polyhistidine-etiquetado da suspensão filtrada pela cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC).
    1. Transfira 2 mL da pasta de resina IMAC com carga de Ni (aproximadamente 1 mL de resina) para uma coluna cromatográfica cuja saída é montada em um tubo de silicone. Remova a solução de armazenamento pelo fluxo de gravidade.
      Atenção: Não deixe a resina secar ao longo do IMAC.
    2. Adicionar 3 mL de água destilada na coluna para lavar a resina. Adicionar 5 mL do tampão de ligação para equilibrar a resina.
    3. Desligue o fluxo com um galo pitada Hoffmann. Adicione 5 mL da suspensão filtrada da etapa 6,5 para fazer a pasta.
    4. Adicione toda a pasta à suspensão filtrada restante. Agitar suavemente a mistura durante 30 min a 4 ° c.
    5. Coloque a mistura de volta na coluna. Retire a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mL de tampão de ligação.
      Nota: Ajuste a vazão para aproximadamente 2 mL/min com um pau de pinça Hoffmann em todo o IMAC subsequente.
    6. Elute o GTF-SI de recombinação com 20 mL do amortecedor da eluição (50 milímetro NaH2po4, 300 milímetro NaCl, 500 milímetros imidazole, pH 8,0).
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O eluato deve ser conservado a 4 ° c. A resina IMAC pode ser reutilizada. Consulte as instruções para a resina IMAC.
  7. Substitua o tampão de eluição pelo tampão de armazenamento (tampão fosfato de 50 mM, pH 6,5) e concentre a solução de GTF-SI recombinante em aproximadamente 1 mL utilizando uma unidade de ultrafiltração centrífuga. Armazene a solução de GTF-SI recombinante a 4 ° c.
    Nota: Confirme a purificação polyhistidine-etiquetada de GTF-si usando SDS-PAGE13 e western blotting14 empregando um anticorpo monoclonal antipolihistidina peroxidase-conjugated do rábano. Adição de CHAPS (concentração final, 0,1%) ao eluente pode ser exigido para evitar a adsorção não específica à unidade, dependendo da proteína do alvo.

7. restauração funcional por GTF-SI recombinante

  1. Raia cada s. Mutans tensão em uma placa de agar BHI individualmente. Incubar as placas durante a noite a 37 ° c.
  2. Usando um palito esterilizado, pegue uma única colônia para inocular em 2 mL de caldo BHI. Incubar durante a noite a 37 ° c.
  3. Use 20 μL da cultura overnight de S. mutans ∆gtfc para inocular 2 ml de caldo BHI contendo 1% de sacarose sem antibióticos em um tubo de ensaio de vidro. Adicione o GTF-SI ou um volume equivalente do veículo à cultura S. mutans ∆gtfc , e cultura as células com o tubo colocado em uma posição inclinada durante a noite.
    Nota: Esterilize a solução de GTF-si com um filtro estéril da seringa e determine a concentração da proteína usando um ensaio ácido ácido da proteína15 antes de usar.
  4. Agitar as suspensões de cultura com um misturador de vórtice para 10 s. decantar as suspensões. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada.
  5. Manchar os biofilmes na parede do tubo com 1 mL de 0,25% de azul brilhante de Coomassie (CBB).
  6. Decantar a solução de coloração após 1 min. Lave os tubos de ensaio com uma quantidade suficiente de água destilada. Ar-seque os tubos de ensaio.

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Resultados

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spect...

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Discussão

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPCr-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPCr. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ' regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando ascendentes pode ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02Para eletroforese em gel de agarose
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Sistema de cultura anaeróbica
Anticorpo monoclonal Anti-His-TagMBLD291-7conjugado com HRP
Thermo Fisher Scientific23227Medição da concentração
de proteínaCaldo de infusão cérebro-coraçãoBecton, Dickinson237500Meio de cultura bacteriana
CBB R-250Wako031-17922Para coloração de biofilme
Unidade de ultrafiltração centrífugaSartoriusVS2032Substituição de tampão e concentração de proteínas
CentrífugaKubota7780II
Coluna cromatográficaBio-Rad7321010Para
a braçadeira de membrana de diáliseIMAC Fisher marca21-153-100
Tubulação de diáliseComo um2-316-06
DNA polimeraseTakaraR045ASequenciamento de DNA polimerase de alta fidelidade
Eurofins Genomics
ECL substratoBio-Rad170-5060Para western blotting
EDTA (0,5 M pH 8,0)Wako311-90075Preparação de tampão Tris-EDTA
Cubeta de eletroporaçãoBio-Rad16520860,2 cm de folga
ElectroporatorBio-Rad1652100
Solução EtBrNippon Gene315-90051Para eletroforese em gel de agarose
Cortador de banda de gelNippon GeneticsFG-830
Gel kit de extraçãoNippon GeneticsFG-91202Extração de DNA de gel de agarose
ImagerGE Healthcare29083461Para SDS-PAGE e western blotting
ImidazoleWako095-00015Tampão de ligação e preparação do tampão de eluição
IncubadoraNippon Medical & Instrumentos QuímicosEZ-022Configuração de temperatura: 4 &graus;
C IncubadoraNippon Medical & Instrumentos QuímicosLH-100-RDS Configuração detemperatura: 37 &graus; C
Filtro de membranaMerck MilliporeJGWP047000.2 µ
Microcentrífugam Kubota3740
NaClWako191-01665Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
NaH2PO4· 2H2OWako192-02815Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
NaOHWako198-13765Preparação de tampão de ligação e tampão de eluição
(NH4)2SO4Wako015-06737Precipitação de sulfato de amônio
Resina carregada com NiBio-Rad1560133Para IMAC
Primers de PCREurofins GenomicsProteína personalizada
padrãoBio-Rad161-0381Para SDS-PAGE e western blotting
Aparelho de filtração de solventeAs OneFH-1G
SpectinomicinaWako195-11531Antibióticos; use a 100 μ g/mL
Filtro de seringa estérilMerckmilliporeSLGV004SL0,22 µ m de diâmetro
Streptococus mutans Δ gtfCCepa de estoque no laboratório.gtfC substituído por spcr
Streptococus mutans Cepa de estoque UA159no laboratório.S. mutans ATCC 700610, estirpe selvagem
SacaroseWako196-00015Para desenvolvimento de biofilme
TAE (50 &vezes)Nippon Gene313-90035Para eletroforese em gel de agarose
TermocicladorBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)Wako314-90065Tris-EDTA preparação de tampão
Kit de ensaio de proteína BCA de diâmetro

Referências

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Reimpressões e permissões

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