Artigo de método

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

DOI:

10.3791/59821

⸱

26 de setembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O intestino é a casa para o maior número de células imunes no corpo. A exposição da polícia intestinal de pequenos e grandes sistemas imunológicos a antígenos exógenos e modulam respostas a potentes estímulos imunológicos derivados microbialmente. Por esta razão, o intestino é um local principal alvo de desregulação imune e inflamação em muitas doenças, incluindo mas, não limitado a doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn e colite ulcerosa, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) após o osso transplante de medula óssea (TMO) e muitas condições alérgicas e infecciosas. Os modelos murinos de inflamação e colite gastrintestinal são fortemente utilizados para estudar as complicações do GI e para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento pré-clinicamente. Os dados recolhidos destes modelos através da isolação e da análise fenotípica de pilhas imunes do intestino são críticos para uma compreensão imune mais adicional que possa ser aplicada para amenizar desordens inflamatórios gastrintestinais e sistemáticas. Este relatório descreve um protocolo altamente eficaz para a isolação de pilhas mononucleares (MNC) dos dois pontos usando uma relação sílica-baseada misturada do inclinação da densidade. Este método isola revisivelmente um número significativo de leucócito viáveis ao minimizar contaminando restos, permitindo o fenótipo imune subseqüente pela citometria do fluxo ou pelos outros métodos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso1. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças1,2,3.

O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo4. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ' remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino5. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4+ e CD8+ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos6.

Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante19 ,20. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.

Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa "intestino e célula imune e isolamento" revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno24, a 25.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos foram conduzidos protocolos de pesquisa de roedores revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina da Universidade de Miami Miller, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela associação americana para laboratório de Zootecnia (AALAS).

1. preparação de soluções

  1. Conforme descrito na tabela 1, prepare o buffer de cólon, mídia de separação de densidade baseada em sílica 100%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 66%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 44%, tampão de digestão de Collagenase E e tampão FACS.
    1. Prepare o tampão dos dois pontos o dia antes do procedimento e armazene durante a noite em 4 ° c.
    2. Prepare 100% de separação de sílica-based densidade Media no dia anterior ao procedimento e armazenado durante a noite a 4 ° c, colocando à temperatura ambiente a manhã do procedimento a descongelar.
    3. Prepare 66% e 44% meios de separação à base de sílica na parte da manhã do isolamento, usando a temperatura ambiente 100% sílica-based densidade meios de separação e buffer de cólon.
    4. Meça a quantidade apropriada de Collagenase e de Clostridium histolyticum-derivado e armazene em-20 ° c durante a noite antes do procedimento. Na manhã seguinte, dissolver no volume adequado de cólon buffer para derivar Collagenase digestão buffer. Para todas as incubações com tampão da digestão de Collagenase no dia do procedimento, aqueça previamente as soluções a 37 ° c.
  2. Para a totalidade das etapas do protocolo, mantenha uma centrífuga a 20 ° c e a velocidade de rotação de 859 x g, com freios inativados (0 desaceleração) para centrifugação de gradiente. Definir outro a 4 ° c e velocidade de rotação de 859 x g, com a desaceleração padrão, para as etapas de lavagem.

2. colhendo o cólon

  1. Eutanizar o rato via CO2 asfixia seguida pelo método confirmatório aprovado pela aalac.
  2. Coloque o mouse em uma posição supina e pulverize a pele com 70% de etanol. Usando grandes tesouras do tecido, faça uma incisão vertical do midline e exponha o peritoneum intacto.
  3. Usando tesouras finas da dissecção, abra o peritoneum. Use fórceps para mover o intestino delgado para um lado e expor o cólon descendente. Puxe ligeiramente para cima no cólon descendente para expor maximamente a porção retal do cólon. Corte o reto distal profundamente na pelve e dissecar e remover todo o cólon como uma unidade, do reto distal ao tampão cecal.
  4. Transfira os dois pontos em 20 mL de tampão de cólon refrigerado em um tubo de polipropileno 50 mL.

3. limpando o cólon

  1. Coloc os dois pontos em uma toalha de papel umedecida e extraia o tamborete contínuo aplicando a pressão suave à parede das entranhas com a extremidade sem corte das tesouras ou do fórceps.
  2. Coloque os dois pontos em uma placa de Petri e lave o intestino com 10 mL de tampão de cólon resfriado usando uma seringa de 10 mL com agulha de preenchimento sem corte de 18 G.
  3. Transfira os dois pontos para um buffer de cólon umedecido toalha de papel e retire o mesenteria e gordura com a extremidade afiada da tesoura.
  4. Coloc os dois pontos em um prato de Petri enchido com 5-10 mL refrigerou o amortecedor dos dois pontos que agitam manualmente para lavar o Sumário relativo ao cólon restante. Repita 2-3 vezes.
  5. Corte os dois pontos longitudinalmente de sua extremidade rectal mais muscular aos dois pontos proximal (gerando uma única parte aberta retangular dos dois pontos) em um prato de Petri enchido com o amortecedor refrigerado fresco dos dois pontos. Descarte a mídia existente e reabasteça com buffer Colon limpo e refrigerado.
  6. Lave o intestino 3 vezes, agitando-o vigorosamente na placa de Petri e substituindo o 5-10 mL de tampão de cólon refrigerado depois com cada lavagem.
  7. Coloque o tecido do cólon retangular em uma toalha de papel umedecida com Colon buffer e cortá-la cortando-a horizontalmente e, em seguida, em pequenos fragmentos (3 mm x 3 mm seções).
  8. Colete os fragmentos de cólon cuidadosamente usando fórceps fino em 20 mL resfriado Colon buffer em um tubo de polipropileno 50 mL cônico.
  9. Lave os fragmentos do cólon 3 vezes, cada lavagem em 20 mL de tampão de cólon, agitando vigorosamente o tubo para 30 s. entre cada agitação, permita que os fragmentos do tecido se instalem à parte inferior do tubo. O decant ou o vácuo aspiram o sobrenadante ao impedir a perda do fragmento do tecido no processo da aspiração entre cada lavagem.
    Nota: Não há necessidade de mudar o tubo após cada lavagem.

4. digestão da Collagenase 1

  1. Adicione 20 mL do tampão de digestão de Collagenase aos fragmentos de cólon lavado no tubo cônico de polipropileno 50 mL.
  2. Coloque o tubo fechado de 50 mL a 37 ° c em um agitador orbital incubado com a taxa de rotação ajustada em 2 x g por 60 min. Assegure-se de que os fragmentos de tecido estejam em movimento constante durante a agitação; se necessário, aumente a taxa de rotação incrementalmente para garantir que nenhum fragmento de tecido se estabeleça na parte inferior do tubo.

5. Prepare gradientes de mídia de separação à base de sílica

  1. Prepare 66% e 44% de mídia de separação de densidade baseada em sílica, usando 100% de mídia de separação de densidade baseada em sílica a 20 ° c (temperatura ambiente) e buffer de cólon.
  2. Despeje 5 mL de 66% de meios de separação de densidade à base de sílica em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mL. Prepare 3 tubos por dois pontos. Isso forma a base de densidade mais alta do procedimento de isolamento de gradiente, na qual a mídia de separação de menor densidade será mergulhada para criar o gradiente de separação.
  3. Conservar a 20 ° c até à utilização.

6. coleção de sobrenadante da digestão 1

  1. Colete apenas o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 25 mL e filtre o sobrenadante através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm colocado em um tubo cônico de polipropileno 50 mL limpo, após a conclusão da digestão de Collagenase 1. Tenha cuidado para não aspirar quaisquer fragmentos de tecido existentes.
    Nota: Guarde os fragmentos de tecido visíveis restantes no tubo. Estes serão submetidos a segunda digestão da colagenase (passo 8).

7. têmpera Collagenase digestão tampão

  1. Encha o tubo de polipropileno 50 mL completamente com o tampão de cólon refrigerado.
    Nota: A Collagenase está ativa a 37 ° c; assim, o tampão refrigerado inactiva esta enzima.
  2. Centrifugue o tubo a 4 ° c a 800 x g durante 5 min.
    1. Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo. Lave as células com 25 mL de tampão de cólon fresco e Centrifugue a 800 x g durante 5 min.
    2. Ressuscitem a pelota em menos de 1 mL de tampão de cólon fresco refrigerado.
    3. Coloque o tubo cônico de polipropileno 50 mL no gelo.

8. digestão 2 de Collagenase

  1. Repita a etapa 4 (digestão 1) com os fragmentos restantes do tecido retidos da etapa 6,1.

9. desagregação tecidual após digestão 2

  1. Lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mL através de uma agulha de extremidade sem corte de 18 G.
  2. Repita este flush para um mínimo de 7-8 passagens completas, continuando até que nenhum fragmento de tecido bruto ou detritos sejam visíveis.

10. filtrar células

  1. Passe a suspensão de desagregação tecidual através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm em um tubo de polipropileno 50 mL limpo.
  2. Lave o filtro de célula de tecido de filtração com 10 mL de tampão de cólon refrigerado para recuperar todas as células enreadas no filtros.

11. têmpera Collagenase digestão

  1. Encha o tubo cônico de polipropileno 50 mL para a jante com tampão de cólon refrigerado.
    Nota: A temperatura do tampão dos dois pontos é crítica para assegurar a têmpera da atividade do colagenase.
  2. Girar a 4 ° c e 800 x g por 5 min.
  3. Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.
  4. Lave com resuspensão em 25 mL de tampão cólon fresco refrigerado, seguido de centrifugação a 4 ° c, 800 x g por 5 min.
  5. Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.
  6. Agrupe a pelota ressuscipended da digestão 1 de Collagenase (etapa 7) a seu tubo correspondente da etapa 11,4.
  7. Repetir o passo 11,4 (lavagem e centrifugação).

12. separação sílica-baseada da separação dos media do inclinação da densidade

Nota: Execute as etapas 12-18 o mais rapidamente possível, para assegurar a têmpera rápida da atividade do colagenase.

  1. Após a etapa 11,7, ressuscite cada pellet em 24 mL de total de 44% de separação de sílica-based densidade Media por cólon.
  2. Mergulhe lentamente 8 mL da mídia da etapa 12,1 em cada um dos três tubos preparados na etapa 5,2 (contendo 66% de mídia de separação de densidade baseada em sílica), usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Mantenha um fluxo constante e lento dos meios de separação da densidade de 44% ao mergulhar o inclinação a fim evitar a interrupção da relação.
  3. Balance cuidadosamente todos os tubos dentro das caçambas de centrifugação usando uma balança ou balança.
  4. Gire os tubos 20 min a 859 x g em uma centrífuga sem freio a 20 ° c. Permita que os rotores venham terminar o descanso antes de remover os tubos, tomando o cuidado para não interromper as pilhas na relação do inclinação.

13. colete células mononucleares da interface de gradiente

  1. Visualize a interface de gradiente (perto da marca de 5 mL), onde normalmente uma faixa branca grossa de 1-2 mm (contendo MNC) está presente.
    Nota: Um pode ou não pode ver uma faixa branca. Entretanto, o MNC estará nesta relação e deve nuvem a claridade da relação do inclinação.
  2. Aspirar a vácuo e descartar o Top 7 mL do gradiente superior para permitir o acesso mais fácil pipeta para a interface.
  3. Usando a sucção manual contínua e o movimento de giro constante do pulso, colete a camada de relação das pilhas em um tubo cónico do polypropylene 50 mL limpo. Colete até que a interface entre os 2 gradientes é clara e corpos (clara de células).
  4. Encha o tubo de recolha com 50 mL de tampão FACS refrigerado. Girar a 4 ° c, 800 x g por 5 min.
  5. Aspirar o sobrenadante através de aspiração a vácuo e suspender o pellet em 1 mL de FACS buffer.
  6. Conte as células em um hemocitômetro em uma diluição 1:2 usando métodos apropriados de exclusão de células mortas.
  7. Proceder à coloração de FACS ou outros ensaios com MNC Colônico recém-isolado.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao trabalhar com modelos de doença de cólon murino, é útil ser capaz de quantificar e avaliar qualitativamente, entre os MNC do cólon, múltiplos subconjuntos de células imunes envolvidas no processo inflamatório. A suspensão de uma única célula de MNC obtida através da aplicação deste protocolo facilita a caracterização fenotípica de forma robusta e reprodutível. Como prova de princípio para a aplicação deste método de isolamento diversas configurações experimentais, foi obtida a MNC Colô...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo Visual descreve métodos bem tolerados para a isolação de pilhas mononucleares Colônica que incluem linfócitos do própria do lamina (LPL). Dado que este protocolo foi otimizado na avaliação de modelos graves de colite pós-transplante de camundongo, onde citocinas inflamatórias e lesão tecidual se prestam à má viabilidade da MNC recuperada, prevemos que esses métodos podem ser traduzidos para outros aplicações que exigem a análise fenotípica do MNC relativo ao cólon. Estes incluem, mas, não estão limitados a...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) e pela Fundação Batchelor para pesquisa Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Os camundongos C57BL/6 e BALB/c utilizados neste estudo foram criados em nossas instalações ou fornecidos por Jackson Labs ou Taconic.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
60 mm Petri DIshThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 mL Pipeta Sorológica DescartávelCorning4100
Seringa de 10 mLBecton Dickinson302995
15 mL TubosCônicos Não EstéreisTruLineTR2002
18 G Agulha RombaBecton Dickinson305180
25 mL Pipeta Sorológica DescartávelCorning4250
40 μ m tamanho de poro Filtro de célulasCorning352340
50 mL Falcon TubeCorning21008-951
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA4503-1KG
Tampão de fixaçãoBiolegend420801
E. coli Colagenase E de Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0,5 M Estéril SoluçãoAmrescoE177-500ML
Soro Bovino FetalThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Azida de SódioVWR Ciências da Vida Amresco97064-646
Trypan BlueLonza BioWhittaker17-942E

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Isolamento de C lon MurinoDigest o com Colagenase ESepara o por Gradiente de DensidadeAn lise por Citometria de FluxoFiltra o com Filtro de C lulasIncuba o em Agitador OrbitalLavagem com Tamp o FACSFenotipagem de C lulas ImunesTransplante de Medula ssea

Artigos relacionados