Artigo de método

Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

DOI:

10.3791/59843

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18 de julho de 2019

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1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, nós descrevemos um protocolo detalhado para induzir o esteatose vesicular do fígado em pilhas diferenciadas de HepaRG com o oleato do sódio do sal do ácido gordo e empregamos métodos para a deteção e a quantificação da acumulação do lipido, incluindo anti-Stokes coerente Microscopia do espalhamento de Raman (carros), análise cytofluorimetric, mancha vermelha O do óleo, e qPCR.

Resumo

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A esteatose hepática representa uma disfunção metabólica que resulta de um acúmulo de gotas lipídicas contendo triglicerídeos em hepatócitos. O acúmulo excessivo de gordura leva à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que é potencialmente reversível e pode evoluir para esteatohepatite não alcoólica (NASH) e, eventualmente, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC). Os mecanismos moleculares que ligam a acumulação lipídica em hepatócitos com a progressão para NASH, dano hepático irreversível, fibrose, cirrose e até mesmo HCC ainda permanecem obscuros. Para isso, vários modelos in vitro e in vivo foram desenvolvidos para elucidar os processos patológicos que causam a DHGNA. No presente estudo, descrevemos um modelo celular para a indução de esteatose vesicular hepática que consiste em células de HepaRG hepáticas humanas diferenciadas por DMSO tratadas com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos. De fato, as células HepaRG tratadas com oleato de sódio acumulam gotas lipídicas no citoplasma e apresentam características típicas de esteatose. Este modelo in vitro humano representa uma alternativa valiosa aos modelos in vivo dos ratos assim como aos hepatocytes humanos preliminares. Também apresentamos uma comparação de vários métodos para a quantificação e avaliação do acúmulo de gordura em células de HepaRG, incluindo coloração de óleo vermelho O, medida de Bodipy citofluimétrica, análise metabólica da expressão gênica por qPCR e anti-Stokes coerente Microscopia de espalhamento Raman (CARS). A imagem latente dos carros combina a especificidade química da espectroscopia de Raman, uma técnica da análise química conhecida em aplicações da ciência dos materiais, com os benefícios das microscopias óticas de alta velocidade, de alta resolução não-lineares para permitir a precisão quantificação da acumulação lipídica e da dinâmica das gotas lipídicas. O estabelecimento de um modelo in vitro eficiente para a indução da esteatose vesicular, ao lado de um método exato para a quantificação e caracterização do acúmulo lipídico, poderia levar ao desenvolvimento do diagnóstico de fase precoce da DHGNA através da identificação de marcadores moleculares, e à geração de novas estratégias de tratamento.

Introdução

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A esteatose hepática é definida como acúmulo de gordura intrahepática, dentro de gotas lipídicas contendo triglicerídeos, de pelo menos 5% do peso do fígado. O armazenamento hepático prolongado de lipídios é um processo potencialmente reversível, no entanto, pode levar a disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), a causa predominante de doença hepática crônica em muitas partes do o mundo1,2. A NAFLD é uma doença multifatorial que pode evoluir para a esteatohepatite não alcoólica mais agressiva (Nash), que por sua vez pode progredir para cirrose e, em pequena porcentagem de pacientes, para carcinoma hepatocelular (HCC)1,3. Nenhuma terapia aprovada está atualmente disponível como um tratamento específico para a NAFLD e a combinação de modificações de dieta e estilo de vida continua sendo o pilar da NAFLD e da gerência de Nash4,5,6.

Os mecanismos moleculars que conduzem ao desenvolvimento da esteatose hepatic na patogénese de NAFLD permanecem ainda para ser elucidados7. Neste contexto, modelos de camundongo foram desenvolvidos para estudar a progressão da doença da esteatose humana. Existe uma infinidade de modelos diferentes, e cada um tem suas vantagens e desvantagens, incluindo modelos genéticos, nutricionais e quimicamente induzidos combinando diferentes abordagens. Os ratos geneticamente modificados (transgênicos ou Knockout) desenvolvem espontaneamente a doença hepática. Entretanto, deve-se notar que estas mutações são muito raras nos seres humanos e o apagamento ou a excesso-expressão de um único gene (por exemplo, rato de OB/OB) não podem imitar a etiologia da doença humana multifatorial a nível molecular8,9. Da mesma forma, a doença adquirida por camundongos após manipulação dietética ou farmacológica pode não imitar os efeitos das dietas humanas associadas ao desenvolvimento da DHGNA no homem8. Os modelos animais têm, no entanto, facilitado a evolução na compreensão da DHGNA e essa abordagem é atualmente a estratégia mais freqüentemente utilizada na pesquisa laboratorial. No entanto, a replicação em humanos dos resultados obtidos em modelos animais tem falhado repetidamente, causando má tradução para a clínica10.

Portanto, os modelos in vitro da DHGNA podem desempenhar um papel fundamental na elucidação dos mecanismos moleculares da progressão da NAFLD, e representam uma ferramenta valiosa para a tela de um grande número de compostos. Culturas de células primárias, linhas celulares imortalizadas e biópsias hepáticas têm sido amplamente utilizadas para fins de pesquisa11. Os hepatócitos humanos preliminares assemelham-se pròxima às circunstâncias clínicas humanas, mas há um número limitado de doadores, e as culturas de pilha preliminares mostram a reprodutibilidade pobre devido à variabilidade das pilhas. Essas observações, juntamente com questões éticas e logísticas, resultaram no uso de hepatócitos primários humanos sendo limitados12. Assim, as linhas de célula hepatic representam uma alternativa conveniente, tendo diversas vantagens essenciais sobre a cultura preliminar, porque as linhas de pilha hepatic crescem firmemente, têm uma vida-extensão quase ilimitada, e têm um phenotype estável. Além disso, as linhas celulares são facilmente acessíveis e as condições de cultura das linhagens celulares hepáticas são mais simples do que as dos hepatócitos primários e são padronizadas entre os diferentes laboratórios.

Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo Cell-Based in vitro da esteatose vesicular do fígado, representada por pilhas diferenciadas hepatic do HepaRG tratadas com o oleate do sódio do ácido gordo. A linha celular de HepaRG foi estabelecida de um paciente fêmea afetado pela infecção da hepatite C e por um tumor bem diferenciado do fígado da classe de Edmondson mim14. A linha celular HepaRG é uma linhagem de células progenitoras bipotentes humanas capaz de diferenciar a exposição a 2% de sulfóxido de dimetil (DMSO) em direção a dois fenótipos de células diferentes: células semelhantes às das vias biliares e hepatócitos. As células de HepaRG diferenciadas (dHepaRG) compartilham algumas características e propriedades com hepatócitos adultos e possuem a capacidade de expressar de forma estável genes específicos do fígado, como albumina, AldolaseB, citocromo P450 2E1 (CYP2E1) e citocromo P450 3A4 (CYP3A4)13 (passo 3). O tratamento de células de dheparg com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos (250 μm) por 5 dias levam à geração de gotas lipídicas citoplasmáticas, imitando os efeitos do fígado gordo14,15,17,18 ( Passo 4). A acumulação de gotas lipídicas pode ser facilmente detectada pela coloração de óleo vermelho O (passo 5), um corante lisocromo solúvel em gordura que mancha triglicérides neutros e lipídios vermelho-laranja. Para quantificar eficientemente os lipídios no dheparg gordo, aqui nós ilustramos a análise cytofluorimetric após a mancha com 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3A, 4a-diaza-s-indacene (bodipy 505/515) (etapa 6), uma sonda fluorescente lipofílico a corpos lipídicos intracelulares e tem sido usado para rotular gotas lipídicas19. Além disso, aqui nós mostramos como avaliar a esteatose pela reacção em cadeia quantitativa do polymerase (qPCR) (etapa 7) desregulação da expressão de gene de diversos genes metabólicos em pilhas de dHepaRG. Para caracterizar e quantificar ainda mais o acúmulo de gotas lipídicas após o tratamento com oleato de sódio, realizou-se a microscopia de espalhamento Raman (CARS) coerente de anti-Stokes (etapa 8), uma técnica inovadora que possibilita a visualização e quantificação de gotas lipídicas sem rotulagem20,21.

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Protocolo

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1. preparação de meios de cultura e reagentes

  1. Meio proliferating: suplemento de William E médio com GlutaMAX, 10% soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina e 0,5 μM hidrocortisona hemisuccinato.
  2. Meio de diferenciação: suplemento de William E meio com GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 50 μM de hidrocortisona hemisuccinato e 2% DMSO.
  3. Meio de congelação: suplemento proliferating médio com 10% DMSO.
  4. Oleato de sódio: dissolver em 99% metanol em uma concentração de 100 mM, agitar O/N, e armazenar a-20 ° c.
  5. Óleo vermelho O: Prepare uma solução de ações. Pesar 0,35 g de óleo vermelho O e dissolver em 100 mL de isopropanol. Mexa O/N, filtre (0,2 μm) e armazene em RT. Prepare uma solução de trabalho: misture 6 mL de solução Oil Red O stock com 4 mL de ddH2o. Deixe descansar à temperatura ambiente (RT) durante 20 min e, em seguida, filtre com um filtro de 0,2 μm. A filtração apropriada é altamente-recomendado para a mancha bem sucedida para evitar o fundo.
  6. Bodipy (505/515): dissolva a tintura de Bodipy (505/515) no DMSO em uma concentração de estoque de 100 μM, armazene a-20 ° c na obscuridade, e use-a em uma concentração final de 100 nanômetro.
  7. Adquira pratos transparentes de fundo de vidro para experimentos de carros.

2. descongelamento, amplificação e criopreservação de células HepaRG

  1. Células de HepaRG criopreservadas do nitrogênio do descongelamento imersando um grupo em um banho de 37 ° c até descongelado. Selecione um lote de passagem baixa (< 20). As células HepaRG estão disponíveis comercialmente.
  2. Transfira ràpida as pilhas em um tubo de 15 mL que contem 10 mL do meio proliferating e centrifugue por 5 minutos (200 x g, 4 ° c).
  3. Descarte o sobrenadante e resuma as células com 5 mL de meio proliferante.
  4. Contar as células e diluir a fim de chapa 2,5 x 104 células/cm2.
  5. Renovar o meio a cada 2 ou 3 dias. As células proliferam com um tempo de duplicação de cerca de 24 h.
  6. Desanexar células HepaRG quando em 80% confluência por 3-5 min incubação com solução de tripsina 0, 5%. Recolher as células em meio proliferating e centrifugar por 5 min (200 x g, 4 ° c).
  7. Descarte o sobrenadante e resuma as células com 5 mL de meio proliferante.
  8. Contar as células e diluir a fim de chapa 2,5 x 104 células/cm2.
  9. Nesta fase, amplificar as células, repetindo as etapas 2.5-2.8, a fim de alcançar um número adequado de células para iniciar experimentos, ou criopreservar como na etapa 2,10.
  10. Para criopreservar células HepaRG, separe as células 24 h após a plaqueamento por 3-5 min de incubação com solução de tripsina 0, 5%. Recolher as células em meio proliferating e centrifugar por 5 min (200 x g, 4 ° c). Descarte o sobrenadante, Ressuspender as células em 1 mL/lote de meio de congelação, 1,5 x 106 células/lote e crirepreservar os lotes em nitrogênio líquido.

3. diferenciação das células HepaRG (dia 0 – 21) (Figura 1A)

  1. Dia 0. Células HepaRG de sementes em baixa densidade (2,5 x 104 células/cm2) em pratos tratados com cultura com volume adequado de meio de proliferação (Figura 1B). Dois pratos precisam de ser chapeados para cada ensaio (mancha do óleo vermelho O, análise de FACS, qPCR): um para pilhas do controle e um para pilhas oleate-tratadas. Se a realização de medições CARS (passo 8), sementes as células em paralelo em transparente de fundo de vidro pratos. Como um controle, colher um prato não tratado (proliferating células dia 0) para realizar a análise da expressão gênica de genes marcador de diferenciação (ver passo 3,6).
  2. Dia 2 e dia 4. Mude o meio com o volume apropriado de meio de proliferação e deixe as células crescerem até a confluência.
  3. Dia 7. As células devem ser 100% confluentes (Figura 1C). Lave as células uma vez com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Remover 1X PBS e adicionar um volume adequado de meio de diferenciação.
  4. Dia 8, 9, 12, 15, 18.  Lave as células uma vez com 1X PBS. Remover 1X PBS e adicionar um volume adequado de meio de diferenciação.
  5. Dia 21. Observar as células HepaRG um microscópio e garantir que as células sejam culturas diferenciadas confluentes (Figura 1D).
  6. Como controle, colher um prato de controle (células diferenciadas dia 21) para realizar a análise da expressão gênica (etapa 7) dos genes do marcador de diferenciação (Figura 1E).
  7. No dia 21, as células HepaRG diferenciadas podem ser criopreservadas em nitrogênio líquido.

4. indução da esteatose vesicular (dia 21 – 26)

  1. Dia 21. Diluir o oleato sódico (100 mM) com um volume adequado de meio de diferenciação completo a uma concentração final de 250 μM (1:400). Adicionar 99% metanol 1:400 (mesmo volume que o de oleato de sódio) em outra alíquota de meio de diferenciação para fazer o tratamento do veículo-controle. (Por exemplo: Adicionar 25 μL de oleato de sódio a 10 mL de meio e, em paralelo, adicionar 25 μL de 99% de metanol a 10 mL de meio). Lave as células uma vez com 1X PBS e adicione o meio de oleato de sódio ou veículo.
  2. Dia 23 e dia 25. Mude o meio com o volume apropriado de meio preparado na hora como na etapa 4,1.
  3. Dia 26. Observar pelo microscópio óptico que as gotas lipídicas se acumulam nas células tratadas com oleato de sódio e são facilmente visíveis como gotas translúcidas no citoplasma como na Figura 2A.

5. avaliação Desobrecarregamento de lipídios e indução de esteatose: óleo vermelho O coloração

  1. Lave-as pilhas uma vez com 1X PBS e remova 1X PBS completamente.
  2. Adicionar 4% paraformaldeído (diluído em 1X PBS) e incubar por 15 min em RT.
    Atenção: Paraformaldeído é tóxico, por isso esta etapa deve ser realizada em uma capa de fumaça, com equipamentos de proteção, incluindo luvas, um jaleco e uma máscara.
  3. Retire o paraformaldeído e lave as células duas vezes com 1X PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a 4 ° c por um par de dias antes da coloração. Enrole com parafilm e cubra com folha de alumínio para impedir que as células de secagem.
  4. Remover 1X PBS. Incubar as células com isopropanol a 60% durante 5 min em RT.
  5. Remova o isopropanol e deixe as células secar completamente na RT.
  6. Adicionar óleo vermelho O solução de trabalho e incubar em RT por 30 min. O volume de solução de trabalho necessário para cada amostra corresponde ao volume de mídia utilizado para a cultura das células.
  7. Remova a solução Oil Red O e adicione imediatamente ddH2o. Lave as células 4 vezes com DDH2o.
  8. Adquira imagens o microscópio para análise (Figura 2B).
  9. Para eluir óleo vermelho O corante: Retire toda a água e deixe secar; Adicionar 1 mL de isopropanol a 100% e incubar durante 10 min com agitação suave na RT.
  10. Pipet o isopropanol com óleo eluída vermelho o tintura para cima e para baixo várias vezes, garantindo que todo o óleo vermelho o está na solução. Transfira a solução para uma cubeta. Medir OD500 nm por espectrofotometria e utilizar 100% de isopropanol em branco (Figura 2C).

6. avaliação da sobrecarga lipídica e indução de esteatose: coloração Bodipy e análise Citofluimétrica

  1. Lave as células uma vez com 1X PBS. Incubar com 100 nM de Bodipy diluído em 1X PBS no escuro por 40 min a 37 ° c. Um controle não manchado deve ser incluído nas medições de citometria de fluxo. A partir deste ponto, proteja as amostras da luz, tanto quanto possível.
    Nota: O volume de solução de coloração necessário para cada amostra corresponde ao volume de mídia utilizado para a cultura de células.
  2. Remova a solução de coloração e lave as células uma vez com 1X PBS. Prossiga para os passos 6.3-6.6. para a análise de FACS (classificação de célula ativada por fluorescência) ou para a etapa 6,7 para a imagem latente do microscópio.
  3. Raspe delicadamente as pilhas com 1X PBS e transfira-a em um tubo de 15 mL. Centrifugador por 10 min (200 x g, 4 ° c).
  4. Retire suavemente os sobrenadantes sem perturbar os pellets e lave com 3 mL de 1X PBS. Centrifugador por 5 min (200 x g, 4 ° c).
  5. Retire os sobrenadantes e ressuscitem em 300 μL de 1X PBS, em seguida, transfira para um tubo FACS.
  6. Meça imediatamente a intensidade da fluorescência de Bodipy pela análise cytofluorimetric com comprimentos de onda da excitação/emissão de 505/515 nanômetro (Figura 3A, B).
  7. Lave as células uma vez com 1X PBS e remover PBS completamente.
  8. Adicionar 4% paraformaldeído (diluído em 1X PBS) e incubar por 15 min em RT.
    Atenção: Paraformaldeído é tóxico, por isso esta etapa deve ser realizada em uma capa de fumaça, com equipamentos de proteção, incluindo luvas, um jaleco e uma máscara.
  9. Retire o paraformaldeído e lave as amostras 3x durante 5 min em PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a 4 ° c ou fotografadas imediatamente (Figura 3c). Para armazenamento, enrole com parafilm e cubra com folha de alumínio para evitar que as células de secagem.

7. avaliação da sobrecarga lipídica e indução de esteatose: qPCR

  1. Lave as células uma vez com 1X PBS. Raspar as células com 1X PBS, centrifugar a 200 x g, e descartar o sobrenadante. Nesta etapa, as células podem ser colhidas em-80 ° c ou processadas como na etapa 7,2.
  2. Realize o isolamento total de RNA por métodos padrão usando reagentes comerciais seguindo as instruções do fabricante.
  3. Avalie a concentração do RNA pela medida espectrofotométrica UV, assegurando-se de que a pureza do RNA seja elevada (perto de 2,0) baseada na leitura A260/A280.
  4. Sintetizar cDNA a partir de 1 μg de RNA total com um kit de síntese de cDNA padrão.
  5. Diluir o cDNA para um volume final de 50 μL com H2O.
  6. Analisar cada amostra de cDNA em triplicado por qPCR: Prepare uma mistura Master qPCR (tabela 1) que é suficiente para as reações necessárias para cada primer, incluindo primers específicos para os três genes de limpeza como controles: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), actinB e ribossomal 18S (ver tabela de materiais para sequências de primer):
  7. Dispense 18 μL de mistura mestra por poço em uma placa multiparede de PCR.
  8. Adicione 2 μL de amostra de cDNA em cada poço. Sele a placa.
  9. Execute as amostras de acordo com a instrução Thermal cycler.

8. avaliação da sobrecarga lipídica e indução de esteatose: CARS

  1. Fixar as células previamente preparadas em pratos de fundo de vidro, conforme descrito nas etapas 5.1-5.3.
  2. Ligue um sistema de laser pulsado de picosegundo comercial sintonizável, ajustando-o para obter duas saídas de comprimentos de onda diferentes. A diferença de frequência entre as saídas deve ser de 2.840 cm-1 para gerar o sinal luminoso de carros intenso correspondente ao alongamento simétrico de metileno; para uma saída de comprimento de onda fixo a 1.064 nm (luz "Stokes"), o outro comprimento de onda deve ser ajustado para 817 nm ("Pump" Light).
  3. Assegure-se de que a saída de 817 nm seja espacialmente e temporalmente sobreposta com a saída de 1.064 nm: Use um espelho dicróico apropriado (ou seja, com um corte entre 817 e 1.064 nm) para combinar espacialmente as vigas e usar uma linha de retardo óptico para obter sobreposição temporal do laser Pulsos.
  4. Assegure-se de que os dois feixes copropagadores sejam collimados e que seus diâmetros tenham valores semelhantes que sejam apropriados para o sistema óptico dentro do microscópio que os focalizará na amostra; se necessário, Colime separadamente os feixes antes do espelho dichroic que os combina.
  5. Ligue um sistema comercial de microscópio invertido, que deve incluir uma unidade de digitalização a laser infravermelho e uma unidade de detecção de EPI de canal duplo vermelho/verde e alinhar os feixes de laser de copropagação na unidade de digitalização.
  6. Abrindo a unidade da deteção do EPI do duplo-canal, remova o cubo do filtro e substitua seu filtro da deteção do vermelho-comprimento de onda com um filtro do bandpass que possa selecionar o sinal de 2.840 cm-1 carros que é centrado em 663 nanômetro para a excitação da bomba/Stokes de 817/1064 nanômetro Esquema. Um filtro de largura de banda estreita (20 nm) é preferível para evitar a coleta de altos níveis de sinais de fundo fluorescentes.
  7. Coloc um prato no estágio do microscópio invertido dos carros, e usando um objetivo do óleo-imersão 100x, desloc a posição vertical do objetivo para centrar-se sobre as pilhas.
  8. Configure o software do microscópio para coletar imagens de alta resolução (1024 x 1024 pixels) em um campo de visão que abrange 127 μm x 127 μm.
  9. Defina o software do microscópio para adquirir e exibir continuamente imagens do campo de visão de 127 μm x 127 μm e verificar as imagens exibidas enquanto otimiza os parâmetros de coleta de imagem. Assegure-se de que os poderes do laser estejam equilibrados para a coleção rápida da imagem e o dano mínimo, introduzindo filtros apropriados da neutro-densidade nos trajetos do feixe como necessário, e selecione um tempo de permanência do pixel que permita a coleção das imagens com um bom sinal-à-ruído as condições de energia laser selecionadas.
  10. Adquirir e salvar imagens de vários campos de visão diferentes dentro do prato as condições otimizadas. Opcionalmente, as imagens da fluorescência do multifotônica, geradas por uma emissão do verde-comprimento de onda (na maior parte da excitação do dois-fotão em 817 nanômetro), podem simultaneamente ser coletadas através do outro detector do EPI. Repita os passos 8.7-8.10 para cada prato.
  11. Para a análise de imagem CARS, processe imagens usando a implementação de FIJI do ImageJ. Opere a função de despeckle (ou uma ferramenta de denoising similar) em cada imagem antes da análise mais adicional para melhorar relações sinal-à-ruído sem perda de detalhe.
  12. Use FIJI para selecionar células manualmente e, em seguida, contar automaticamente as gotas lipídicas dentro de células individuais segmentadas para produzir estatísticas sobre as áreas de gotas lipídicas e números para cada célula e para todo o conjunto de dados de imagem para cada prato.

9. ensaio de viabilidade celular MTT

  1. Placas diferenciadas de células HepaRG em uma placa 96-well com uma densidade de 1 x 105 células/bem em um volume final de 100 μl de meio de cultura de diferenciação.
  2. 24 h após a semeadura, tratar as células com 99% de metanol (veículo) e com 100 μM, 250 μM e 500 μM de oleato de sódio e palmitato de sódio diluído em 100 μL de meio de cultura de diferenciação/bem em triplicado.
  3. Alterar o meio com 99% de metanol e com 100 μM, 250 μM e 500 μM de oleato de sódio e palmitato de sódio diluído em 100 μL de meio de cultura de diferenciação/bem a cada 24 h.
  4. 96 h após o tratamento com metanol/oleato de sódio/palmitato de sódio, tratar as células com doxorrubicina 2 μM diluída em 100 μL de meio de cultura de diferenciação/bem em triplicado como controle.
  5. 18 h após o tratamento com doxorubucina, mude o meio com 100 μL de meio de cultura de diferenciação.
  6. Pipet 20 μL de 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-reagente MTT do Tetrazolium (tabela dos materiais) em cada poço da placa do ensaio 96-well que contem as pilhas em 100 μl do meio de cultura da diferenciação . Inclua um controle do fundo introduzindo com pipting 20 μL do reagente em um poço de controle sem pilhas em 100 μL do meio de cultura da diferenciação no Triplicate.
  7. Incubar a placa em 37 ° c em uma atmosfera humidificada, de 5% CO2 .
  8. Após incubação de 30, 60 e 90 min com reagente de MTT tetrazólio, registre a absorvência em 490 nm usando um leitor de placas de 96 poços. Subtrair a absorvência de fundo dos poços de controle sem célula dos valores de absorvância para as outras amostras.

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Resultados

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Este protocolo descreve um método eficiente para induzir e caracterizar o esteatose vesicular em pilhas DMSO-diferenciadas de heparg pelo tratamento do oleato do sódio (Figura 1a).

Diferenciação de células HepaRG.
Para induzir de forma eficiente a diferenciação, as células proliferantes devem ser semeadas em baixa densidade (2,5 x 104 células/cm2) no meio de proliferação. Quando semeadas em baixa densidade...

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Discussão

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Este protocolo descreve como diferenciar as células HepaRG e como induzir a esteatose vesicular pelo tratamento oleato de sódio (Figura 1A). Com efeito, em comparação com outras linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano (HCC), a linha celular heparg apresenta características de hepatócitos humanos adultos, representando uma valiosa alternativa aos hepatócitos humanos primários cultivados ex vivo13,14

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Prof. Christian trepo (INSERM U871, Lyon, França), que gentilmente forneceu células HepaRG. Agradecemos a Rita Appodia pela ajuda administrativa. Este trabalho foi apoiado por MIUR-Ministero dell' istruzione, dell' Università e della ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) e Universidade Sapienza de Roma (Prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hyclone HyClone Clone Fetal II GE HealthcareSH30066
William' s E com GlutaMAX Thermofisher32551087
Penicilina/estreptomicina SIGMAP4333
Insulina SIGMAI9278
Hemisuccinato de hidrocortisonaSIGMAH2270
DMSO, dimetilsulfóxidoSIGMAD2438     
Oleato de SódioSIGMAO7501 
MetanolSIGMA179337
IsopropanolSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Solução de formaldeídoSIGMA252549
DNAseI livre de RNAsePromegaM198A 
Pratos com fundo de vidroWillco WellsGWST-5040
Solução Vermelho ÓleoSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR nome oligoSequência
ACACB FORCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-actina FORGCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actina REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMINA PARATGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMINA REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCATC
ALDOB PARAGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOBREV TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 PARACTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A PARATCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 PARATTGAAGCCTCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 PARACTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH PARATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM PARATCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 PARACCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 PARAACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 PARATTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 PARAAATGAGTTGGAGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD PARATCTAGCTCCTATACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 PARATGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S PARACGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Referências

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