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Artigo de método

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

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DOI:

10.3791/59845

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5 de novembro de 2019

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1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Resumo

Organotypic, ou culturas da fatia, foram empregados extensamente para modelar aspectos do sistema nervoso central que funciona in vitro. Apesar do potencial das culturas de fatias na neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente os de seres humanos. O uso do tecido humano adulto para preparar culturas da fatia é particular atrativo realçar a compreensão de neuropatologias humanas, porque prendem as propriedades originais típicas do cérebro humano maduro que falta nas fatias produzidas do roedor (geralmente neonatal) tecido nervoso. Este protocolo descreve como usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias de curto prazo e flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas também são apresentados. Os resultados representativos demonstram que a laminação cortical humana típica está preservada nas fatias após 4 dias in vitro (DIV4), com presença prevista dos tipos principais da pilha neural. Além disso, as fatias no DIV4 passam por uma morte celular robusta quando desafiadas com um estímulo tóxico (H2O2),indicando o potencial deste modelo para servir como uma plataforma em ensaios de morte celular. Este método, uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo amplamente utilizado usando inserções de membrana, é recomendado principalmente para a execução de ensaios de curto prazo destinados a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade. Finalmente, embora o protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente, argumenta-se que o tecido coletado de outras regiões/condições cerebrais também deve ser consideradas como fontes para produzir culturas similares da fatia livre-flutuando.

Introdução

O uso de amostras humanas na pesquisa é inequivocamente uma ótima opção para estudar patologias cerebrais humanas, e técnicas modernas abriram novas maneiras de experimentação robusta e ética usando tecido derivado do paciente. Métodos como culturas organotípicas/fatias preparadas a partir do cérebro humano adulto têm sido cada vez mais utilizados em paradigmas como optogenética1,eletrofisiologia2,3,4,5, plasticidade 6,7,8,9, neurotoxicidade/neuroproteção10,11,12,13,terapia celular14, triagem de drogas15,16,17, genética e edição de genes12,18,19,20,entre outros, como estratégia para melhor compreender doenças neurológicas durante a idade adulta.

A compreensão dos mecanismos subjacentes às patologias cerebrais humanas depende de estratégias experimentais que exigem um grande número de sujeitos. Por outro lado, no caso de culturas de fatias, embora o acesso a amostras humanas ainda seja difícil, a possibilidade de gerar até 50 fatias de uma única amostra corticana contorna parcialmente a exigência de recrutamento de múltiplos voluntários, aumentando número de réplicas e ensaios realizados por tecido coletado21.

Vários protocolos para culturas organotípicas/fatias cerebrais foram descritos, que vão desde os rascunhos clássicos de oculo22,23 até tubo de rolo24,25,26,membranas semipermeáveis interface27,28,29,30,e fatias flutuantes31,32. Dependendo das particularidades de um projeto experimental, cada técnica tem suas próprias vantagens e desvantagens. A curto prazo, as culturas de fatias de flutuação livre de cérebros humanos adultos é, em alguns casos, vantajosa sobre o método usado por Stoppini et al.27, se considerar o fato de que, embora a sobrevivência celular a longo prazo in vitro é geralmente uma grande preocupação ao avaliar um método de cultura, em muitos experimentos apenas curtos períodos de tempo na cultura são necessários12,31,32,33,34,35. Nestas circunstâncias, o uso de culturas free-floating apresenta a vantagem de ser mais simples e mais eficaz na redução de custos, assim como assemelhando-se mais exatamente à condição humana original do tecido do que as fatias mantidas na cultura sobre 2-3 semanas.

Apesar do potencial das culturas de fatia para a neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente de seres humanos. Este artigo descreve um protocolo para usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas são detalhados. Este protocolo foi provado valioso para analisar a viabilidade e a função neuronal nas investigações nos mecanismos das neuropatologias lig à idade adulta.

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Protocolo

Tecidos cerebrais adultos vivos foram obtidos de pacientes submetidos a neurocirurgia resectiva para o tratamento da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente (Figura 1A). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto (17578/2015), e os pacientes (ou sua pessoa responsável legal) concordaram e assinaram os termos de consentimento informado. A coleta do tecido foi feita pela equipe de neurocirurgia do Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP - Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil).

1. Esterilização de materiais

NOTA: Todo o material e soluções devem ser esterilizados antes do uso.

  1. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas e material de corte vibratome (suporte de faca, disco de espécime, bandeja tampão) em um forno esterilizante seco por 4 h a 180 °C.
  2. Esterilizar material ou equipamento sensível à temperatura por irradiação UV ou gama.
  3. Esterilizar mídia e soluções por autoclavation ou filtração através de membranas poros de 0,22 μm.

2. Preparação de soluções

  1. Prepare 15-20 mL de solução de transporte: 50% v/v Hanks' solução de sal equilibrado (HBSS) pH 7,4, 50% v/v médio basal para manutenção de pós-natal e neurônios cerebrais adultos (Tabela de Materiais), complementado com 10 mm 4-(2-hidroxyethyl)-1- ácido piperazineethanesulfonic (Hepes), 3 mg/mL glicose, e 33 μg/mL gentamicin.
    NOTA: A solução de transporte deve ser refrigerada e oxigenada (borbulhando com gás carbogênio) por pelo menos 20 minutos antes da coleta de amostras.
  2. Prepare 300 mL de solução de corte (HBSS complementado com 10 mM HEPES e 3 mg/mL de glicose) e refresque-o em um freezer ao ponto de formação inicial de cristal.
  3. Prepare 20 mL de meio de cultura: meio basal para manutenção de neurônios cerebrais pós-natais e adultos (Tabela de Materiais)complementados com 1% derivado da glutamina L (Tabela de Materiais),2% de suplemento para cultura neural (Tabela de Materiais), 1% penicilina/estreptomicina e 0,25 μg/mL amphotericin B.

3. Criação do aparelho de corte

NOTA: Este protocolo é idealmente realizado com o auxílio de um colega devido à logística de coleta de amostras na sala cirúrgica.

  1. Em um balde de gelo adicionado a sal, deixe a solução de corte descansar a mistura carbogen borbulhando (95% O2, 5% CO2) por pelo menos 20 minutos antes do uso.
  2. Prepare um bloco de agarose de 3% (aproximadamente 2 cm x 2 cm x 2 cm) e supercola-o ao disco do espécime do vibratome a fim criar a sustentação mecânica adicional à amostra do tecido durante o corte (figura 1E).
  3. Defina o vibratome para corte: espessura da seção de 200 μm, frequência de vibração de 100 Hz e velocidade de corte entre 0,5-1,0 mm/s.
  4. Bloqueie a bandeja tampão vibratome para a base vibratome e adicione gelo para mantê-lo refrigerado antes de receber a solução de corte e a amostra, e durante todo o procedimento de corte.

4. Coleção de amostras

NOTA: Neste protocolo, o tecido neocortical humano foi coletado na sala cirúrgica e transportado ao laboratório.

CUIDADO: Ao lidar com amostras humanas, siga os protocolos de segurança adequados estabelecidos pela Instituição.

  1. Configure o aparelho de transporte(Figura 1C)que consiste em: um cilindro de gás portátil com mistura de carbogênio conectado a uma válvula de pressão/fluxo que controla a saída de gás conectada a uma tubulação de silício que conecta a produção de gás ao transporte navio; uma embarcação de transporte, geralmente um tubo cônico de centrífuga de 50 mL com tampa perfurado para entrada de gás, contendo a solução de transporte; e gelo para resfriamento de amostras durante o transporte.
  2. Coletar e transportar o espécime(Figura 1B)imediatamente para o laboratório. Submerse o espécime em solução de transporte a frio (constantemente borbulhado com mistura de carbogênio).

5. Fatiamento

  1. Transfira o espécime para uma placa de Petri (100 mm x 20 mm) contendo solução de corte e, com ferramentas cirúrgicas finas, retire cuidadosamente o máximo possível das meninges restantes naamostra (Figura 1D).
  2. Escolha a melhor orientação do espécime para produzir fatias com as características particulares do projeto experimental, e com uma lâmina do scalpel no. 24, aparar uma superfície plana para ser a base colada ao disco do espécime.
  3. Usando uma colher de plástico descartável e pinceles delicados, recolher o fragmento da placa de Petri e solução seca em excesso usando papel de filtro (seco por capilaridade e evitar tocar o fragmento de tecido com papel).
  4. Usando supercola, anexar o tecido para o disco do espécime vibratome até que seja firmemente respeitado ao disco e em contato com o bloco de agarose (Figura 1E).
  5. Coloque o disco do espécime vibratome (com tecido devidamente ligado) na bandeja tampão vibratome preenchido com solução de corte que deve estar borbulhando durante todo o processo.
  6. Tranque o suporte da faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada.
  7. A solução de corte deve cobrir o espécime e a lâmina, só então começar a cortar (Figura 1F).
  8. Corte o espécime em fatias de 200 μm.
    NOTA: Embora alguns vibratomes cortem os espécimes automaticamente, a observação próxima e os ajustes menores na velocidade de corte durante o processo podem ajudar a produzir melhores fatias. Descarte fatias irregulares iniciais.
  9. Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri com solução de corte e aparar bordas soltas e excesso de branco mater para uma proporção de cerca de 70% de córtex/30% de matéria branca.

6. Cultura

NOTA: Executar esta etapa em um armário de fluxo laminar ambiente estéril.

  1. Adicione 600 μL de meio de cultura por poço (em uma placa de 24 poços) e incubar por pelo menos 20 minutos a 36 °C e 5% CO2 antes de chapeamento das fatias.
  2. Placa uma fatia por poço usando um pincel (Figura 1G).
  3. Se houver poços não utilizados na placa, preenchê-los com 400 μL de água estéril.
  4. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2.
    NOTA: Primeira substituição média deve ser feita entre 8-16 h após o revestimento, dependendo do tamanho da fatia.
  5. Suplemento 10 mL do meio de cultura previamente preparado com fator neurotrófico derivado do cérebro ng/mL de 50 ng/mL (BDNF).
    NOTA: Durante as primeiras 8-16 h, as fatias são incubadas em 600 μL de médio para evitar a privação de nutrientes e acidificação, uma vez que o consumo médio nesta fase é acelerado. A partir do próximo passo, o volume de médio por poço é ajustado para 400 μL.
  6. Retire 333 μL do meio condicionado de cada poço e adicione 133 μL de médio fresco suplementado por BDNF.
  7. Repita o processo de substituição média a cada 24 h, substituindo um terço do meio condicionado por um meio fresco suplementado por BDNF.

7. Avaliar a saúde, a morfologia e a função em fatias cultivadas

NOTA: Para induzir a morte celular com a finalidade de ilustração nos resultados representativos, algumas fatias foram submetidas a um tratamento de 24 h com o indutor de estresse oxidativo H2O2. Os passos 7.1.2 e 7.1.3 descrevem o uso de H2O2 para induzir a morte celular.

  1. Viabilidade celular
    NOTA: Um método simples e simples para avaliar neurotóxicos/neuroproteção em culturas de fatias desafiadas é o ensaio 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) , que mede a porcentagem de células metabólicas ativas em condições normais em comparação com amostras tratadas.
    1. No armário de fluxo laminar, substitua um terço do meio por meio fresco.
    2. A partir de uma solução de ações 30% H2O2, adicione um volume de H2O2 por poço para alcançar a concentração final pretendida (30 mM ou 300 mM).
      NOTA: H2O2 foi adicionado após a mudança diária do meio para garantir o fornecimento adequado de nutrientes frescos antes do desafio.
    3. Incubar a placa para 24 h a 36 °C, 5% CO2.
      NOTA: Após o tratamento H2O2 (ou outro estímulo tóxico de interesse), os seguintes passos descrevem a determinação de viabilidade celular pelo ensaio MTT.
    4. Adicione 40 μL de solução MTT a uma concentração final de 0,5 mg/mL a cada poço na placa.
    5. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2 para 3 h.
    6. Lave as fatias com sisino fisiológico amorteceu fosfato (PBS) e transfira para um microtubo.
    7. Retire cuidadosamente qualquer solução restante por pipetting.
    8. Pese os microtubos contendo as fatias para determinar a massa de cada fatia (esta é a chave para normalizar as leituras de absorção obtidas).
      NOTA: Se necessário, as amostras podem ser congeladas (-20 °C) nesta fase para processamento posterior.
    9. Homogeneize as fatias em 200 μL de isopropanol/HCl usando um pilão motorizado.
    10. Centrífuga à temperatura ambiente (RT) por 2 min a 2600 x g.
    11. Colete o supernatant e medir a absorção em 540 nm.
  2. Despolarização neuronal induzida por KCl
    NOTA: A fosforilação da proteína vacinatura ativada mitogênica (MAPK) sinalizando a proteína em cascata ERK, seguida pela mancha ocidental, pode ser usada para a quantificação da resposta neuronal à despolarização induzida por KCl37 .
    1. No armário de fluxo, substitua o meio de cultura em 300 μL de HBSS previamente equilibrado para 36 °C.
    2. Substitua o HBSS por 300 μL de HBSS fresco previamente equilibrado para 36 °C.
    3. Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2 para 15 min.
    4. Substitua o HBSS pelo HBSS fresco ou por uma solução dedepolarização kcl de 80 mM (ambas a 36 °C) e incubam a 36 °C, 5% DECO 2 por 15 min.
    5. Transfira as fatias da placa para microtubos. Nesta etapa, as fatias podem ser armazenadas a -20 °C para processamento posterior.
    6. Prepare extratos de tecido em 150 μL de ensaio radioimunoprecipitado (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% surfactante nonionic; 0,1% de sulfato dodócia de sódio; pH 7,5). Extratos de centrífuga a 4 °C por 10 min a 16000 x g, coletar supernatant, e determinar a concentração total de proteínas usando o método Bradford.
    7. Carregue 30 μg de proteína total em um sulofl dodecyl de 12% de poliacrilamida gel eletroforese (SDS-PAGE).
    8. Após a eletroforese, transfira o teor de gel para uma membrana de nitrocelulose.
    9. Depois de bloquear a membrana com 5% de leite seco não gordo em TBS mais 0,1% tween, incubar com mouse anti-pERK (1:1,000) para 16 h em 4 °C. Após a lavagem, incubar por 2 h em RT com coelho anti-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Incubar com o anticorpo secundário sAR-conjugado apropriado em RT para 1 h.
    11. Revele com o substrato pE preferido.
  3. Avaliação morfológica
    NOTA: Além da sobrevivência celular e avaliações funcionais, é importante analisar a morfologia do tecido. Esteja ciente de que a ressecção da fatia cultivada é um passo importante para produzir o máximo de material de alta qualidade possível para a análise morfológica.
    1. Fixação, crioproteção e ressecção das fatias
      1. Transfira as fatias dos poços com meio de cultura para uma nova placa de 24 poços contendo PBS.
      2. Retire o PBS e adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído (PFA). É importante que as fatias sejam mantidas planas antes de adicionar PFA. Incubar durante a noite em 4 °C.
      3. Retire cuidadosamente a solução PFA e adicione 1 mL de solução de sacarose de 30%. Incubar por 48 h a 4 °C.
      4. Defina o microtome congelante a -40 °C.
      5. Prepare uma base de sacarose no estágio microtome onde as fatias devem ser colocadas(Figura 2A). Deixe congelar completamente e cortar cuidadosamente parte da sacarose congelada para produzir uma superfície plana em que a fatia será colocada.
      6. Coloque cada fatia sobre uma película de plástico esticada e use um pincel para alisar o tecido.
      7. Transfira a fatia esticada para a base de sacarose congelada em um único movimento.
        NOTA: Não é possível mover a fatia uma vez que está sobre a base de sacarose congelada. Realize esta etapa de transferência com cuidado.
      8. Deixe a fatia descansar por 5-10 min para o congelamento adequado.
      9. Corte a fatia em 30 seções μm.
      10. Transfira as seções de 30 μm para uma placa de Petri contendo PBS.
      11. Siga para o protocolo de histologia mais adequado ao projeto experimental.
        NOTA: As seções de 30 μm podem ser prontamente usadas para imunohistoquímica flutuante, montadas em lâminas de microscopia para mais histologia ou armazenadas em solução anticongelante a -20 °C.
    2. Immunohistochemistry
      NOTA: Os protocolos padrão de imunohistoquímica e imunofluorescência variam entre os laboratórios. Para uma versão detalhada do protocolo utilizado aqui, consulte Horta et al.38. Os anticorpos primários utilizados para imunomanchas apresentados na Figura 2 incluem núcleos neuronais (NeuN), marcador de neurônio salutar saudável, proteína ácida fibrilária glial (GFAP), marcador astorcitos, adaptador de ligação de cálcio ionizado (Iba-1) e microglia Marcador.
      1. Incubar as fatias na solução de bloqueio (por exemplo, 2% de soro de burro normal em PBS) por 40 min.
      2. Incubar durante a noite com anticorpo primário agitação leve em 4 °C.
      3. Após a lavagem com PBS, incubar para 120 min com anticorpo secundário biotinylated agitação suave no RT.
      4. Depois de lavar com PBS, incubar em RT por 120 min com conjugado avidin-peroxidase(Tabela de Materiais).
      5. Revelar com DAB + 0,04% de níquel amônio.
      6. Monte as seções manchadas em lâminas de microscopia revestidas de gelatina e deixe-as secar o ar. Desidratar em etanol, diumcar em xileno, terminar com montagem média(Tabela de Materiais), cubra com um coverslip, e imagem.

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Resultados

Um aspecto crítico para avaliar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas é a presença e morfologia típica dos tipos esperados de células neurais, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana foi observada em uma fatia em DIV4, revelada pela imunorotulagem neuronal (Figura 2D). Além disso, também foi observada a presença esperada de microglia e astroglia (Figura 2B,C). Esses resultados demonstr...

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Discussão

Este protocolo para a produção de culturas de fatias de curto prazo flutuantes e de curto prazo é um método alternativo para cultivar fatias neocorticas humanas adultas. Tal protocolo para culturas de fatia pode ser passível de estudos sobre (mas não restrito a) optogenética1,44,45, eletrofisiologia2,3,4,5 <...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela FAPESP (Grant 25681-3/2017 para AS), CAPES (Bolsa de Pós-Doutorado PNPD/INCT-HSM para A.F. e bolsa de pré-doutorado para N.D.M.) e FAEPA. A G.M.A. possui uma bolsa de mestrado da FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. é dona de uma Bolsa de Pesquisa cnpq. Agradecemos aos pacientes e suas famílias por doarem os tecidos ressecados para este estudo. Gostaríamos de reconhecer o apoio de moradores, enfermeiros, técnicos e da equipe do CIREP, do Hospital Clínico da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, que ajudou em diversas etapas do processo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-PropanolMerck1096341000
Acrilamida/Bis-Acrilamida, solução a 30%Sigma AldrichA3449 
AgaroseSigma AldrichA9539
Persulfato de amônioSigmaA3678-25G
Anfotericina B Gibco15290-018
Anticorpo anti-ERK 2 (coelho)Santa Cruz Biotecnologysc-154Diluição 1:1,000 em BSA 2.5%
Anticorpo anti-pERK (camundongo)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Diluição 1:1.000 em BSA 2,5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA7906
Bradford 1x Corante ReagenteBioRad500-0205
EDTASigmaT3924Usado em tampão RIPA
GlicoseMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Sais Balanceados Hank'sSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Ácido clorídricoMerck1003171000
Peróxido de hidrogênio (H2O2)Vetec194
Mouse IgG, HRP-ligado ab inteiro (anti-mouse)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000Usado em tampão RIPA
Neurobasal AGibco10888-022
Leite seco desnatado (Molico)NestléUsado para bloqueio de membrana
PBS Tampão pH 7,2Laborclin590338
Penicilina/EstreptomicinaSigma AldrichP4333
Cloreto de potássioMerck1049361000
Prime Western Blotting Detection ReagentGERPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750Usado no buffer RIPA
TEMEDGE17-1312-01
Brometo de Tetrazólio Azul de Tiazolil (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378Usado no buffer RIPA
Triton x-100SigmaX100Usado no buffer RIPA
Água UltrapuraMilliporeÁgua estéril, derivada do sistema de purificação de água MiliQ
Equipamento e Materialplacas de
24 poçosCorningCL S3526Fundo Plano com Tampa
Amersham Potran Premium (membrana de nitrocelulose) GE29047575
Mistura de CarbógenosWhite Martins95% O2, 5% CO2
Incubadora de CO2New Brunswick ScientificCO-24Incubação de fatias 5% CO2, 36º C
Leitor de MicroplacasDispositivos Moleculares
MicrotubosGreiner0016081,5mL microtubo
Pilão motorizadoKimble Chase
Colherde plástico Tamanho de uma colher de sobremesa
Lâmina de barbearBicChrome Platinum, usada em fatiar com vibratome
Lâminade bisturiBecton Dickinson (BD)Número 24Usado para fatiar tecido; recomendado mesmo tamanho ou menor
Supercola (Loctite Super Bonder)HenkelComposição: Etilcianoacrilato; ácido 2-propenóico; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolímero
Vibratome Leica14047235612 - VT1000S
Nome do Material/ Equipamento para Imuno-histoquímica
Anticorpo anti-NeuN (camundongo)Millipore MAB377Diluição 1:1.000 em tampão fosfato
anticorpo anti-GFAP (camundongo)MerckMAB360Diluição 1:1.000 em tampão fosfato
anticorpo anti-Iba1 (coelho)AbcamEPR16588 - ab178846Diluição 1:2.000 em tampão fosfato
Biotinilado anti-camundongo IgG Anticorpo (H+L)VetorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EtanolMerck1.00983.1000
GelatinaSynth 00G1002.02.AEUsado para revestir lâminas
MicrótomoLeicaSM2010REquipado com Estágio de Congelamento (BFS-10MP, Physiotemp), definido para -40º C
Soro de burro normalJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldeídoSigma Aldrich158127
coelho IgG, HRP-ligado Ab inteiro (anti-coelho)GENA934-1ML
Slides (Star Frost)Knittel GlaserCorrediças revestidas de gelatina
SacaroseVetec60REAVET017050
Kit Vectastain ABC HRP (Peroxidase, Padrão)VetorPK-4000, Kit Padrão
XyleneSynth01X1001.01.BJ

Referências

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