Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Artur Fernandes; Niele  Dias Mendes; Glaucia  Maria Almeida; Giovanna  Orlovski Nogueira; Carla de Moraes Machado; Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior; João  Alberto Assirati Junior; Norberto Garcia-Cairasco; Luciano Neder; Adriano Sebollela

doi:10.3791/59845

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Artigo de método

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

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DOI:

10.3791/59845

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5 de novembro de 2019

Artur Fernandes¹^,² , Niele Dias Mendes¹^,³ , Glaucia Maria Almeida¹ , Giovanna Orlovski Nogueira¹ , Carla de Moraes Machado⁴ , Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior⁴ , João Alberto Assirati Junior⁵ , Norberto Garcia-Cairasco² , Luciano Neder³ , Adriano Sebollela¹

¹Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ²Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ³Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ⁴Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, ⁵Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Resumo

Organotypic, ou culturas da fatia, foram empregados extensamente para modelar aspectos do sistema nervoso central que funciona in vitro. Apesar do potencial das culturas de fatias na neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente os de seres humanos. O uso do tecido humano adulto para preparar culturas da fatia é particular atrativo realçar a compreensão de neuropatologias humanas, porque prendem as propriedades originais típicas do cérebro humano maduro que falta nas fatias produzidas do roedor (geralmente neonatal) tecido nervoso. Este protocolo descreve como usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias de curto prazo e flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas também são apresentados. Os resultados representativos demonstram que a laminação cortical humana típica está preservada nas fatias após 4 dias in vitro (DIV4), com presença prevista dos tipos principais da pilha neural. Além disso, as fatias no DIV4 passam por uma morte celular robusta quando desafiadas com um estímulo tóxico (H₂O_2),indicando o potencial deste modelo para servir como uma plataforma em ensaios de morte celular. Este método, uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo amplamente utilizado usando inserções de membrana, é recomendado principalmente para a execução de ensaios de curto prazo destinados a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade. Finalmente, embora o protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente, argumenta-se que o tecido coletado de outras regiões/condições cerebrais também deve ser consideradas como fontes para produzir culturas similares da fatia livre-flutuando.

Introdução

O uso de amostras humanas na pesquisa é inequivocamente uma ótima opção para estudar patologias cerebrais humanas, e técnicas modernas abriram novas maneiras de experimentação robusta e ética usando tecido derivado do paciente. Métodos como culturas organotípicas/fatias preparadas a partir do cérebro humano adulto têm sido cada vez mais utilizados em paradigmas como optogenética^1,eletrofisiologia^2,^3,^4,⁵, plasticidade ^6,^7,^8,