Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Resumo

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Resumo

Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.

Introdução

Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral¹. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal². Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a ....

Protocolo

Todos os estudos foram conduzidos em uma associação de avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais (AALAC)-instalações credenciadas de acordo com protocolos aprovados pela Rutgers New Jersey Medical School recursos de medicina comparativa.

1. preparação do mouse

Nota: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia de animais, levará de 30 a 40 min. antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubadora fechada no microscópio para 37 ° c.

1. Realize experimentos em camundongos TcrdEGFP de 8 – 10 semanas de idade em um fundo C57BL/6, que foram obtidos de Be....

Resultados

Usando a imagem latente intravital de ratos do repórter de tcrdegfp, nós mostramos previamente que ltγδ IELS exibem um comportamento dinâmico da fiscalização, em que patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e no espaço intercelular lateral (LIS) em constante Estado (Figura 2, filme 1).

Essa abordagem também pode ser usada para avaliar como a inibição de vias de sinalização celular específica e/ou receptores influencia o comporta.......

Discussão

O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares^8,9,22, interações célula-celular^{12, 25} e comportamento migratório^{celular 13,14,15,16,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hidrazida	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Agulhas hipodérmicas - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
Seringa Estéril com Ponta Deslizante BD - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Seringa Tuberculina	Thermo Fisher Tesoura	14-829-9
	Thermo Fisher Scientific	08-940
Eletrocautério	Thermo Fisher Scientific	50822501
Câmara de incubação fechada	OKOLAB		Agulhas
para Microscópio para Olhos, Tamanho #3; Círculo de 1/2, Ponto de Conicidade, 12 mm Comprimento do Acorde	Roboz	RS-7983-3
Hank's Solução salina balanceada	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) com módulos Start, Track, XT	Software	Bitplane
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Tesoura Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas 3" (7,5 cm) Longo 5 x 0,15 mm Reto Afiado	Roboz	RS-5600
Sutura cirúrgica não absorvível, Carretel de Seda, Trançado Preto	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25" (11 cm) Ponta lisa angular longa de 1,2 mm	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Pomada	Dechra		Lubrificante para os Olhos
Disco giratório Yokogawa CSU-W1 com uma objetiva de imersão de glicerol 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO, câmera iXon Life 888 EMCCD, laser de diodo de 405 nm, laser DPSS de 488 nm, laser de diodo de 640 nm	Andor		Sistema confocal
Xylazine	Akorn		Anesthesia

de dissecação Scientific