Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

Resumo

Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

Resumo

Há mais de 100 modificações quimicamente distintas do RNA, dois terços dos quais consistem em metilações. O interesse nas modificações do RNA, e especialmente nos methylations, reemergiu devido aos papéis importantes desempenharam pelas enzimas que escrevem e os apagam em processos biológicos relevantes à doença e ao cancro. Aqui, um ensaio in vitro sensível para a análise exata da atividade do escritor do metilação do RNA em RNAs transcritos sintéticos ou in vitro é fornecido. Este ensaio usa um formulário tritiado de S-adenosyl-Methionine, tendo por resultado a rotulagem direta do RNA misturado com trítio. A baixa energia da radiação trítio torna o método seguro, e métodos pré-existentes de amplificação de sinal de trítio, tornam possível quantificar e visualizar o RNA metilado sem o uso de anticorpos, que são comumente propensos a artefatos. Quando este método for escrito para o methylation do RNA, poucos ajustes fazem-no aplicável ao estudo de outras modificações do RNA que podem radioativamente ser etiquetadas, tais como a acetilação do RNA com a coenzima A do acetil ¹⁴C. globalmente, este ensaio permite avaliar rapidamente o RNA condições de metilação, inibição com inibidores da molécula pequena, ou o efeito do RNA ou mutantes enzimáticos, e fornece uma ferramenta poderosa para validar e expandir os resultados obtidos nas células.

Introdução

O DNA, o RNA e as proteínas estão sujeitos a modificações que regulam firmemente a expressão gênica¹. Entre essas modificações, ocorrem metilações em todos os três biopolímeros. Os methylations do ADN e da proteína foram estudados muito bem durante as últimas três décadas. Ao contrário, o interesse no metilação do RNA foi reacendeu somente recentemente à luz dos papéis importantes que as proteínas que escrevem, apagam ou ligam o methylations do RNA jogam no desenvolvimento e na doença². Além do que funções mais conhecidas nas RNAs abundantes ribossomal e da transferência, as vias do metilação do RNA regulam a estabilidad....

Protocolo

1. a transcrição in vitro e a purificação do gel do RNA alvo

1. Clone a seqüência de interesse em plasmíos contendo T7 e/ou SP6 promotores usando técnicas de clonagem molecular estabelecidas¹² ou kits.
2. Linearização do modelo de DNA para transcrição in vitro
   1. Amplificar a seqüência de interesse por PCR do plasmídeo com primers projetados para incluir a região promotora T7 através da pastilha, + 20-30 BP upstream e downstream como descrito anteriormente¹³.
   2. Alternativamente, digerir 5 μg do plasmídeo utilizando um local de corte da enzima de restrição (RE) disponível a j....

Resultados

Reacção de transcrição in vitro
Figura 2 A representa uma corrida típica de uma reação de transcrição in vitro com o RNA polimerase T7 do 7Sk snRNA, que é um RNA relativamente curto (331 NT) e altamente estruturado. Como mostrado nessa imagem crua, existem várias bandas indesejadas, tanto mais curtas quanto mais longas que 7SK, provavelmente resultantes de eventos aleatórios de iniciação ou terminação transcripcional. Devido a isso, a purificação do gel a.......

Discussão

Aqui, um método simples e robusto para a verificação in vitro da atividade do metiltransferase do RNA para transcritos específicos é relatado. O ensaio aproveita o fato de que a metionina S-adenosil pode ser tritiada no doador do grupo metil (Figura 1), permitindo que o RNA metilado seja detectado com precisão sem o uso de anticorpos. No entanto, é importante notar que este ensaio não pode indicar qual resíduo ou grupo químico é metilado pela enzima. Para identificar ou verificar se um resíd.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	Kit de escada de DNA de 10 bp.
10% de persulfato de amônio (APS)	N/A	N/A	Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia (Para 10 mL, dissolva 1g em 8 mL de água milliQ; ajuste o volume para 10 mL com água milliQ; filtre a solução usando uma seringa de 10 mL equipada com um 0,45 µ m).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia (Para 1L, adicione 108 g de Base Tris, 55 g de Ácido Bórico a um cilindro com uma barra de agitação; adicione 800 mL de água destilada e deixe dissolver; adicione 40mL de Na2EDTA 0.5 M (pH 8.0); ajuste o volume para 1L com água milliQ; filtre a solução usando um 0.22µ m).
10X COLHERES DE SOPA	N/A	N/A	Para 1L, adicione 60,5 g de Tris Base, 87,6 g de NaCl a um cilindro com uma barra de agitação; adicione 800 mL de água destilada e deixe dissolver; ajuste o pH para 7,5 com HCl concentrado; ajuste o volume para 1L com água milliQ; filtre a solução usando um 0,22 µ Filtro M.
Acrilamida: Bis-Acrilamida 29:1 (Solução a 40%/Eletroforese), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.
ADENOSIL-L-METIONINA, S-[METIL-3H]; (SAM [3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	Para metilação in vitro de RNA; Concentração = 1,0 mCi/mL; Atividade específica = 17,1 Ci/mmol; Molaridade= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 µM.    Após o recebimento do tubo 3H-SAM congelado, descongele-o a 4° C, faça 20 µ L alíquotas e congele-as a -30 ° C. Nunca congele novamente e reutilize uma alíquota parcialmente usada.
de autorradiografia hipercassete Amersham	GE Healthcare	RPN11649	Para exposição ao gel de autorradiograma.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	Para exposição ao gel de autorradiograma.
Contador de Cintilação	Beckman	LS6500	Para contagem de cintilação líquida.
Sistema de Eletroforese Horizontal Mini Biorad	1704466		Sistema de Eletroforese Horizontal.
Comprimidos de coquetel de inibidores de protease sem EDTA	Roche Applied Science	4693159001	completos Para uma solução 20X, dissolva 1 comprimido em 0,525 mL de água livre de nuclease.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	para gel de poliacrilamida.
vazios	de critério Biorad	1656001	Célula de eletroforese vertical de formato midi.
Espectrofotômetro de Microvolume DeNovix DS-11 Espectrofotômetro	DeNovix	DS-11-S	para medir a concentração de DNA e RNA.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	Para contagem de cintilação líquida.
Frascos de Cintilação HDPE 7mL da Fisherbrand	Fisher	03-337-1	Para contagem de cintilação líquida.
Realçador de autorradiografia de ação rápida Fluoro-Hance-Quick	RPI CORP	112600	Para pré-tratamento de gel de autorradiograma.
Secador de gel	Biorad	1651745	Para gel secante.
Tampão de carregamento de gel II	Ambion	AM8547	Para carregar RNA em gel de ureia de poliacrilamida desnaturante (composição: 95% de formamida, 18 mM de EDTA e 0,025% de SDS, xileno cianol e azul de bromofenol).
Pontas de excisão de gel descartáveis GeneCatcher	Gel Company	NC9431993	Para remover bandas de géis de agarose e poliacrilamida.
Kit Megascript	Ambion	AM1333	Para transcrição in vitro com T7 RNA polimerase.
Recipiente Extragrande Perfectwestern	Genhunter Corporation	NC9226382 (transparente)/ NC9965364 (preto)	Caixa de coloração em gel.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmídeo para produção de transcritos in vitro com extremidades homogêneas
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	Para limpeza de RNA, use o protocolo modificado fornecido no protocolo.
Kit de extração de gel QIAquick (50)	Kit Qiagen	28704	para extração de gel e limpeza de fragmento de dsDNA usado para transcrição in vitro.
Saran Premium Plastic	Wrap Saran Wrap	Amazon	Para gel secante.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Mancha de gel de ácido nucleico ultra sensível.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Coloração de gel de ácido nucleico.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dissódico, pH 8,0
TEMED	Fisher	110-18-9	Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.
Termomixer com SMARTBLOCK 24X 1,5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	Para incubação com temperatura controlada de tubos de 1,5 mL.
Kit de Clonagem TOPO TA	life technologies		Kits para clonagem rápida de Taq polimerase– produtos de PCR amplificados em vetores contendo promotores T7 e/ou SP6 para transcrição de RNA in vitro.
TURBO DNase (2 U⁄ µ L)	Ambion	AM2238	Para remoção de DNA de reações de transcrição in vitro.
Ureia	Sigma	51456-500G	Para gel de poliacrilamida desnaturante de ureia.
cromatografia dos cuidados médicos	3030-154	papel de Whatman 3MM	para o gel de secagem.

vazio livre de RNase de Microvolume Papel da de GE do