Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Resumo

Os fibroblastos adultos primários tornaram-se uma importante ferramenta para estudar fibrose, interações fibroblásticas e inflamação em todos os tecidos do corpo. Desde que os fibroblastos preliminares não podem dividir indefinidamente devido à diferenciação do Miofibroblasto ou à indução da senescência, as culturas novas devem ser estabelecidas regularmente. No entanto, existem vários obstáculos a superar durante os processos de desenvolvimento de um protocolo de isolamento confiável e isolamento primário de fibroblastos: o grau de dificuldade do método (especialmente para iniciantes), o risco de contaminação bacteriana, o tempo necessário até que os fibroblastos primários possam ser utilizados para experimentos, e subsequente qualidade e viabilidade celular. Neste estudo, um protocolo rápido, confiável e fácil de aprender para isolar e cultura fibroblastos adultos primários do coração do mouse, pulmão, fígado e rim combinando digestão enzimática e agitação ultra-sônica é fornecido.

Introdução

Os fibroblastos são células planas, em forma de fuso, com múltiplos processos de stellate e um retículo endoplasmático áspero^1,2. Um fibroblasto médio mede 30-100 μm e tem uma esperança de vida de 57 ± 3 dias^1,3. A duração média do ciclo celular de fibroblastos humanos varia de 16-48 h, dependendo das condições de cultura⁴. Há evidências de que a capacidade replicativa e a qualidade funcional dos fibroblastos primários cultivados se correlacionam negativamente com a idade do doador, sugerindo que os doadores mais jovens (animais....

Protocolo

O seguinte protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidados com os animais da Technische Universität Dresden, Alemanha (número do arquivo: T 2014/4), bem como as diretrizes de cuidados com os animais internacionalmente aceites (FELASA)¹⁷. A Figura 1 visualiza o processo de isolamento da célula.

1. preparando a configuração, material e mídia

1. Prepare o meio de cultura celular, solução de PBS, solução de estoque de mistura de colagenase (reconstituir 50 mg de mistura de colagenase liofilizada em 12 ml de água ultrapura estéril) e solução de tripsina de 0,25%.
2. Aqu....

Resultados

A habilidade deste protocolo de isolar fibroblasto adultos do tecido murino contínuo foi demonstrada. Foram obtidos fibroblastos viáveis que poderiam ser utilizados para experimentos subsequentes, como coloração por imunofluorescência ou experimentos de proliferação (Figura 2D-F, Figura 5A).

Os fibroblastos adultos são células planas em forma de eixo com múltiplos processos celulares que tipicamente c.......

Discussão

Comparado às linhas de pilha imortalizado do fibroblasto, os fibroblastos preliminares oferecem diversas vantagens. Eles podem ser isolados custo efetivamente em alta qualidade e quantidade. Além disso, as culturas primárias oferecem a possibilidade de estudar células de múltiplos indivíduos, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e diminui a probabilidade de meramente estudar artefatos de cultura celular. A geração contínua de novas culturas primárias previne alterações genéticas que comumente ocorrem apó.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	T4049-100ML
Antibióticos	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, EUA	Gibco LS15140148	Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)
Coupa de cultura de células	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	51023608	HeraSafe KSP15
Incubadora de cultura de células	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	50049176	BBD 6220
Placas de cultura de células	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	depende do vaso	6, 12, 24 poços Superfície Nunclon
Sucção de cultura de células	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Alemanha	20727400	BVC sucção profissional
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µ m Centrífuga de
Nylon	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	75007213	Megafuge
8R Controlador de pipetagem sem fio	Hirschmann, Eberstadt, Alemanha	9907200	Ponteiras
de pipeta descartáveis	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	depende do volume	Ponteiras SafeSeal para pipetas (10 µ L, 20 µ L, 100 µ L, 200 µ L, 1000 µ L)
Pipetas de plástico descartáveis	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	depende do volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Bisturi estéril descartável	Myco Medical, Cary, EUA	n.a.Techno	cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	de alta glicose
Eppendorf	, Hamburgo, Alemanha	depende do volume	50 e micro; L, 500 e micro; L, 1.500µ L, 2.000 µ L
Soro fetal de bezerro (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	F2442-50ML
Mistura de colagenase	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	5401020001	Liberase TL Placa de Petri de grau de pesquisa
6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	P5481-500EA
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA	D8537-500ML	500 mL
Kit de detecção de senescência	Abcam, Cambridge, Reino Unido	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Alemanha	n.a.MS2	Minishaker (modelo subsequente: Ident-Nr.: 0020016017)
Tubos de plástico estéreis	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	Falcon 352095	BD Tubos Falcon (15 mL, 50 mL)
Banho-maria ultrassônico	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlim, Alemanha	312	Sonorex RK100H
Tesoura cirúrgica (atraumática)	Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha	NR 82
Tesoura cirúrgica	Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha	eq 1060.09
Pinça cirúrgica	Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha	BD577

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