Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

Detta protokoll fokuserar på identifiering av proteiner som binder till inositol fosfater eller phosphoinositides. Den använder affinitetskromatografi med biotinylerade inositol fosfater eller phosphoinositides som immobiliseras via konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindande proteiner identifieras genom Western blotting eller masspektrometri.

Abstract

Inositol fosfater och phosphoinositides reglera flera cellulära processer i eukaryotes, inklusive genuttryck, vesikel trafficking, signaltransduktion, metabolism, och utveckling. Dessa metaboliter utföra denna reglerande aktivitet genom bindning till proteiner, därmed förändrade protein konformation, katalytisk aktivitet, och/eller interaktioner. Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till masspektrometri eller Western blotting att identifiera proteiner som interagerar med inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides är kemiskt märkta med biotin, som sedan fångas via konjugerat konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Proteiner isoleras genom sin affinitet av bindning till metaboliten, sedan eluerade och identifieras genom masspektrometri eller Western blotting. Metoden har ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt, och anpassningsbara, stödja analys av protein och metabolit interaktion med precision. Denna metod kan användas i etikettfri eller i aminosyremärkta kvantitativa masspektrometrimetoder för att identifiera interaktioner med proteinmetabolit i komplexa biologiska prover eller med hjälp av renade proteiner. Detta protokoll är optimerat för analys av proteiner från Trypanosoma rhodesiense, men det kan anpassas till relaterade protozoer parasiter, jäst eller däggdjursceller.

Introduction

Inositol fosfater (IPS) och phosphoinositides (Pis) spelar en central roll i eukaryotebiologi genom regleringen av cellulära processer såsom kontroll av genuttryck1,2,3, vesikel trafficking 4, signaltransduktion5,6, metabolism7,8,9, och utveckling8,10. Reglerande funktion av dessa metaboliter resulterar från deras förmåga att interagera med proteiner och därmed reglera proteinfunktion. Vid bindning av proteiner, IPs och PIs kan förändra protein konformation11, katalytisk aktivitet12, eller interaktioner13 och därmed påverka cellulär funktion. IPS och Pis distribueras i flera subcellulära fack, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiska Retikulum16,17, plasma membran1 och Cytosol18, antingen associerat med proteiner3,19 eller med rnas20.

Klyvning av membran-associerade PI (4,5) P2 av fosfolipas C resulterar i frisättning av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleras eller defosforyleras genom IP-kinaser respektive fosfataser. IPs är lösliga molekyler som kan binda till proteiner och utöva reglerande funktioner. Till exempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungera som en andra budbärare genom bindning till IP3-receptorer, som inducerar receptor överensstämmelser förändringar och därmed frisättning av ca2 + från intracellulära butiker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder till histondeacetylase-komplexet och reglerar proteinkomplex montering och aktivitet13. Andra exempel på IPS reglerande funktion omfattar kontroll av kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, och transkription1,2,3 . Däremot är PIs ofta förknippade med rekrytering av proteiner till plasmamembranet eller organell membran25. En framväxande egenskap hos Pis är dock förmågan att associera med proteiner i en icke-membranös miljö3,15,19,26. Detta är fallet med den nukleära receptorn steroidogena Factor, som transkriptionella kontrollfunktion regleras av PI (3, 4, 5) P319, och Poly-A polymeras som enzymatisk aktivitet regleras av kärn-PI (4,5) P226. En reglerande roll för IPS och Pis har visats i många organismer, inklusive jäst22,27, däggdjursceller19,23, Drosophila10 och Worms28. Av betydelse är den roll som dessa metaboliter i trypanosomes, som divergerat tidigt från eukaryotiska härstamning. Dessa metaboliter spelar en viktig roll i Trypanosoma rhodesiense transkriptionella kontroll1,3, utveckling8, organell biogenes och protein trafik29,30 , 31 , 32, och är också involverade i att kontrollera utveckling och infektion i patogenerna T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 och Plasmodium ,5 , 37. att förstå betydelsen av IPS och Pis i innebörder kan därför bidra till att belysa ny biologisk funktion för dessa molekyler och identifiera nya läkemedelsmål.

Specificiteten hos protein och IP eller PI bindning beror på protein samverkande domäner och fosforylering tillstånd av inositol13,38, även interaktioner med lipiddelen av Pis förekommer också19. Mångfalden av IPs och PIs och deras modifiera kinaser och fosfataser ger en flexibel cellulär mekanism för att kontrollera proteinfunktion som påverkas av metabolit tillgänglighet och överflöd, den fosforylering tillstånd av inositol, och protein interaktion1,3,13,38. Även om vissa protein domäner är väl kännetecknas39,40,41, t. ex., pleckstrin homologi domän42 och SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domäner43 ,44,45, vissa proteiner interagerar med IPS eller Pis genom mekanismer som förblir okända. Till exempel, den repressor-Activator protein 1 (RAP1) av T. rhodesiense saknar kanoniska PI-bindande domäner men interagerar med PI (3, 4, 5) P3 och kontrollera transkription av gener inblandade i antigen variation3. Affinitetskromatografi och masspektrometri analys av IP-eller PI-interagerande proteiner från trypanosome, jäst eller däggdjursceller identifierade flera proteiner utan kända IP-eller PI-bindande domäner8,46, 47. data tyder på ytterligare okarakteriserade protein domäner som binder till dessa metaboliter. Därför kan identifieringen av proteiner som interagerar med IPs eller PIs avslöja nya mekanismer för interaktion med proteinmetabolit och nya cellulära reglerande funktioner för dessa små molekyler.

Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till västerländsk blotting eller masspektrometri för att identifiera proteiner som binder till IPs eller PIs. Den använder biotinylerade IPS eller Pis som är antingen tvärbunden till konjugerat konjugerat till agarpärlor eller alternativt, fångas via konjugerat-konjugerade magnetiska pärlor (figur 1). Metoden ger ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt och lämpar sig för att detektera bindningen av proteiner från cell celllysat eller renade proteiner3 (figur 2). Metoden kan användas i etikettfria8,46 eller kopplad till aminosyramärkt kvantitativ masspektrometri47 för att identifiera IP-eller PI-bindande proteiner från komplexa biologiska prover. Därför är denna metod ett alternativ till de få metoder som finns för att studera samspelet mellan IPS eller Pis med cellulära proteiner och kommer att bidra till att förstå reglerande funktion av dessa metaboliter i innebörder och kanske andra eukaryotes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analys av IP-eller PI-bindande proteiner genom affinitetskromatografi och Western blotting

  1. Cell tillväxt, lys-och affinitetskromatografi
    1. Odla T. rhodesiense celler till mitten av log fas och övervaka cellernas lönsamhet och densitet. Totalt 5,0 x 107 celler räcker för en bindande analys.
      1. För blodomloppet former, växa celler i HMI-9 Media kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS) vid 37 ° c och 5% CO2. Behåll CELLTÄTHETEN mellan 8,0 x 105 till 1,6 x 106 celler/ml.
        Obs: densitet högre än 1,8 x 106 celler/ml kan påverka cellernas lönsamhet. Fördubblingen-tiden för T. rhodesiense 427 stam odlas in vitro är mellan 5,5 och 6,5 h.
      2. För procykliska former, växa celler i SDM-79 medium kompletteras med 10% FBS vid 27 ° c och hålla celltäthet mellan 1,0 x 107 och 3,0 x 107 celler/ml.
      3. För renade proteiner (t. ex. rekombinanta proteiner), ta 0,5 till 1 μg protein och späd i 450 μL bindningsbuffert (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenyl-polyetylenglykol, pH 7,4). Behåll 5% av det utspädda proteinet (input) för analys av Western blot. Gå vidare till steg 1.1.7.
    2. Centrifugera celler vid 1 600 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten.
      Anmärkning: se steg 2.1.2 för ytterligare information om centrifugering av stora kultur volymer.
    3. Omsuspendera pelleten försiktigt i 10 mL fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 kompletterad med 6 mM glukos (PBS-G) och förvärmd vid 37 ° c för att tvätta cellerna. Centrifugera sedan cellerna vid 1 600 x g i 5 minuter vid RT. Upprepa proceduren två gånger.
    4. Omsuspendera pelleten i 1 mL PBS-G. Överför sedan volymen till ett 1,5 mL-rör och centrifugera vid 1 600 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten.
      Obs: cell pellets kan blinka fryst i flytande kväve och lagras vid-80 ° c eller flytande kväve.
    5. Omsuspendera pelleten i 0,5 mL lyseringsbuffert (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7,4) kompletterad med 1,5 x proteashämmare cocktail och 1x fosfatashämmare cocktail (tabell över material) förkyld i is för att lysera cellerna. Inkubera lysate för 10 min roterande vid 50 rpm vid 4 ° c.
      Anmärkning: Detta är ett kritiskt steg eftersom proteiner kan brytas ned om de inte hanteras enligt vad som anges. Kontrollera integriteten hos proteinlysat med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS/PAGE) vid behov.
      FÖRSIKTIGHET: T-octylphenoxypolyethoxyethanol är giftigt och kan orsaka hud-och ögonirritation. Använd handskar, Eyeshield och faceshield skydd.
    6. Centrifugera lysatet vid 14 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Samla supernatanten i en ny 1,5 mL tub för bindande analyser. Behåll 5% av den totala lysate (input) för Western blotting analys. Supernatanten innehåller parasit proteiner som extraheras med lyseringsbuffert.
    7. Samla 50 μL av IPs eller PIs som konjugeras till aguppar pärlor (dvs. 50 μL slam) eller 50 μL av agaros pärlor, och Centrifugera i 1 min vid 1 000 x g. Kassera supernatanten och Omsuspendera i 50 μl bindningsbuffert för att jämvikt pärlorna. Använd icke-konjugerade pärlor som kontroll. Använd IP/PI-pärlor med olika fosfat konfiguration inklusive icke-fosforylerade former för att kontrollera för ospecifika interaktioner.
    8. Tillsätt 50 μL av IP-eller PI-pärlor till cellen lysate eller renade proteiner (varje 1 mL pärlor innehåller 10 nmol av konjugerade IPs eller PIs). Håll volymen av IP-eller PI-pärlor inom 10% av det totala lysatet och justera vid behov bindnings reaktions volymen med bindningsbuffert.
      1. För konkurrensanalyser, tillsätt till bindnings reaktionen olika koncentrationer av icke-konjugerade IPs eller PIs (t. ex. 1-, 10-, 100-faldigt molar överskott jämfört med IP-eller PI-pärlor).
    9. Inkubera reaktionen i 1 h, eller över natten, vid 4 ° c och rotera vid 50 RPM.
      Anmärkning: bindande reaktioner med renade proteiner kan göras vid RT beroende på proteiners stabilitet. Om du använder IPs eller PIs konjugerat till biotin endast gå vidare till steg 1.1.9.1, annars gå vidare till steg 1.1.10.
      1. Tillsätt 50 μL streptavidin-konjugerat till magnet pärlor till den bindande reaktionen och inkubera i 1 h vid 4 ° c roterande vid 50 RPM.
    10. Centrifugera blandningen i 1 min vid 1 000 x g vid 4 ° c. Ta bort supernatanten (genomströmning) och behåll pelleten. Behåll 5% av supernatanten för Western blot-analys.
      Anmärkning: om du använder magnetiska pärlor, ta bort samman supernatanterna och utföra efterföljande tvättar med ett magnetiskt stativ (centrifugationer är inte nödvändigt).
    11. Tillsätt 1 mL tvättbuffert (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenyl-polyetylenglykol, pH 7,4) och Omsuspendera kådan genom att knacka eller virvlande röret (Använd inte en pipett eftersom pärlorna kan fästas på pipettspetsarna). Centrifugera reaktionen i 1 min vid 1 000 x g vid 4 ° c och Kassera supernatanten. Upprepa proceduren för totalt fem tvättar.
      Varning: 4-nonyl fenyl-polyetylenglykol är giftig och kan orsaka hud och ögonirritation. Använd handskar, Eyeshield och faceshield skydd.
    12. Tillsätt 50 μL 2x Laemmli-buffert kompletterad med 710 mM 2-merkaptoetanol till pärlorna och blanda genom att knacka eller virvel för att eluera proteinerna. Värm vid 95 ° c i 5 min, Centrifugera sedan för 10 000 x g i 1 min och samla upp supernatanten (innehåller eluerade proteiner). Alternativt, eluera proteiner med 8 M urea/100 mm glycin pH 2,9 för att undvika att använda SDS. Frys eluatet vid-80 ° c, annars gå vidare till Western blot-analys.
      FÖRSIKTIGHET: 2-merkaptoetanol är giftigt och kan orsaka hud-, ögon-och respiratoriska irritationer. Använd handskar och arbeta i den kemiska huven.
  2. Western blotting analys
    1. Blanda 15 μL av indata (från steg 1.1.6) eller genomflödesprover (från steg 1.1.10) med 5 μL 4x Laemmli-buffert. Värmetillförsel och genomflödesprover i 5 min vid 95 ° c. För prover som elueras i 8 M urea/100 mM glycin pH 2,9, blanda 15 μL eluat med 5 μL 4x Laemmli buffert, och värme i 5 min vid 95 ° c.
      Obs: detta steg är inte nödvändigt för prover eluerade i 2x Laemmli buffert.
    2. Last brunnar på 4-20% SDS/PAGE gel med 2,5 μL av insatsen, 2,5 μL genomflöde, och 20 μL av eluerade prover, och Last protein stege enligt tillverkarens rekommendation.
      Anmärkning: Välj gel% enligt molekylvikten av proteinet av intresse.
    3. Kör SDS/PAGE vid 150 V för 30-45 min i löpbuffert, eller tills den blå färgen på Laemmli buffert är i slutet av gelen.
      Obs: tiden för körningen kan variera beroende på laboratorieutrustning.
    4. Ta bort gelen från glas (eller plast) plattor, och Blötlägg i överföringskonen i 15 min.
    5. Överför proteinerna till av polyvinylidenklorid difluoridmembran (PVDF) eller nitrocellulosa membran. Blötlägg membran och 3 mm filterpapper i överföringsbuffert. Montera en smörgås med tre ark filtrerpapper, nitrocellulosa eller PVDF-membran, gel, och ytterligare tre ark filtrerpapper. Se till att inga luftbubblor fastnar i smörgåsen. Använd en rulle för att ta bort bubblor vid behov. Ställ in membranet på katoden och gelen på anoden sidan av kassetten.
      Anmärkning: Kontrollera membran tillverkarens anvisningar för information om membran aktivering eller blot-beredning.
    6. Placera kassetten som innehåller smörgåsen i överförings behållaren med överföringsbuffert. Placera tanken i en ishink eller vid 4 ° c (t. ex. i kylrummet). Överför proteiner vid 100 V för 1 h (strömmen varierar mellan 200-400 mA). Alternativt, överföring över natten vid en konstant ström på 15 mA vid 4 ° c.
    7. Ta bort membranet från kassetten. Inkubera membranet i 6% fettfri torrmjölk utspädd i PBS med 0,05% av polysorbat 20 (PBS-T), eller kompatibel blockeringslösning, för 1 h vid RT för att blockera membranet.
      Obs: innan du blockerar membranet, kvaliteten på överföringen kan kontrolleras med Ponceau S fläcken. Inkubera membranet i 1 min i 15 mL Ponceau S, skölj i vatten och visualisera band.
    8. Ta bort blockeringslösningen och inkubera membranet i 1 h vid RT med 50 rpm rotation i primära antikroppar utspädda i 6% fettfri torrmjölk utspädd i PBS-T. Alternativt, inkubera membran över natten vid 4 ° c med 50 rpm rotation.
      Observera: tiden för inkubering kan variera beroende på kvaliteten på antikropparna. de flesta antikroppar kommer dock att arbeta med inkuberingar på 1-3 h vid RT. Följ tillverkarens rekommendation för antikroppar koncentration eller spädning.
    9. Tvätta blot genom att Inkubera membranet i PBS-T i 5 min med 50 rpm rotation vid RT. Upprepa proceduren 3-5 gånger. Fler tvättar kan behövas beroende på kvaliteten på antikroppar.
    10. Inkubera membranet i pepparrots peroxidas (HRP)-konjugerade sekundära antikroppar för 1 h vid RT i 6% fettfri torrmjölk utspädd i PBS-T med 50 rpm rotation.
      Anmärkning: Följ tillverkarens rekommendation för antikroppar koncentration eller spädning.
    11. Tvätta blot som anges i steg 1.2.9.
    12. Tillsätt Kemiluminiscens substrat för att täcka membranet. Ta bort överskottet av substrat och inkubera i 5 minuter vid RT i mörker.
      Anmärkning: Kontrollera tillverkarens anvisningar för rekommendationer om kemiluminiscensreagens.
    13. Fånga Kemiluminiscens signalen med hjälp av en kamerabasbaserad kamera. Alternativt kan du använda en röntgenfilm för att fånga den kemiluminiscenta signalen.

2. analys av IP/PI-bindande proteiner genom affinitetskromatografi och masspektrometri

  1. Cell tillväxt, lys-och affinitetskromatografi
    1. Odla T. rhodesiense celler till mitten av log fas och övervaka cellernas lönsamhet och densitet.
      Obs: totalt 1,0 x 1010 celler räcker för två bindande analyser. Att använda färre celler än vad som anges här kan påverka detekteringen av låg förekomst proteiner genom masspektrometri.
      1. För T. rhodesiense blodomlopp former, odla celler vid mitten av log fas (8,0 x 105-1,6 x 106 celler/ml) i HMI-9 Media kompletteras med 10% FBS vid 37 ° c och med 5% Co2. För 427 stam, 5 L kultur kommer att ge 0.5-1.0 x 1010 celler. Övervaka celltillväxt för att undvika densitet högre än 1,8 x 106 celler/ml som kan påverka cellernas lönsamhet. Håll cellkultur volymen till 1/10 av flask volymen. annars kommer tillväxttakten i cellerna påverkas på grund av dålig luftning.
        Anmärkning: 427 stammen har en fördubblings tid på 5,5-6,5 h.
      2. För procykliska former, växa celler i SDM-79 medium kompletteras med 10% FBS vid 27 ° c och hålla celltäthet mellan 1,0 x 107 och 3,0 x 107 celler/ml. 500 mL kultur kommer att ge 0.5-1.5 x 1010 celler.
    2. Centrifugera cellerna vid 1 600 x g i 15 minuter vid RT. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 200 ml PBS-g förvärmd vid 37 ° c. Använd runda botten centrifugering rör (tabell över material) eftersom T. rhodesiense blodomloppet form pellets är lätt störd när du använder fast vinkel Centrifugera rotorer. Centrifugera cellerna igen vid 1 600 x g i 5 minuter vid RT.
    3. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 10 mL PBS-G. Centrifugera cellerna vid 1 600 x g i 5 minuter vid RT. Upprepa proceduren och efter den sista tvätten, Kassera supernatanten.
      Obs: pellets kan vara blixt nedfrysta i flytande kväve och förvaras vid-80 ° c eller flytande kväve.
    4. Omsuspendera cellpelleten i 5 ml lyseringsbuffert före kyld i is och kompletterad med 1,5 x proteashämmare cocktail och 1x fosfatas hämmare cocktail (tabell över material). Inkubera lysatet i 10 minuter vid 4 ° c roterande vid 50 RPM.
    5. Centrifugera lysatet vid 10 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Samla upp supernatanten (solubilized proteiner) och späd den i 20 mL bindningsbuffert.
    6. Samla 400 μl av IPS eller Pis som konjugeras till aguppar pärlor (dvs. 400 μl slam) eller 400 μl kontroll pärlor, och Centrifugera i 1 min vid 1 000 x g vid RT. Kassera supernatanten och Omsuspendera i 400 μl bindningsbuffert för att jämvikt pärlorna. Använd aguppstod pärlor som en negativ kontroll för att bestämma specifik berikning av protein-metabolit interaktioner jämfört med ospecifika interaktioner (t. ex., proteiner som binder nonspecific till pärlorna). Använd IPs eller PIs med olika fosfatkonfigurationer inklusive icke-fosforylerade former för att kontrollera ospecifik interaktion på grund av fosfat laddningar eller bindning till biotin.
    7. Tillsätt 400 μL IP/PI-pärlor eller kontroll pärlor till 10 mL lysat och inkuberas i 1 h, eller över natten, vid 4 ° c roterande vid 50 RPM. Om du använder IPs eller PIs konjugerat med biotin endast (utan pärlor) Fortsätt till steg 2.1.7.1, annars gå vidare till steg 2.1.8.
      1. Tillsätt 100 μL streptavidin-konjugerat till magnetiska pärlor och inkubera i 1 h vid 4 ° c roterande vid 50 RPM.
    8. Centrifugera bindnings reaktionen i 1 min vid 1 000 x g vid 4 ° c. Ta bort supernatanten (genomströmning) och behåll pelleten. Behåll 5% av supernatanten för Western blot-analys.
    9. Tillsätt 5 mL tvättbuffert till pelleten, blanda försiktigt genom att snurra röret och centrifugera sedan i 1 min vid 1 000 x g vid 4 ° c. Kassera supernatanten. Upprepa tvätten fem gånger. Om du använder magnetiska pärlor, samla samman supernatanterna och utföra tvättar med ett magnetiskt stativ (centrifugationer är inte nödvändigt).
    10. Tillsätt 50 μL av 2x Laemmli buffert (eller 8 M urea/100 mM glycin pH 2,9, för att undvika att använda SDS) till pärlorna och blanda genom att knacka eller virvel (Undvik pipettering eftersom pärlor kan fästa pipettspetsarna), och sedan värma vid 95 ° c i 5 min. Centrifugera för 10 000 x g under 1 min och samla supernatanten (eluerade proteiner). Upprepa proceduren två gånger för att samla in totalt tre fraktioner.
    11. Frys eluatet vid-80 ° c, annars separata proteiner i SDS/PAGE eller förvara i lösning för trypsinization och masspektrometri analys.
  2. Trypsin nedbrytning av proteiner för masspektrometri
    Anmärkning: två varianter av denna procedur visas för avsnitt 2.2.1 (i gel) eller avsnitt 2.2.2 (i lösning) nedbrytning av proteiner. Protein låg bindnings rör rekommenderas för att förhindra prov förluster. Rådgöra med en analytisk kemist vid proteomikanläggningen lämpligheten av protokollet för prover och masspektrometerinstrument tillgängliga.
    1. In-gel trypsinization av proteiner
      1. Efter protein separation i SDS/PAGE, skölj snabbt gelen i hög renhet vatten. Överför gelen till en ren glasplatta. Accis protein band med ett rent blad och undvika att skära extra gel utanför banden. Skär gel bitarna i små bitar (dvs. ca 1 mm kvadrat) och överför dem till en 1 mL tub. Använd pipettspetsen om det behövs, men se till att pipettspetsen sköljs i etanol före användning.
        Obs: Använd handskar för att undvika gel kontamination. Gel bitarna kan förvaras vid-20 ° c.
      2. Tillsätt 100 μL höggradig eller högeffektiv vätskekromatografivatten till rören för att skölja gel bitarna. Kassera vattnet.
        1. För Coomassie eller ruthenium-baserade fluorescerande färgade gel bitar, inkubera gel bitarna i avfärgning lösning (25 mM NH4HCO3 i 50% acetonitril) för 1 h, kassera sedan lösningen. Upprepa proceduren tills färgning inte är synlig.
          Obs: Förbered lösningar som innehåller NH4HCO3 genom utspädning från en stamlösning på 100 mm NH4HCO3, pH 7,8.
          Varning: acetonitril är ett flyktigt lösningsmedel, brandfarligt och giftigt. NH4HCO3 kan orsaka hud-eller ögonirritation. Använd handskar och arbeta under en kemisk huva.
        2. För silverfärgade gel bitar, inkubera gel bitar i 50 μL avfärgning lösning för silver fläck (15 mM K3[FE (CN)6], 50 mm na2S2O3) i vatten i 30 min. Kassera lösningen och tvätta gel bitarna med 200 μl av vatten. Upprepa tvätt fem gånger eller tills gelgul färg inte syns.
          Varning: K3[FE (CN)6] kan orsaka hud-eller ögonirritation. Använd handskar.
      3. Torka av gel bitarna med 200 μL acetonitril i 10 minuter vid RT. Kassera sedan lösningen.
        Obs: torkade gel bitar är mindre i volym, ogenomskinlig, och tacky. Om flera bitar av gel kombineras i ett rör, upprepa proceduren för effektiv uttorkning av gel bitar.
      4. Tillsätt 50 μl (eller tillräckligt med volym för att täcka gel bitarna) för att reducera lösningen (10 mm Ditiotreitol [DTT] i 100 mm NH4HCO3) och inkubera vid 56 ° c i 1 h. efteråt, kyla rören till RT och kassera överskottet av reducerande lösning.
      5. Tillsätt 50 μL (eller tillräckligt med volym för att täcka gel bitarna) av alkyleringslösning (50 mM iodoacetamid i 100 mM NH4HCO3) och inkubera i 30 minuter vid RT i mörker. Efteråt, kassera överskottet av alkyleringslösning.
      6. Torka av gel bitarna med 200 μL acetonitril i 10 minuter vid RT. ta bort acetonitril och återfukta gel bitarna med 100 mM NH4HCO3 för 10 min vid RT.
      7. Torka av gel bitarna igen med 200 μL acetonitril i 10 min vid RT och kassera överskottet av lösning.
      8. Tillsätt 15 μL masspektrometriklass trypsin utspädd i 50 mM NH4HCO3 buffert, eller tillräckligt med volym för att täcka hydrerade gel bitar och inkubera i 4 h, eller över natten, vid 37 ° c. Behåll totalt trypsin belopp mellan 100 till 500 ng (eller 20 ng trypsin/μg protein).
      9. Kyl Provet till RT och Centrifugera i 1 min vid 2 000 x g i en microcentrifug. Tillsätt 10-20 μL 5-procentig myrsyra utspädd i vatten och inkubera i 10 minuter vid RT.
        FÖRSIKTIGHET: myrsyra är brandfarlig, frätande och giftig. Använd handskar och arbeta under en kemisk huva.
      10. Centrifugera enligt vad som anges i steg 2.2.1.9, samla sedan supernatanten (innehåller extraherade peptider) till ett annat rör. Tillsätt 20 μL 5-procentig myrsyra utspädd i 50-60% acetonitril till röret och inkubera i 10 minuter vid RT. samla extraherade peptid fraktioner i samma tub.
      11. Torka provet i en vakuum koncentrator och Rekonstituera i 10 μL 0,5% ättiksyra och 2% acetonitril för masspektrometrianalys. Centrifugera och samla in lösningen i botten av röret; Förvara lösningen vid-20 ° c eller-80 ° c.
    2. I lösningtrypsinization av proteiner
      1. Fällning av proteiner för att minska provvolymen, avsaltning och buffertutbyte. Tillsätt sex volymer kyld (-20 ° c) aceton till provet, t. ex. 600 μL aceton till 100 μL prov. Vortex och inkubera vid-20 ° c i 15 min till 1 h. Lösningen kommer att bli grumlig eller bilda en fällningslösning.
        Varning: aceton är giftig och brandfarlig. Använd handskar och arbeta under en kemisk huva.
      2. Centrifugera prover vid 4 ° c i 30 min. Dekanera aceton och lufttorka pelleten i 15 min.
      3. Tillsätt 10 μL 6-8 M urea eller 1% SDS i 50 mM NH4HCO3 för att lösa upp pelleten och virveln för att blanda. För större mängder proteiner (> 10 μg), Använd upp till 20 μL frisättnings buffert.
      4. Tillsätt 5 μL reducerande lösning och Vortex. Snurra volymen med en mikrocentrifug. Om proverna späds i urea, inkubera sedan i 1 h vid RT. Om proverna späds i SDS, inkuberas sedan 1 h vid 56 ° c.
      5. Snurra volymen med en mikrocentrifug. Tillsätt 3 μL alkyleringslösning och Vortex. Snurra sedan volymen och inkubera i mörkret i 30 minuter vid RT.
      6. Tillsätt 3 μL reducerande lösning för att neutralisera reaktionen. Späd provet långsamt till 1 M urea eller 0,05% SDS med 50 mM NH4HCO3.
        Anmärkning: trypsin digestionsbuffert måste ha rengöringsmedel eller denaturering. Koncentrationsgränser för denaturationsmedel är: 0,05% SDS; 0,1% oktylalkohol B-D-glucopyranosid; 0,1% 4-nonylfenyl-polyetylenglykol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% polysorbat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimetylammonio]- -1-propanesulfonat; < 1 M urea eller tiourea.
      7. Tillsätt 5 μL masspektrometriklass trypsin utspädd i 50 mM NH4HCO3 buffert och inkubera i 4 h, eller över natten, vid 37 ° c. Behåll totalt trypsin belopp mellan 100 och 500 ng (eller 20 ng trypsin/μg protein).
      8. Kyl Provet till RT och snurra volymen med en mikrocentrifug. Tillsätt 5% ättiksyra (eller 5% myrsyra i 50% acetonitril) för att släcka reaktionen.
      9. Torka proverna i en vakuum koncentrator enligt vad som anges i steg 2.2.1.11. Förvara proverna vid-80 ° c. Desalt och koncentrera peptider med hjälp av en omvänd fas kolumn som C18 zip-Tip och sedan analysera med masspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analys av RAP1 och PI (3, 4, 5) P3 interaktion genom affinitetskromatografi och Western blotting
Detta exempel illustrerar tillämpningen av denna metod för att analysera bindningen av Pis genom RAP1 från t. rhodesiense lysate eller med rekombinant t. rhodesiense RAP1 protein. Lysates av T. rhodesiense blodomloppet bildar det uttryckligt hemagglutinin (ha)-märkta RAP1 användes i bindande analyser. RAP1 är ett protein som deltar i transkriptionell kontroll av variant yta glykoprotein (VSG) gener3,48, som kodar för ytan proteiner inblandade i parasit immun skatteflykt genom antigena variation49. RAP1 interagerar inom ett telomerprotein komplex med fosfatidylinositol 5-fosfatas (PIP5Pase) enzym3, som också fungerar i kontrollen av VSG gentranskription1,3. RAP1 har en N-Terminal bröstcancer 1 carboxyl-Terminal (brct) domän som följs av en myeloblastosis (MYB) DNA-bindande domän och en C-Terminal MYB-liknande domän3,48. Det saknar dock kanoniska PI-bindningsdomäner. Bindande analyser utfördes med PIs som är icke-fosforylerade eller fosforyleras vid olika positioner av inositol ringen, och med icke-konjugerade aguppstod pärlor. Västerländsk analys visar att RAP1 binder företrädesvis till PI (3, 4, 5) P3-pärlor (figur 3A), men det binder också i mindre utsträckning till Pi (4,5) P2-pärlor. Emellertid, det inte binder till någon annan PIs eller aguppstod pärlor. Eftersom RAP1 är en del av ett multiprotein komplex3, dess interaktion med vissa Pis kan inte vara direkt och därmed resultat från RAP1-ha interaktion med andra cellulära proteiner som binder till Pis.

Därför, för att testa om RAP1 binder direkt till PIs, en C-terminalt taggade 6x-hans rekombinant RAP1 (rRAP1) proteinuttryck tes och renas till homogenitet från E. coli3. Proteinet användes i bindnings analyser med PI (3, 4, 5) P3-pärlor i närvaro av konkurrerande koncentrationer av PI (3, 4, 5) P3 eller PI (4,5) P2. Western blotting visar att ökande koncentrationer av PI (3, 4, 5) P3, men inte PI (4,5) P2 hämmar interaktionen mellan rRAP1 med PI (3, 4, 5) P3 (figur 3B). Dessutom, tillsats av T. rhodesiense renas PIP5Pase enzym till reaktionen återställas PI (3, 4, 5) P3-bindande av rRAP1, vilket beror på PIP5Pase Defosforylering av fria PI (3, 4, 5) P33 och därmed indikerar att fosforylering mönstret av denna metaboliten är nödvändig för rRAP1 bindning. Därför interagerar rRAP1 med PI (3, 4, 5) P3 som det gör RAP1-ha från T. rhodesiense Lysates. Dessutom visar data att bindningen av RAP1-HA från lysate till PI (4,5) P2 sannolikt resulterar från RAP1 interaktion med andra proteiner i komplexet (t. ex. PIP5Pase)3. Uppgifterna illustrerar komplementariteten hos bindande analyser med cell celllysat och rekombinanta proteiner. Det visar också nyttan av konkurrenskraftiga bindande analyser för att bestämma specificiteten av interaktioner mellan proteiner och PIs.

Identifiering av ins (1, 4, 5) P3 bindande proteiner genom affinitetskromatografi och masspektrometri
I detta exempel användes affinitetskromatografi följt av masspektrometri för att identifiera T. rhodesiense -proteiner som binder till ins (1, 4, 5) P3. Därför experiment undersökningar potentiella ins (1, 4, 5) P3 bindande proteiner från T. rhodesiense blodomloppet former. T. rhodesiense lysate inkuberades med ins (1, 4, 5) P3 konjugerade till aguppor eller med icke-konjugerade pärlor (används som kontroll), och bundna proteiner eluerades med laemmli provbuffert. SDS/PAGE-analys visar anrikning i proteiner som elueras från ins (1, 4, 5) P3-pärlor jämfört med proteiner som elueras från kontroll agaros pärlor (figur 4A). Masspektrometri analys av eluerade proteiner identifierade över 250 proteiner, varav 84 var berikade med ins (1, 4, 5) P3 pärlor jämfört med kontroll pärlor (figur 4B, vik förändring [FC] ≥ 2, p < 0,05). Berikningen av proteiner bundna till ins (1, 4, 5) P3 jämfört med kontroll pärlor korrelerar med den protein signal som upptäcks av SDS/PAGE. Data inkluderar proteiner som validerats för att binda ins (1, 4, 5) P3 och proteiner vilka mekanismer för bindning till ins (1, 4, 5) P3 är okända8. Dessutom de ins (1, 4, 5) P3 bindande proteomet skilde sig mycket från den av ins (1, 3, 4,5) P4 och andra PIs8, vilket tyder på att vissa av dessa proteiner erkänna den specifika fosfat konfigurationen av ins (1, 4, 5) P3. Därför kan biotin-märkta ins (1, 4, 5) P3 användas för affinitetskromatografi kopplad till masspektrometri för att identifiera proteiner som binder till ins (1, 4, 5) P3. Tillvägagångssättet kan utforskas för att identifiera proteiner som binder till andra IPS eller Pis3,8,46,47.

Figure 1
Figur 1 : Affinitet reagenser för bindande analyser. (A) PI (3, 4, 5) P3 (topp) och ins (1, 4, 5) P3 (botten) konjugerat till biotin vid SN1 läge av inositol. I PI (3, 4, 5) P3, är biotin konjugerat till lipidkedjan vid SN1 läge av inositol, medan i ins (1, 4, 5) P3 biotin konjugeras till fosfat vid position SN1. (B) ins (1, 4, 5) P3 är konjugerat med biotin och fångas via bindning till konjugerat konjugerat till pärlor (t. ex., aganor eller magnetiska pärlor). Varianter av dessa reagenser med hjälp av anpassade syntetiserade Linkers som ersätter biotin är också möjliga46. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Arbetsflödet för protokoll beskriver stegen för analys av IP-eller PI-tillhörighet interaktion med proteiner av T. rhodesiense och detektion av (a) Western blotting eller (B) masspektrometri. AC-WB, affinitetskromatografi och Western blotting; AC-MS, affinitetskromatografi och masspektrometri. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Bindning av T. rhodesiense RAP1 till phosphoinositides. A) Lysates av T. rhodesiense (5,0 x 107 parasiter) som uttrycker ha-märkta RAP1 inkuberades i 2 timmar vid 4 ° c med 50 μl Pis (varje 1 ml aganpärlor innehållande 10 nmol av konjugerade Pis) eller agaros (AG) pärlor. Den bindande reaktionen tvättades och eluerades med 2 x laemmli prov buffert och upphettades vid 95 ° c i 5 min. proteiner separerades i 4-20% SDS/sida, överföras till ett PVDF-membran, och sonderade med monoklonala antikroppar anti-ha (1:5000, utspädd i 6% PBS-mjölk) följt av anti-Mouse IgG-HRP (1:5000, utspädd i 6% PBS-mjölk), och upptäcks av chemiluminescence. B) en μg rRAP1 inkuberades för 1 h vid RT med 50 μl PI (3, 4,5) P3-agaros pärlor i närvaro eller frånvaro av 5 till 50 μm dioctanoylglycerol (DIC8) PI (3, 4, 5) P3, 20 till 50 ΜM diC8 PI (4,5) P2, eller 50 ΜM diC8 PI (3, 4, 5) p3 och 250 ng PIP5Pase renat från T. rhodesiense blodomloppet former3. Bindningen analyserades av Western blotting med mus anti-his HRP monoklonala antikroppar (1:2000, utspädd i 6% PBS-mjölk) och utvecklades av chemiluminescence. Denna siffra har modifierats från Cestari et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Affinitetskromatografi och masspektrometri analys av T. rhodesiense proteiner som binder till ins (1, 4, 5) P3. (A) 10% analys av SDS/Page av T. rhodesiense proteiner som binder till ins (1, 4, 5) P3-pärlor eller aguppstod pärlor. Lysates av 5,0 x 109 parasiter inkuberades vid 4 ° c i 2 timmar med 400 μl av ins (1, 4, 5) P3 konjugerat till agastärlor eller med agastinpärlor utan ins (1, 4, 5) P3 [1 ml pärlor innehåller 10 nmol av konjugerade ins (1, 4, 5) P3]. Den bindande reaktionen tvättades, eluerades i 2 x Laemmli prov buffert och kokt i 5 min vid 95 ° c. Proteiner separerades i 10% SDS/sida och färgas med Coomassie färgning (tabell över material). Pilspetsar visar proteiner som är berikade i ins (1, 4, 5) P3-pärlor jämfört med aguppstod pärlor; cirklar indikerar proteiner som finns i båda ins (1, 4, 5) P3-pärlor och aguppstod pärlor, och fästet indikerar proteiner som finns i båda men är berikade i ins (1, 4, 5) P3-pärlor jämfört med agaros pärlor. (B) dot-Plot visar proteiner som identifierats av masspektrometri som är berikade i ins (1, 4, 5) P3-pärlor jämfört med aguppstod pärlor. Berikning enligt FC > 2 och p-värde < 0,05. Fyra biologiska replikat användes för aguppstod-pärlor AC-MS, och tre biologiska replikat för IP3-pärlor AC-MS. Fold-förändring av proteiner som identifierats i IP3-pärlor vs aguppstod-pärlor beräknades med hjälp av peptid Spectra intensitet med hjälp av MSstat50. Detaljerade resultat och lista över peptider finns tillgängliga8. Masspektrometri rådata finns även med identifierare PXD005907 via ProteomeXchange Consortium via PRIDE partner repository. Denna siffra har modifierats från Cestari et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifieringen av proteiner som binder till IPs eller PIs är avgörande för att förstå den cellulära funktionen av dessa metaboliter. Affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri erbjuder en möjlighet att identifiera IP-eller PI-samverkande proteiner och därmed få insikter om deras reglerande funktion. IPS eller Pis kemiskt märkta [t. ex., ins (1, 4, 5) P3 kemiskt kopplad till biotin] och tvärbunden till Agros pärlor via konjugerat eller fångas av konjugerat magnetiska pärlor tillåter isolering av samverkande proteiner som sedan kan identifieras genom massa spektrometri eller Western blot. De protokoll som beskrivs här har använts för att identifiera proteiner från T. rhodesiense3,8 och däggdjursceller47 som binder till dessa metaboliter. Variationer av den metod som använder anpassade taggar (andra än biotin) har också använts i jäst46. En viktig faktor för detta tillvägagångssätt är användningen av kontroller för att diskriminera specifika från icke-specifika interaktioner. Icke-konjugerade pärlor är en viktig kontroll, men ytterligare kontroller kan innefatta icke-fosforylerade PIs eller inositol konjugerat till pärlor3. IPS eller Pis med olika fosfat kombinationer kan också användas på grund av att proteinbindningen till dessa metaboliter kan innefatta domäner som diskriminerar fosfat konfigurationen av inositol38, 39,40,41. Dessutom kan provet komplexitet påverka känsligheten hos metoden, och därmed minskar provet komplexitet genom provet fraktionering kan hjälpa till att upptäcka lågt förekommande proteiner i cellen. Det finns väletablerade protokoll för cellfraktionering och isolering av mitokonskerna51, Nucleus52, glykosome53, och flagellen se54,55 från trypanosomes. Observera att buffertar och reagenser som används i subcellulära fraktioneringar kan behöva justeras för kompatibilitet med buffertar och reagens som används i detta protokoll. Särskilt identifieringen av proteiner som binder till IPs eller PIs genom affinitetskromatografi som anges här beror på interaktionen mellan protein och metabolit, och därmed kan proteiner som har en svag affinitet för IPs eller PIs inte lätt upptäckas.

Analysen av IP eller PI interaktion med proteiner från cell lysate kan också resultera i identifiering av proteiner som inte binder direkt till dessa metaboliter, men som interaktion resultat från protein Association i komplex med andra proteiner som binder till IPs eller PIs. Denna funktion exemplifieras i figur 3A, där RAP1-ha från T. rhodesiense lysate verkar binda till Pi (3, 4, 5) P3-pärlor och PI (4,5) P2-pärlor. Men bindande analyser med hans-märkta rRAP1 visar att detta protein binder till PI (3, 4, 5) P3 och inte PI (4,5) P23. Detta illustreras i figur 3B, där konkurrenskraftiga analyser visar att Free PI (3, 4, 5) P3 men inte gratis PI (4,5) P2 tävlar för rRAP1-hans interaktion med PI (3, 4, 5) P3-pärlor. Den RAP1 skenbara interaktionen med PI (4,5) P2-pärlor beror på RAP1 Association inom ett komplex med proteiner som binder PI (4,5) P2 (t. ex. PIP5Pase)3. Därför kan bindande analyser från cell celllysat identifiera proteiner som binder direkt eller indirekt till IPS eller Pis. Särskilt indirekta interaktioner skiljer sig från ospecifika interaktioner eftersom den förstnämnda kan ha en biologisk funktion (i samband med protein komplexet) som påverkar eller påverkas av metabolitbindning. Till exempel, ins (1, 4, 5, 6) P4 binder till multi-subunit Co-repressor histondeacetylas Complex och styr den komplexa församlingen och aktivitet13. Därför är det viktigt att validera IP/PI interaktioner med proteiner. Validering av interaktion kan innefatta konkurrensanalyser med ett överskott av IPS eller Pis (som i figur 3B)3,8, mutationer av potentiella protein domäner56, eller användning av renade proteiner för att Bestäm direkt interaktion (figur 3A, B)3.

Andra metoder för att studera protein och IP eller PI interaktioner inkluderar bindningen av proteiner till radioaktivt märkt IPs eller PIs, den använda IPs eller PIs bunden till hydrofoba membran som matriser för protein fångst, eller bindningen av proteiner till PIs införlivas liposomer 42 , 57 , 58. viktigt, om protein interaktion med Pis kräver membranstrukturer38, Liposome-baserade analyser kan användas som en kompletterande metod. Begränsningar av dessa metoder inkluderar låg genomströmning, låg känslighet, den okända kemiska orienteringen av IPs eller PIs Association till matriser58, eller användning av radioaktiva material42. Den metod som beskrivs här är känslig, Liposome-fri, icke-radioaktiva, och IP/PI-pärlor är kommersiellt tillgängliga, och därmed de inte kräver skräddarsydd kemisk syntes. Vidare är placeringen av biotin kopplad till IPS eller Pis väldefinierad, och det kan också ändras46,58, vilket möjliggör noggrann analys av interaktion med protein och metabolit. Den metod som beskrivs här kan också kombineras med kvantitativa masspektrometrimetoder såsom stabil isotop märkning av aminosyror i cellodling (SILAC)47, som kan användas för att identifiera dynamiska interaktioner under olika cellulära behandlingar eller villkor. Affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri har bidragit till att identifiera många IP-eller PI-bindande proteiner från T. brucei, däggdjursceller och jäst3,8,46, 47, inklusive proteiner som inte har karakteriserat IP-eller PI-bindande domäner, och det har också bidragit till identifiering av nya bindnings domäner, t. ex., Pi (3, 4, 5) P3 bindnings domän47.

Sammantaget kan de protokoll som beskrivs här användas för att kartlägga potentiella IP-eller PI-samverkande proteiner från T. rhodesiense, och för att studera Proteiners molekylära interaktion med dessa metaboliter. Protokollet kan lätt anpassas för att identifiera IP-eller PI-bindande proteiner från andra encelliga parasiter eller från andra organismer såsom däggdjursceller47 och jäst46, och det kommer att bidra till att ytterligare förstå den biologiska funktionen hos IPS och PIs i eukaryotes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lansering tillägg för tidiga karriär forskare (DGECR-2019-00081) och av McGill University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Denna månad i JoVE inositol fosfater fosfatidylinositol fosfoinositid protein interaktion Trypanosoma metaboliter masspektrometri Western blotting affinitetskromatografi
Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter