Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

O câncer gástrico é o quinto câncer mais comum em todo o mundo e a terceira causa principal de morte por câncer. Em 2018, mais de 1 milhão casos novos de câncer gástrico foram diagnosticados globalmente, e cerca de 783.000 pessoas foram mortas por esta doença¹. A incidência e a mortalidade do câncer gástrico permanecem muito elevadas nos países asiáticos do nordeste^2,3. Apesar de avanços significativos no campo da terapêutica oncológica, o prognóstico de pacientes com câncer gástrico avançado permanece pobre, com uma taxa de sobrevida de cinco anos de aproximadamente 25%^{4,5,6, 7,}. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o câncer gástrico

O tratamento do câncer gástrico é desafiador por causa de sua alta heterogeneidade^8,9. Assim, a questão de como abordar os desafios da heterogeneidade tumoral para realizar a medicina de precisão é fundamental para a pesquisa do câncer. Os modelos in vitro e in vivo desempenham papéis cruciais na elucidação dos mecanismos heterogêneos e da biologia do câncer gástrico. Entretanto, embora existam inúmeras linhagens celulares de câncer gástrico e muitos modelos convencionais de camundongo transgênico para pesquisas pré-clínicas, as desvantagens desses modelos limitam suas aplicações¹⁰. Porque as características destes modelos mudaram na cultura, não mais modelo a heterogeneidade do tumor, e suas respostas não puderam prever respostas nos seres humanos¹¹. Essas questões limitam severamente a possibilidade de identificar subgrupos de pacientes oncológicos que responderão a medicamentos direcionados. A cultura de curto prazo de tumores primários fornece uma maneira relativamente rápida e personalizada para investigar propriedades farmacológicas anticâncer, que provavelmente será a marca registrada do tratamento de câncer personalizado.

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) são preferidos como um modelo pré-clínico alternativo para o perfil de resposta à droga¹². Além disso, os modelos PDX oferecem uma ferramenta poderosa para o estudo da iniciação e progressão do câncer^13,14. Os modelos de PDX preservam a aparência histologic de pilhas de cancro, mantêm a heterogeneidade intratumoral, e refletem melhor os componentes humanos relevantes do microambiente do tumor^15,16. No entanto, a limitação dos modelos PDX amplamente utilizados é a baixa taxa de sucesso para estabelecer e propagar serialmente tumores sólidos humanos. Neste estudo, são descritos métodos decentemente bem-sucedidos para o estabelecimento de modelos PDX e linhas celulares primárias.

Este estudo humano foi aprovado pelo Conselho de ética institucional da Sun Yat-Sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, China). O estudo animal foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Sun Yat-Sen. Nota: todos os experimentos foram realizados em conformidade com as leis pertinentes e diretrizes institucionais, incluindo a diretriz para proteção de exposição ocupacional contra patógenos transmitidos pelo sangue.

1. preparação da amostra

1. Obter tecidos de câncer gástrico (P0 = passagem 0) diretamente da operação. O espécime do tumor deve ser maior do que 0,5 cm³.
2. Prepare 3-4 mL de solução de ações: por exemplo, RPMI-1640 médio (1x) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina.
3. Põr o espécime fresco do tumor na estoque-solução em 4 ° c por não mais de 4 horas.

2. estabelecimento do modelo PDX (Figura 1)

1. Para assegurar uma área cirúrgica estéril, desinfete todos os materiais com luz ultravioleta por mais de 30 minutos antes da transferência no laboratório animal.
   Nota: a sala de operação precisa ser desinfetada com luz ultravioleta para 30 min, antes de limpar a mesa com dicloro trimesamida ácido de sódio supositoria desinfetante. Em seguida, povidona-iodo é usado para desinfectar a pele.
2. Usando fórceps e tesouras, dissecar com cuidado os tecidos do tumor e apará-los em diversas partes pequenas (aproximadamente 1 milímetro³ cubos) circunstâncias estéreis.
3. Anestesiar fêmeas 5-a 7-week-old NOD-SCID-IL2rg (NSG) camundongos por exposição a 1-1.5% isoflurano com uma máquina de anestesia.
   1. Anestesie o mouse até que ele pára de lutar, mas mantém mesmo a respiração.
      Nota: o tubo de 50 mL é um equipamento simples que funcione similar a uma máquina da anestesia. O uso da pomada veterinária do olho para impedir o secura é desnecessário devido ao tempo curto da operação.
4. Faça uma incisão de 1 cm em ambos os flancos dorsais usando tesouras estéreis e implante uma peça tumoral em cada flanco do mouse.
   1. Para assegurar-se de que a parte do tumor não deslize para fora, use o fórceps estéril para interromper o tecido subcutaneous. Em seguida, clip um pedaço do tecido tumoral, e colocá-lo no local profundo.
5. Feche a área de implante por sutura subcutânea com agulhas de sutura cirúrgica e marque as orelhas do mouse com tags de orelha rotuladas
6. Esterilizar a ferida com iodo.
7. Coloc delicadamente os ratos em uma gaiola vazia após a cirurgia ao manter o recumbency esternal. Preste muita atenção à condição dos camundongos; Eles acordam e começam a andar aproximadamente 3-4 min mais tarde. Coloc os ratos que se submeteram à cirurgia em uma outra gaiola nova separada daquelas não sujeitaram à cirurgia.
8. Avaliar o tamanho do tumor por palpação do local de implantação. Meça os tumores com um paquímetro Vernier duas vezes por semana.
9. Uma vez que o tumor atinge 10 mm de diâmetro, a condição animal piora, ou o tumor ulcerates, eutanizar o mouse com um método aprovado pelo IRB. Reimplante colheu fragmentos frescos do tumor em 2 ratos novos para o passaging, ou armazene temporariamente os espécimes em PBS no gelo para a isolação de linhas de pilha preliminares.

3. criopreservação tecidual

Nota: esta parte referencia principalmente os métodos para o kit de Cryo do Live tissue Kit. Os principais kits e equipamentos estão listados na tabela de materiais.

1. Eutanizar os camundongos com um método aprovado pelo IRB quando o tumor for maior que 10 mm de diâmetro.
2. Usando fórceps e tesouras estéreis, isole lentamente o tumor dos ratos.
3. Lave os tecidos tumorais com DPBS em um prato de 10 cm. Dissecar e remover áreas necróticas, tecido adiposo, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo com fórceps e tesouras.
4. Corte os tecidos tumorais a um máximo de 1 mm de espessura com um molde.
5. Lave as fatias com DPBS em um prato de 10 cm.
   Nota: o processo de vitrificação envolve o uso de tubos rotulados V1/V2/V3 nas etapas 3.6-3.8. Os principais ingredientes são DMSO e sacarose.
6. Transfira as fatias para o tubo v1 com fórceps e incubar o tubo a 4 ° c durante 4 min. Enrole e inverta brevemente o tubo, e coloque-o a 4 ° c por mais 4 min.
7. Despeje a solução v1 e fatias em um prato de 10 cm. Transfira as fatias para o tubo V2 com fórceps e incube o tubo v2 a 4 ° c durante 4 min. Role e inverta o tubo brevemente e coloque-o a 4 ° c por mais 4 min.
8. Despeje a solução V2 e fatias em um prato de 10 cm. Transfira as fatias para o tubo v3 com fórceps e incubar o tubo a 4 ° c durante 5 min. Enrole e inverta brevemente o tubo e coloque-o a 4 ° c durante, pelo menos, 5 min. Certifique-se de que todas as fatias se afundam na parte inferior do tubo.
   1. Se várias fatias permanecem flutuando, enrole e inverta o tubo brevemente, e coloque o tubo a 4 ° c novamente até que todas as fatias afundar completamente; se necessário, descarte as fatias flutuantes.
9. Despeje a solução v3 e fatias em um prato de 10 cm.
10. Corte os suportes do tecido ao comprimento apropriado, e coloc os na gaze estéril. Transfira as fatias para os suportes. Enrole os suportes com a gaze, e coloque-os em nitrogênio líquido usando fórceps, seguido de incubação por 5 min.
11. Rotule os frascos criogênicos com a informação do tecido.
12. Transfira os suportes com fatias de tecido em frascos criogênicos, que são armazenados em nitrogênio líquido.

4. isolamento das células primárias (Figura 2)

1. Esterilizar fórceps e tesouras com vapor de alta pressão a 121 ° c durante 30 min.
2. Resect amostras do cancro gastric dos espécimes resected ou dos tecidos colhidos de PDX. Coloque os tecidos no gelo e, em seguida, transfira os tecidos para um prato de cultura estéril de 10 cm.
3. Dissecar e remover áreas necróticas, tecido adiposo, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo com fórceps e tesouras.
4. Lave os tecidos tumorais uma vez com DPBS contendo 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina em um prato de 10 cm.
5. Corte o tecido tumoral em 1 mm³ peças na tampa do prato; a espessura máxima de cada peça deve ser de 1 mm.
6. Transfira os tecidos para um tubo de centrifugação de 50 ml com aproximadamente 7 ml de solução de colagenase tipo 1 e tripsina (1:14). Vortex a mistura brevemente.
7. Incubar o tubo num banho de água a 37 ° c durante 30-40 min. Vortex a mistura a cada 5 min.
8. Adicionar um volume igual de RPMI-1640 médio (1x) suplementado com 10% FBS para o tubo. Vórtice a mistura completamente.
9. Transfira a mistura para um novo tubo de centrífuga de 50 mL por filtração lenta através de um filtro de 40 μm.
   Nota: Use 40 μm filtros para garantir uma maior proporção de células cancerosas. Se necessário, os filtros de 100 μm podem ser usados para preservar mais tipos de pilhas, tais como pilhas imunológicas.
10. Centrifugue os filtrados a 113-163 x g por 5-7 min em RT. Retire cuidadosamente o sobrenadante.
11. Lave o pellet com 5 mL de PBS, e Retire cuidadosamente o sobrenadante.
12. Se o pellet é vermelho, ele contém muitos eritrócitos. Ressuspender suavemente a pelota com 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após uma incubação de 5 min, adicione 5 mL de PBS e Retire cuidadosamente o sobrenadante.
13. Ressuscitem a pelota com meio de cultura e transferem a mistura para um prato estéril de 10 cm.
14. Substitua o meio com meio contendo soro a cada 2-3 dias.
15. Passagem das células primárias usando Trypsin/EDTA quando chegar a 50% confluência.

Aqui, os tecidos tumorais de uma operação foram preservados em solução de estoque até o próximo passo. Dentro de 4 horas, os tecidos tumorais foram cortados em pedaços pequenos e implantados nos flancos dorsais de camundongos NSG que haviam sido anestesiados com algodão embebido em isoflurano. Tumores maiores que 1 cm3 poderiam ser ressecados para implantação em camundongos novos (Figura 1) ou cortados com cuidado e preservados em nitrogênio líquido seguindo o protocolo. Neste estudo, os tumores da primeira geração cresceram mais lentamente do que aqueles em gerações mais atrasadas, tomando 3 semanas ou mais por muito tempo para alcangar o tamanho apropriado. A taxa de sucesso da formação de tumores subcutâneos de primeira geração foi superior a 80%. Confirmou-se a identidade das células cancerosas de modelos PDX por H & E coloração um microscópio (Figura 3C). Finalmente, a taxa do sucesso da formação do tumor do tecido cryopreservado do tumor era aproximadamente 95%.

As pilhas de cancro preliminares foram isoladas como uma outra maneira de investigar o tumor individual. As pilhas foram isoladas dos espécimes operativos ou dos modelos de PDX. Os tecidos tumorais foram lavados com DPBS e cortados em pedaços. Os fragmentos do tecido foram digeridos completamente com tipo-1 colagenase e tripsina (1:14) antes da filtração. Após a remoção de eritrócitos, as células foram cultivadas da mesma forma que outras células cancerosas. As células mesenquimais sobreviventes morrem em passagens subsequentes (Figura 2). Baseado em diferenças na morfologia, nós podemos facilmente reconhecer pilhas do tumor. Células normais têm uma forma uniforme e tamanho, mas as células cancerosas vêm em vários tamanhos e formas. Adicionalmente, em células cancerosas, o núcleo tem estruturas irregulares e um citoplasma relativamente pequeno. Conseqüentemente, as pilhas preliminares foram autenticadas independentemente por dois patologistas um microscópio (Figura 3a). Para maior confirmação, utilizou-se a coloração de H & E para observar a morfologia das células cancerosas após a fixação (Figura 3B). A taxa de isolamento bem-sucedido das linhagens celulares primárias foi de aproximadamente 40%. As células primárias devem ser é 4 ou 5 vezes após o isolamento, e a autenticação patológica é necessária. Estas etapas podem demorar aproximadamente 20 dias.

Figura 1. Esquema para o estabelecimento de modelos paciente-derivados do xenograft (PDX).
Para estabelecer com sucesso os modelos de PDX, ressecar as massas do tumor na sala de operação para o processamento imediato. Divida o tumor em vários pedaços pequenos. Coloque bolas de algodão embebido em isoflurano em um tubo de 50 mL para anestesiizar os camundongos e cortar feridas em flancos dorsais. Blunt dissecar os tecidos subcutâneos com fórceps, e fórceps do uso para coloc uma parte do tumor por via subcutânea longe da ferida. Sutura e esterilizar as feridas. O processo da anestesia exige a monitoração cuidadosa de sinais vitais do rato, tais como a taxa da respiração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Esquema para o isolamento de células primárias.
Obter espécimes tumorais da sala de operação. Lave rapidamente os tecidos tumorais e corte-os em pedaços. Digerir os espécimes tumorais com colagenase tipo 1 e tripsina a 37 ° c por 30-40 min, misturando o tubo a cada 5 min. Em seguida, adicione um volume igual de meio com 10% FBS, centrifugue a mistura, e coloque o filtrado em um novo tubo. Retire o sobrenadante, e lave o pellet. Com base na cor da pelota, decidir se a lyse glóbulos vermelhos. Transfira a pelota em um prato estéril novo de 10 cm, e cultive as pilhas para diversas passagens antes da seleção da pilha de cancro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Autenticação de células cancerosas primárias.
(A) imagens de células primárias de doentes com GC. As pilhas foram isoladas diretamente dos tecidos frescos e é mais de 5 vezes. Barras de escala: 200 μm (esquerda), 100 μm (médio) e 50 μm (direita). (B) retratos de pilhas de cancro gastric preliminares H & E-manchadas. Barras de escala: 500 μm (esquerda), 200 μm (médio) e 100 μm (direita). (C) retratos de tumores de H & E-manchados PDX. Barras de escala: 500 μm (esquerda), 200 μm (médio) e 100 μm (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.