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Preparação e Utilização de células musculares lisas recém-isoladas para caracterização de correntes de cisão sensíveis ao 9 fenantropo

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DOI:

10.3791/59884

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31 de janeiro de 2020

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1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Urology, Medical University of South Carolina, 3Department of Urology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método de preparação das únicas células musculares lisas dedestruição recém-isoladas de espécimes da bexiga urinária humana que empregam um procedimento enzimático de duas etapas. As células DSM viáveis obtidas podem ser estudadas por várias técnicas de células únicas, incluindo a biosfisiologia de grampo-patch-grampo dentre-aniciana-B descrita para revelar propriedades fisiológicas e farmacológicas.

Resumo

Células de músculo liso detrusor (DSM) presentes dentro da parede urinária da bexiga, em última análise, facilitam o armazenamento e o vazio de urina. A preparação das células DSM viáveis, frescas e isoladas apresenta um importante desafio técnico cuja realização proporciona células ideais para estudos funcionais e moleculares subsequentes. O método desenvolvido e elaborado aqui, usado com sucesso pelo nosso grupo por mais de uma década, descreve a dissecação de espécimes de bexiga urinária humana obtidos de cirurgias de bexiga aberta seguidas de um tratamento enzimático de duas etapas de peças de DSM e trituração mecânica para obter células DSM recém-isoladas. O passo inicial envolve dissecação para separar a camada DSM (também conhecida como propria muscularis) da mucosa (urotélio, lamina propria e mucosa muscularis) e os tecidos conjuntivos, vasculares e adiposos adjacentes presentes. O DSM é então cortado em pedaços (2-3 mm x 4-6 mm) em solução nominal Ca2+contendo dissecação/digestão (DS). As peças do DSM são transferidas separadamente para e tratadas separadamente com DS contendo papaína e colagenase a ~37 °C para 30-45 min por etapa. Seguindo as lavas com DS contendo soro bovino sem enzimas e trituração com uma pipeta polida pelo fogo, as peças liberam células DSM únicas. As células DSM recém-isoladas são idealmente adequadas para caracterizações eletrofisiológicas e farmacológicas de canais de íons. Especificamente, mostramos que o bloqueador do canal TRPM4 9-fenantropl reduz as correntes de cation evocadas de etapa de tensão registradas com a abordagem perfurana-B perfurada. As células DSM também podem ser estudadas por outras técnicas, como RT-PCR de célula única, análise de micromatriz, imunocitoquímica, em ensaio de ligação de proximidade situ e imagem Ca2+. A principal vantagem de utilizar células DSM únicas é que as observações feitas se relacionam diretamente com as características unicelulares reveladas. Estudos de células DSM humanas recém-isoladas forneceram insights importantes caracterizando as propriedades de vários canais de íons, incluindo a permeável na bexiga urinária e continuarão como padrão-ouro na elucidação de propriedades celulares DSM e mecanismos regulatórios.

Introdução

As células de músculo liso detrusor (DSM) constituem o tipo celular mais abundante na bexiga urinária e, em última instância, controlam o armazenamento de urina e anulam através do relaxamento e contração, respectivamente. As células DSM formam feixes musculares lisos que se entrelaçam com tecido conjuntivo adjacente, processos nervosos, células intersticiais e outros tipos de células1. A compreensão atual do papel das células DSM na função bexiga urinária foi alcançada através de uma abordagem integrada multinível. Cada método experimental - seja baseado em células isoladas in vitro, tiras de tecido contendo feixes musculares lisos in vitro/ex vivo, ou determinações in vivo (como citometria e avaliações de funções de anulação) - fornece insights importantes e específicos sobre propriedades fisiológicas e farmacológicas do DSM (consulte revisões1,2,3,4,5,6 para detalhes). No entanto, a interpretação dos resultados obtidos a partir de células isoladas únicas permite que conclusões sejam especificamente atribuídas ao próprio tipo de célula única. Essa realização tem sido a força motriz para estabelecer um método confiável e reprodutível para obter células DSM recém-isoladas de toda a espessura de amostras de bexiga urinária. Ao contrário de muitos outros tipos de células, as células musculares lisas não podem ser cultivadas de forma confiável devido à perda de seu fenótipo nativo, incluindo alterações específicas em suas propriedades eletrofisiológicas e contraídeas7,8. Esse fato reforça ainda mais a importância de estudos realizados em células DSM fisiologicamente ativas recém-isoladas.

No final da década de 1980 e início dos anos 1990, o grupo de Isenberg (Alemanha) publicou uma série de estudos eletrofisiológicos sobre células DSM recém-isoladas obtidas de bexigas urinárias cobaias9,10,11,12,13 ( Tabela1). O método destacou duas observações importantes que ajudaram na obtenção de células vitais e serviram como diretriz inicial para outras pessoas seguirem. Eram 1) pré-tratamento de peças isoladas de DSM com solução /meio livre deCa+antes do tratamento enziático e 2) digestão tecidual com uma solução contendo colagenase. Essas duas etapas críticas foram incorporadas em todas as variantes subsequentes dos procedimentos de dissociação celular DSM(Tabela 1). Atualmente, nosso grupo emprega uma abordagem sequencial de dissociação papaina-colagenase de papaina. As peças de DSM são tratadas primeiro com uma solução enzimática contendo papaína e, em seguida, com solubilizada tipo Colagenase II na mesma solução (DS, solução dissecção/digestão). Essa abordagem produz células DSM únicas de várias espécies, incluindo cobaia, porco, rato, rato e, principalmente, humana(Tabela 1).

Células DSM únicas fornecem uma fonte para múltiplas biologia molecular e experimentos fisiológicos. Até agora, expressões proteicas e mRNA estudadas com imunocitoquímica, ou as determinações RT-PCR/qRT-PCR revelaram altos níveis de detecção para vários canais de íons, incluindo a grande tensão de condução e Ca2+ativado (BK), pequena condução Ca2+ativado K+ tipo 3 (SK 3), canais K+ (Kv),Ca2+ (Cav)e canais de trocador de medula potencial receptor transitório tipo 4 (TRPM4), bem como um trocador Na/Ca2+ 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Acredita-se que todos eles controlam a excitabilidade do DSM, os níveis intracelulares Ca2+ e a contratilidade. Abordagens eletrofisiológicas de grampo de patch, realizadas diretamente em cobaias, camundongos, ratos ou células DSM humanas, proporcionaram demonstração direta de propriedades biofísicas e farmacológicas de L-type Cav, Kv (Kv2.x Kv7), SK, BK e TRPM417,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. As abordagens incluíam um grampo de tensão convencional de células inteiras, um grampo de tensão perfurado e gravações de canal único (configurações de celular anexada, de dentro para fora e externas). Além disso, o registro potencial de membrana do DSM usando um grampo atual forneceu evidências de que agentes farmacológicos que envolvem o alvo alteram a excitabilidade celular. Por exemplo, o inibidor TRPM4 9-fenantropl induziu hiperpolarização em células DSM obtidas de humanos, cobaias e bexigas urinárias de ratos19,20,22,31. Entre os vários métodos eletrofisiológicos, as gravações de grampo-patch perfurado oferecem uma vantagem fundamental preservando moléculas e caminhos intrínsecos de sinalização intracelular. Apenas as quimios de baixo peso molecular e, em menor grau, cl- mas não proteínas ou moléculas de sinalização incluindo Ca2+ - são permeáveis através dos poros da membrana plasmática formados pela anfetização-B ou nystatin32. O resultado bem sucedido dos experimentos perfurados de patch-clamp depende de várias variáveis gerais exclusivas a esta técnica. Aqui, descrevemos os detalhes do procedimento utilizando a anhoticina-B que nosso grupo tem usado com sucesso ao longo dos anos15,22,33,34,35,36,37,38,39.

Indiscutivelmente, os canais de cisão não seletivo susenciam um dos tipos de canais menos compreendidos nas células DSM. O primeiro relatório de um canal não seletivo é de 1993. O artigo de Wellner e Isenberg11 descreveu um canal único ativado por 33 pS exibindo a seguinte ordem de classificação de permeabilidade de íons: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, e inibição da atividade do canal pelo Gd3+, um inibidor geral de canais de cation não seletivos. Quase uma década depois, Thorneloe e Nelson40 descreveram correntes de cation na+ permeáveis em células DSM do rato, inibidas pelo Gd3+, usando gravações de células inteiras. Uma vez que as identidades moleculares dos canais de cisão não seletivo sem seletiva e suas caracterizações biofísicas continuam a ser determinadas, futuras investigações nesta área de pesquisa são justificadas. O protocolo aqui descrito para o registro de correntes não-seletivas do canal de cation - utilizando soluções intracelulares extracelulares e pipette contendo Cs+, TEA+, e nifedipine(Tabela 2) que atenuantes fisiologicamente e farmacologicamente as correntes Kv e Cav - tem sido e continuará a ser útil em investigações eletrofisiológicas de canais de cisão não seletivos. Utilizamos este protocolo específico para determinar a extensão da inibição das correntes de cárcere de células inteiras pelo bloqueador do canal TRPM4 9-fenantropo em cobaia, rato e células DSM humanas19,20,22.

Em conjunto, o método descrito aqui para obter células DSM únicas recém-isoladas da bexiga urinária humana fornece células viáveis altamente adequadas para investigações eletrofisiológicas usando várias configurações da técnica de patch-clamp, Ca2+-imaging, imunocitoquímica, em ensaio situ proximal litigation, e uma única célula RT-PCR/qRT-PCR, bem como técnicas avançadas de biologia molecular, incluindo análise de micromatriz, RNA-seq, e-CHIP. O uso do método de fixação perfurada por anfetana-B preserva o ambiente celular nativo ao contrário de outras configurações. Quando realizadas utilizando as condições específicas aqui descritas, projetadas para negar contribuições das correntes K+ e Ca2+ nas células DSM, as correntes induzidas por etapa seduzidas de passo de tensão exibem as propriedades de correntes de cárcere não-seletivaadequadas para caracterizações biofísicas e farmacológicas.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelos Comitês do Conselho de Revisão Institucional do Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Tennessee (Memphis, TN, IRB# 17-05714-XP) e pela Universidade Médica da Carolina do Sul (Charleston, SC, IRB# 00045232). Os procedimentos aprovados permitem que amostras de bexiga urinária de espessura total (>1 cm por >1 cm) - contendo todas as camadas, incluindo mucosa, músculo salina de destruição e serosa também sejam anexados vasos sanguíneos e tecido adiposo) - sejam coletados de pacientes-doadores submetidos à extração parcial cirúrgica da bexiga. Pacientes-doadores são adultos (faixa etária estudada até agora: 25 a 87 anos), seja homem ou mulher, com ou sem sintomas de bexiga hiperativa (como classificado pela Associação Urológica Americana I-PSSpontua41). Os procedimentos cirúrgicos envolvem uma variedade de condições médicas, incluindo cistectomia radical para carcinoma urotelílico, e adenocarcinoma. Nesses casos, o espécime urinário coletado da bexiga está distante do local do tumor.

1. Dissecção de tecidos DSM e preparação de peças dSM sem mucosa

  1. Examine toda a espessura da vesícula urinária que chegou ao laboratório da sala de cirurgia em um recipiente bem selado cheio da solução de dissecação/digestão fria (Figura 1 e Tabela 2 para composição de DS).
    NOTA: O espécime geralmente é mantido em DS frio de algumas horas até durante a noite antes da chegada ao laboratório. Para armazenamento mais longo, dS (Tabela 2) é complementado com 1 mM CaCl2.
  2. Remova e enxágue todo o espécime DSM de espessura humana (contendo todas as camadas, incluindo mucosa, DSM e serosa) com DS gelado para lavar detritos e sangue presos.
  3. Pino o espécime urinário da bexiga, mucosa voltada para cima e serosa para baixo, em um enantiomer revestido de silicone(Tabela de Materiais) 150 mm de diâmetro prato redondo preenchido com DS frio gelo(Figura 1B).
  4. Remova o tecido adiposo adjacente, vasos sanguíneos, epitélio (urotélio) e mucosa muscular do espécime por dissecação acentuada usando microtesouras e fórceps.
  5. Corte várias peças dSM sem mucosa (~2-3 mm de comprimento e 4-6 mm de largura) (Figura 1C).

2. Dissociação enzimática de peças DSM que produzem células DSM recém-isoladas

  1. Coloque peças de 3 a 6 DSM em um tubo contendo peças de 1 a 2 mL de pré-aquecimento (~37 °C) DS contendo papaína e dithiothreitol (DS-P, Tabela 2)e incubapeças de DSM em DS-P por 30-45 min a ~37 °C sacudindo suavemente o tubo ocasionalmente (uma vez a cada 10-15 min).
    NOTA: Para controlar de forma ideal a temperatura para tratamento enzimática, tubos com peças teciduais e soluções enzimáticas são colocados em uma câmara de tecido de vidro cheia de água conectada a um banho de água aquecido circulante(Figura1D) ou um banho de água de alta precisão controlado pela temperatura(Figura 1E).
  2. Remova dS-P do tubo, lave brevemente pedaços de DSM com DS frio de gelo, descarte dS frio do tubo deixando peças DSM sentadas na parte inferior do tubo.
  3. Adicione 1 a 2 mL de DS contendo colagenase tipo II (DS-C, Tabela 2) ao tubo com peças DSM, misture delicadamente; e incubar por 25-40 min a ~37 °C suavemente sacudindo o tubo ocasionalmente (a cada 10-15 min).
  4. Descarte ds-C e lave peças dsm tratadas com enzimas 5-10 vezes com DS gelado.
  5. Após a última lavagem, deixe a solução DS dentro do tubo; triturar suavemente com uma pipeta Pasteur polida por fogo várias vezes para liberar células DSM únicas.
  6. Coloque algumas gotas de solução DS contendo células DSM dispersas em uma câmara de fundo de vidro ou um deslizamento de cobertura e inspecione visualmente a qualidade um microscópio (usando um objetivo de 20x ou 40x) após pelo menos 5 minutos após o aplicativo para permitir que as células aderem a parte inferior.
  7. Use imediatamente células DSM recém-isoladas para experimentos eletrofisiológicos ou armazene as células em um tubo contendo DS a ~4 °C no gelo ou em uma geladeira até o uso (normalmente para até 8 h de preparação).
    NOTA: Dentro do mesmo preparo, a qualidade das células varia de células DSM altamente viáveis a superdigeridas e mortas(Figura 2). Quando o método sequencial de papaina-colagemnase produz um número muito alto de células inviáveis, a preparação é descartada, e uma nova digestão de peças de DSM é realizada, mas com intervalos reduzidos de incubação. Se o procedimento resultar em poucas células DSM, então para a digestão subsequente de peças de DSM, os intervalos de incubação são aumentados. A imunoreatividade positiva à actina muscular α-lisa confirma a identidade das células DSM (Figura 3).

3. Gravação de correntes induzidas por etapa de tensão das células DSM usando técnica de repressão integral perfurada por células anfuláricas-B

  1. Pipette 0,25-1 mL de suspensão celular em uma câmara inferior de vidro sentada em um palco de um microscópio invertido e permite que as células aderem ao fundo do vidro.
  2. Após a incubação por pelo menos 45 min, retire o DS do banho e substitua a solução E (Tabela 2) por superfusão onde o fluxo de solução auxiliado pela gravidade através da lentidão da tubulação substitui o DS pela nova solução enquanto a tubulação de tomada conectada a um vaso de resíduos a vácuo remove a solução da câmara e evita o transbordamento. Observe que a solução E contém íons de tetraetimlamônio (TEA+) e césio (Cs+)para inibir as correntes K+.
  3. Prepare uma solução de estoque de trabalho de anfeticina-B em sulfoxida de dimetila (DMSO) (1 mg por 10 μL de DMSO). Para dissolver totalmente o pó de anfetizar, sonicate (pelo menos 15 min) e vórtice a solução bem.
    NOTA: Este passo geralmente leva menos de 10 min. Dissolver 3-4 mg de anfuládina-B em 30-40 μL de DSMO em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL funciona bem. Maiores quantidades de anhoticina-B requerem mais solvente DSMO tipicamente resultando em um intervalo mais longo para mistura e solubilização incompleta das partículas sólidas amphoticina-B presentes no tubo.
  4. Dissolva a solução de estoque de anfetua-B na solução pipette (solução P, Tabela 2) para obter uma concentração final de 200-500 μg/mL. Esta etapa requer extensa sonagem e vórtice em uma configuração de alta velocidade (8-10/10) por ~30 a 60 min por passo para garantir a mistura e prevenção ideal da formação precipitada de amphotericina-B na solução de pipeta.
    NOTA: A anhotericina-B vai precipitar ao longo do tempo e é sensível à luz. A solução de pipeta de trabalho contendo Amphotericin-B é verificada para solubilidade, misturada à mão antes do enchimento de pipeette, e mantida no escuro.
  5. Puxe vários eletrodos de remendo, pontas de eletrodos de polimento de fogo e (se necessário) cubra as pontas com cera dentária.
  6. Preencha a ponta de um eletrodo de patch com a solução pipette (solução P, Tabela 2) sem amphoticina-B, mergulhando brevemente o eletrodo na solução.
  7. Rechaça o eletrodo com a mesma solução de pipeta contendo anhoticina-B.
  8. Monte o eletrodo em um suporte conectado a um estágio de cabeça do amplificador de grampode remendo.
  9. Usando um micromanipulador, coloque o eletrodo logo abaixo da superfície da solução extracelular para que a ponta do eletrodo fique submersa.
  10. No modo de fixação de tensão, ajuste o potencial de retenção para 0 mV e ajuste a corrente para 0 pA com o mostrador de compensação pipette no amplificador comercial (Tabela de Materiais).
  11. Determine a resistência ao eletrodo utilizando a janela/função do Teste de Membrana do software de aquisição comercial (Tabela de Materiais). Para ativar clique em Tools>Membrane Test>Play ou um ícone de atalho no software. A resistência determinada ao eletrodo deve estar na faixa de 2 a 5 MΩ.
    NOTA: A função de teste de membrana fornecida no software de aquisição comercial ou na opção Seal Test no amplificador pode ser usada para monitorar a resistência ao eletrodo aplicando etapas de tensão repetidamente.
  12. Continue monitorando a resistência ao eletrodo enquanto avança o eletrodo em direção a uma célula DSM escolhida com um micromanipulador(Figura 4A).
    NOTA: Para ser considerada uma célula DSM viável, a célula deve mostrar morfologia alongada em forma de fuso, um halo bem definido ao redor da célula, bordas nítidas e aparência semi-contraívida (serpentina).
  13. Ao tocar a superfície da célula com o eletrodo - indicado por um rápido aumento na resistência ao eletrodo medido com a função de Teste de Membrana - formar um selo giga, aplicando pressão negativa rápida suave ao suporte do eletrodo via tubulação. Isso resulta em pressão negativa criada na ponta do eletrodo que puxa a membrana celular para o eletrodo auxiliando na formação de um giga-seal ou um contato muito apertado entre o eletrodo e a membrana plasmática(Figura 4B).
  14. Uma vez que o selo giga se formar, compense a capacidade da pipeta ajustando os mostradores rápidos e lentos no amplificador comercial e monitore a estabilidade giga-seal (corrente de vazamento) usando a função de Teste de Membrana.
  15. Permita tempo, tipicamente de 30-60 min, para que a anhoticina-B difunda a pipeta e seja inserida na membrana plasmática formando poros principalmente seletivos a cárinos monovalentes. Durante esta etapa, continue monitorando o selo giga com a função de Teste de Membrana. À medida que a perfuração celular aumenta, a amplitude dos transitórios de capacitância (compare figura 4B versus Figura 4C não exibindo nenhuma e efetiva perfuração celular, respectivamente) medida com a função de Teste de Membrana.
  16. Quando a perfuração do patch é ótima (julgada pela resistência de série estável tipicamente abaixo de 50 MΩ), cancele os transitórios de capacitância ajustando os mostradores para a capacidade celular e a resistência à série no amplificador. A compensação de resistência em série também pode ser realizada neste momento (Figura 4D).
  17. Uma vez que as correntes de fixação induzidas por etapa de tensão estável evocadas pelo protocolo especificado sejam observadas, aplique uma condição composta ou fisiológica para testar por superfusão e registre as respostas para o controle, condição de teste e lavagem (se possível) com o software de aquisição comercial.
    1. Correntes recordes com um protocolo de etapa de tensão de rotina que envolve a manutenção de células DSM em -64 ou -74 mV e pisar a tensão em incrementos de 10 mV para 400 ou 500 ms de -94 a +96 ou +106 mV e retornar ao potencial de detenção.
      NOTA: Os valores potenciais da membrana são ajustados para um potencial de junção líquida de 14 mV (utilizando soluções P e E, Tabela 2). O potencial de junção líquida é obtido no software de aquisição comercial (Tabela de Materiais) clicando(Tools>Junction Potentials) e entrando nas concentrações dos componentes de íons de solução. Um protocolo de rampa também pode ser usado para obter gravações atuais.
    2. Execute o protocolo de tensão em intervalo contínuo de ~1 min durante um experimento registrando correntes para controle pré-adição, condição de teste e lavagem.

4. Análise e visualização de dados

  1. Abra arquivos gravados no software de análise de dados comerciais (Tabela de Materiais) para o controle, condição de teste e lavagem clicando em File>Open Data e selecionando arquivos de interesse para abertura.
    NOTA: Para análise tipicamente três arquivos (cada um contendo um único conjunto de traços para uma única execução de protocolo) para cada condição são abertos e analisados. As respostas são posteriormente mediadas para obter uma resposta média para cada condição. O software usado para aquisição de dados contém uma opção para coletar automaticamente várias corridas de teste especificadas pelo usuário e médio-los para um único arquivo de saída que pode ser usado como alternativa.
  2. Obtenha a resposta média nos últimos 200 ms para o traço atual medido em cada tensão; o intervalo de duração escolhido reflete um nível de estado constante de ativação atual de etapa de tensão. Para isso siga os passos abaixo.
    1. Selecione um arquivo de interesse para análise no software de análise comercial (Tabela de Materiais).
      NOTA: O software posiciona o arquivo importado mais recentemente em sua janela de exibição ativa. O arquivo aberto exibe uma série de traços sobrepostos obtidos com um protocolo de passo de tensão. Por padrão, dentro da janela ativa quatro cursores (exibindo valores x e y para o traço destacado) são mostrados.
    2. Escolha o intervalo para análise posicionando cursor 2 ao final da etapa de tensão de 400 ou 500 ms e cursor 1 no intervalo de 200 ms antes disso para que a faixa de análise seja de 200 ms.
    3. Obtenha respostas para cada tensão clicando em Analisar>Gráfico Rápido>IV (ou no ícone de atalho IV) (na janela imediata antes de gerar dados confirmam que para as opções de sinalização y-axis (Current) "Cursors 1..2" e "Mean" são selecionadas). Clique em OK para gerar o gráfico I-V e para colocar os dados em uma folha de coluna de resultados que pode ser visualizada acessando o Windows>Results.
    4. Analisar arquivos adicionais repetindo etapas 4.2.1 - 4.2.3. Clique em Analisar>Gráfico Rápido>IV ou no atalho do ícone IV, selecione Apêndice em vez de Substituir para adicionar dados adicionais à folha de resultados ao processar os traços.
    5. Copie os dados para uma planilha selecionando as colunas de interesse e pressionando CTRL+C para copiar e CTRL+V para colar. Armazene a planilha de Resultados no software de análise comercial (Tabela de Materiais) no formato (*.rlt) clicando em File>Save As.
  3. Para cada célula, normalize as respostas para todas as três condições ao valor da etapa máxima de tensão para o controle de pré-adição (de acordo com a fórmula:Resposta/Controle de Resposta-Max) e grafe as respostas como valores atuais (ou densidade atual) versus relações de tensão(Figura 6).
    1. Em um processador de planilha, determine as respostas médias como correntes (pA) ou densidades atuais (pA/pF) para controle, condição de teste (neste exemplo, 9-fenantropo) e lave a cada etapa de tensão.
    2. Divida os valores para cada tensão de cada condição (controle, 9-fenantropo e lavagem) pela resposta máxima de controle obtida na maior tensão (+96 mV na Figura 6) para o controle pré-adição seguindo a fórmula: Resposta normalizada para condição(x) = Resposta(x)/ Controlede Resposta-Max para (x).
  4. Para análise sumária, organize os dados em um formato que pode ser facilmente copiado para um programa gráfico (por exemplo, Prisma graphpad) para visualização.

Resultados

A dissociação enzimática das peças de DSM fornece células DSM frescas e isoladas rotineiramente utilizadas em estudos funcionais e moleculares, tais como: eletrofisiologia de grampo de patch e imunocitoquímica. A Figura 1 resume as etapas de dissecção e visualiza as configurações empregadas para o controle de temperatura das etapas de tratamento enzimático. A Figura 2 ilustra imagens de campo brilhante de células DSM obtidas de três espécimes da bexiga urinária humana cada um de um paciente-doador diferente. Células DSM saudáveis são caracterizadas por morfologia em forma de fuso, bordas nítidas bem definidas, um halo bem definido ao redor da célula e aparência semi-contraíntea (semelhante à serpentina) quando vistas o microscópio (ver células DSM demarcadas por flechas brancas na Figura 2). Eles também respondem a agentes estimulantes de contração, como as aplicações de carbachol agonista muscarinic ou altas aplicações K+ (60 mM). As células DSM apresentam imunoatividade positiva para ato muscular α-suave confirmando sua identidade (Figura 3).

As células DSM são idealmente adequadas para investigações eletrofisiológicas de grampo de remendo de propriedades de canais de íons. Aqui, descrevemos o método de gravação perfurado por patch-clamp utilizando pipette e soluções extracelulares(Tabela 2) para gravar idealmente canais de cação induzidas por etapas de tensão. Nas condições específicas empregadas, o bloqueio das correntes Kv e L-type Ca2+ com Cs+/TEA+ e nifedipine, respectivamente, garantiu a eliminação da contribuição desses componentes iônicos para as correntes evocadas pela tensão celular inteira. A Figura 4 e a Figura 5 mostram, respectivamente, os passos experimentais do método de fixação perfurada entre antericina-B e as correntes representativas de células inteiras medidas, seja com um passo de tensão induzido ou um protocolo de rampa em três células DSM humanas diferentes, cada uma de um doador diferente do paciente. Observe que as gravações exibem um certo grau de variabilidade em termos de amplitudes atuais e retificação externa. Experimentos adicionais revelaram que 9-fenantropo, um inibidor de canal TRPM4, inibiu efetivamente e reversivelmente as correntes de cárcere dsm humano em tensões negativas e positivas(Figura 6). O componente atual sensível ao fenantropo de 9 anos ilustra uma inibição mais forte em tensões positivas e retificação externa(Figura 6C).

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Figura 1: Resumo das etapas de dissecção resultando na preparação de peças de músculo sem trusor (DSM) e configuração usada para dissociação enzimática. Mostradas imagens de:(A)um espécime de bexiga urinária humana de espessura inteira fornecido a partir de uma cirurgia de bexiga aberta como material cirúrgico estranho em DS frio no gelo, (B) a mesma preparação após a fixação com uma camada DSM parcialmente dissecada, (C) DSM peças de dimensões variáveis cortadas da camada DSM prontapara digestão enzimática (peças menores) ou outras investigações experimentais (peças maiores),(D, E) configurações alternativas usadas para digestão enzimática de peças DSM constituídas por ou (1) um banho de água circulador controlado pela temperatura conectado através da tubulação a uma grande câmara de tecido de vidro cheia de água, um suporte de borracha para tubos, tubos plásticos contendo peças DSM e soluções enzimáticas preparadas na solução de dissecção/digestão (DS, DS-P ou DS-C, Tabela 2) e uma sonda de temperatura ligada a um display que permite monitoramento contínuo(D),ou (2) um grande banho controlado pela temperatura cheia de água contendo um suporte e tubos com peças DSM e soluções enzimáticas (E) ). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Figura 2: Imagens representativas de campo brilhante de células DSM recém-isoladas humanas obtidas usando o método sequencial de digestão papaina-colagenase. (A-F) Exibidas são imagens de células DSM viáveis e fisiologicamente ativas consideradas candidatas adequadas para tentar gravações perfuradas de patch-clamp. (G, H) Imagens de células não viáveis ou superdigeridas; tais células foram evitadas para experimentos de grampo de patch. Setas brancas e pretas em painéis(A-H)apontam para células DSM consideradas viáveis e inviáveis, respectivamente, para tentar gravações de patch-clamp. Observe que as setas pretas nos painéis (A, C e G) apontam fragmentos celulares (peças circulares) ou pequenas células sem morfologia DSM e em(H)as células parecem pálidas e dilatadas. As imagens são de três diferentes amostras urinárias de bexiga (A e B : paciente-doador fonte um, C e D : fonte dois do paciente-doador, e E-H : fonte de doador de paciente sou três). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Figura 3: Expressões do receptor transitório potencial melastatin tipo 4 (TRPM4) canal e imunoatividades de actin específico do músculo α-suave em células DSM humanas únicas por análise de imunocitoquímica. (A) Mostradas são imagens confocais que mostram a detecção imunocitoquímica da expressão proteica do canal TRPM4 em uma célula DSM humana. A coloração vermelha (inferior esquerda) indica proteínas do canal TRPM4; a coloração azul (DAPI) detecta núcleos celulares (superior esquerdo); a coloração verde indica atonina muscular α-lisa (α-SMA, canto superior direito); a imagem mesclada (inferior direito) ilustra a sobreposição de todas as três imagens. (B) Imagens confocais que ilustram atenuação da detecção imunocitoquímica da expressão proteica do canal TRPM4 na presença de um peptídeo concorrente específico de TRPM4 (CP) em células DSM humanas isoladas. A coloração azul (DAPI) indica núcleos celulares (superior esquerdo); coloração verde é para atonina muscular α-lisa (α-SMA, superior direita); a imagem mesclada (inferior direito) ilustra a sobreposição de todas as três imagens. Os resultados foram verificados em quatro experimentos separados usando tecido integral DSM ou múltiplas células DSM isoladas de quatro pacientes. As imagens são de Hristov et al. (2016)22 e usadas com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Figura 4: Ilustração esquemática de passos envolvidos na formação de giga-seal e perforação amphotericina-B de células DSM humanas. Ilustrados são posições espaciais de uma tubulata contendo pipeta e uma célula DSM, juntamente com respostas associadas para testes de membrana obtidos no software de aquisição comercial (Tabela de Materiais)alterando etapas de tensão (-10 ou -20 mV neste exemplo) determinando resistência. As configurações são:(A)antes da abordagem celular com um eletrodo,(B) após a formação giga-seal obtida por posicionamento da amphoticina-B contendo pipeta (amphoticina-B representada por pontos vermelhos) na superfície celular e aplicando pressão negativa,(C)a configuração na célula mostrada ~45 min após a formação giga-seal, neste ponto de tempo amphoticina-B difundiu a pipeta e suas moléculas inseriram na membrana plasmática na ponta do eletrodo formando cation poros permeáveis e(D)a mesma configuração de(C),mas com transitórios de capacitância cancelados usando mostradores para capacitância de células inteiras e resistência à série no amplificador. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

figure-results-5
Figura 5: Correntes de cárcia saciadas inteiras registradas com método de fixação perfurada por anfetização-B em células DSM humanas. (A)Um diagrama do protocolo de etapa de tensão ilustra um potencial de retenção de -74 mV e detenções de 400 ms de duração de -94 a +96 mV realizado em incrementos de 10 mV e depois devolvido a -74 mV. (B, C) Traços de corrente representativos, juntamente com parcelas de tensão de densidade atual de duas células DSM humanas diferentes, cada uma de uma amostra urinária/paciente-doador diferente obtida com o protocolo de etapa de tensão descrito em (A). (D) Um exemplo de traço atual obtido com um protocolo de rampa (representado graficamente no início superior como mudança de tensão de -94 para +116 mV ao longo de uma duração de 1 s a 0,21 mV/ms, mantendo potencial foi de -94 mV). À direita em painéis(B-D),os gráficos exibem a relação de tensão de densidade atual para cada célula DSM registrada. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

figure-results-6
Figura 6: Bloqueador de canais TRPM4 9-fenantropl-mediado inibidor de correntes de coação induzidas por passos de tensão em células DSM humanas. (A) Mostradas são correntes representativas medidas com o protocolo de etapa de tensão descrito na Fig. 5A para controle, 9-fenantropo e lavagem. (B) Resumo de respostas normalizadas versus tensão para controle, 9-fenantropo e lavagem em sete células DSM (de sete pacientes-doadores diferentes). (C) Diferença atual para componente sensível ao 9-fenantropo obtido subtraindo os valores na presença de 9-fenantropo (30 μM) dos do controle mostrados em(B). Os dados em (B) e(C)são exibidos como meios com barras de erro para SEM, * retrata significado (p<0.05, teste de estudante emparelhado) para comparação de controle vs 9-fenantropo em cada tensão. Os painéis (A) e (B) foram reproduzidos a partir de Hristov et al. (2016)22 e usados com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

EspécieDetalhes do procedimentoReferências
CobaiaPeças de DSM enxaguadas com meio Ca2+-livre (em mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 MgCl2, 20 glicose, 50 taurina, pCa=6 (ou 1 mM) e, em seguida, cortadas em pedaços e tratadas tipicamente 90-120 min (4 períodos de 30 min) com enzima média (em mM: 130 KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH, KOH 20 taurina, 5 piruvate, 5 creatina, 10 mM HEPES, ajustada com ácido methansulfonic para pH 7.4, 1 mg/ml colagenase, 0,2 mg/ml pronase E, 1 mg/ml de graxar graxo free albumin, pCa=4.2 (63 mM) ou 3,7 (200 mM). As células DSM únicas foram armazenadas em Kraft-Bruhe (KB)-medium (em mM: 85 KCl, 30 K2PO4, 5 MgSO4, 5 Na2ATP, 5 K-pyruvate, 5 creatina, 20 taurina, 5 beta-OH-butirate, 1 mg/ml de graxo free albumin, ajustado com KOH para pH 7.2).
Método alternativo: Peças de DSM enxaguadas por 10 min em um médio Ca2+-livre (em mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgCl2, 10 glicose, 20 taurina, 5 HEPES, ajustadas com NaOH para pH 7.4). Em seguida, as peças de DSM, incubadas no mesmo meio Ca2+livre complementado com 5 mg% colagenase, 2 mg% pronase e 100 μM CaCl2 para 2x20 min agitação.		Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider et al. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore et al. (2004)14
Cobaia, porco landrace, e humanoPeças dSM pré-incubadas por 5 min em solução Krebs livres de Ca2+então cortadas em pedaços e enzimáticamente digeridas em solução Krebs sem Ca2+contendo 0,5-2 mg/ml de colagenase tipo I e 0,1-0,5 mg/ml pronase a 36°C para 20-30 min constantemente agitado. Em alguns casos, as peças digeridas foram ainda mais agitadas por uma pipeta de ponta cega ou girando até produzir células. As células isoladas foram armazenadas em solução krebs modificada (descrita em Klockner & Isenberg13) e normalmente eram usadas dentro de 3 h. A composição da solução Krebs foi (mM): 140 Na+, 6 K+, 2 Ca2+, 1.2 Mg2+, 152,4 Cl-, 10 glicose, 10 HEPES, pH 7.35-7.4 com Tris. Para solução Ca2+livre, Ca2+ e Mg2+ foram omitidos da solução Krebs.Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40
HumanoPeças dSM colocadas na solução de Tyrode hepes livreca 2+(em mM: 105.4 NaCl, 20.0 ou 22.3 NaHCO3, 3.6 KCl, 0.9 MgCl2, 0.4 NaH2PO4, 19,5 ou 4.9 HEPES, 5.4 ou 5,5 glicose, 4,5 ou 5,5 Na-pyruvate) e cortado em peças de DSM. Peças dSM encharcadas em uma solução enzimática (Solução HEPES livre Ca2+ com 0,7 mg/ml de colagenase tipo I, 0,7 mg/ml de papain, 1 mg/ml de albumin) durante a noite a 4°C. As tiras foram então aquecidas a 36,5°C por 15 a 30 min, lavadas e suavemente trituradas em solução fresca. Células isoladas que foram armazenadas em Ca2+ contendo a solução do Tyrode HEPES ou usadas imediatamente para experimentos.Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos e Fry (1994)41 Fry et al. (1994)42 Sui et al. (2001)43 Wu et al. (2002)44
CobaiaDSM cortado em pedaços em PSS (em mM: 137 NaCl, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 0,42 KH2P04, 4.17 NaHCO3, 10 glicose, 10 HEPES, pH 7.4 com NaOH). Peças dSM colocadas por 10 min na seguinte solução de digestão (em mM: 80 Na-glutamate, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glicose, 2 MgCl2e 0,2 CaCl2) e depois transferido para um frasco contendo a mesma solução, mas com 1 mg/ml colagenase 2, 1 mg/ml inibidor de trypsin (às vezes omitido), 1 mg/ml de min de bovino sem gordura, por ~ 70 min a 35°C ou ~60 min a 37°C. Células DSM únicas foram obtidas por trituração através de uma pipeta Pasteur na mesma solução sem cálcio e enzimas. Após a trituração, Ca2+ (1 mM) foi adicionado e as células foram armazenadas a 4°C. As células sempre foram usadas no mesmo dia.Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner et al. (1997)26 Petkov et al. (2001)47 Shieh et al. (2001, 2007)48,49
Cobaia, rato, rato e humanoO protocolo utiliza um tratamento de dissociação enzimática de duas etapas após dissecação acentuada na solução de digestão livre de Ca2+(em mM: 80 Na-glutamate, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glicose e 2 MgCl2). Primeiro, as peças de DSM foram tratadas por 25-45 min a 37°C com 1-2 mg/ml de papain, 1 mg/ml dithioerythreitol e 1 mg/ml de albumina de soro bovino em solução de dissociação (em mM: 80 glutamato monossódico, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES e 10 glicose, ajustados para pH 7.3 com NaOH) e, em seguida, peças de DSM transferidas para solução de digestão contendo 1-5 mg/ml colagenase XI (Sigma) ou colagenase tipo 2, 1 mg/ml de albumina de soro bovino, 0 ou 1 mg/ml inibidor de trypsin e 100 μM Ca2+, para 6-30 min. Após a incubação, o tecido digerido foi lavado várias vezes em solução de digestão sem enzimas e Ca2+ e, em seguida, gentilmente triturado para produzir células musculares lisas únicas.Petkov et al. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov et al. (2008)52 Layne et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2010) 53 Hristov et al. (2011)15 Xin et al. (2010)53 Hristov et al. (2011) 15 Xin et al. (2012)54 Parajuli et al. (2012)25 Malysz et al. (2013)29 Parajuli et al. (2013)31 Lee et al. (2013)55 Malysz et al. (2014)23 Smith et al. (2013) 19 ,19, 20 Hristov et al. (2016)22 Lee et al. (2017)56 Yarotskyy et al. (2018)57

Tabela 1: Resumo de abordagens enzimáticas usadas para isolar células DSM únicas de bexigas urinárias de várias espécies.

Tipo de soluçãoComposição (em mM)
DS (Solução dissecção/digestão)80 Na-glutamato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2e 11 glicose, pH ajustado para 7,4 (com 10 M NaOH)
DS-P (DS contendo mamão)DS contendo 1-2 mg/ml papain, 1 mg/ml dithiothreitol e 1 mg/ml de albumina de soro bovino
DS-C (DS contendo colagenase)Solução DS contendo 1-2 mg/ml de colagenase tipo II, 1 mg/ml de albumina de soro bovino, 0 ou 1 mg/ml inibidor de trypsin e 100-200 μM Ca2+
P (Pipeette)110 CsOH, 110 ácido aspartic, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA e 30 CsCl,pH ajustado sem 7,2 com CsOH, e complementado com anfeticina-B (300-500 μg/ml)
E (Extracelular)10 cloreto de tetraetimlamônio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES e 10 glicose, pH ajustado para 7.3-7.4 com NaOH ou CsOH, e 0,002-3 (2-3 mM) nifedipine

Tabela 2: Composições da solução dissecção/digestão (DS), e soluções de pipeta e extracelular utilizadas em experimentos perfurados de patch-clamp.

Discussão

Os procedimentos aqui descritos explicam as etapas envolvidas na preparação de células DSM viáveis e recém-isoladas de espécimes de bexiga urinária humana de espessura total usando digestão enzimática e no registro de correntes de cárcere de células inteiras sensíveis ao inibidor do canal TRPM4 9-fenantropl empregando a abordagem perforada de fixação de patchs perforada ampmerina-B. O procedimento enzimático baseia-se em uma exposição sequencial de duas etapas referida aqui como o método sequencial de digestão papaina-colagenase. Os tecidos DSM são tratados pela primeira vez com papaína e dithiothreitol (um agente estabilizador de enzima) uma condição nominal Ca2+livre, seguido no segundo passo pela colagenase tipo II na presença de baixo Ca2+. A justificativa para a realização da digestão de papaína condições baixas ca2+ em células musculares lisas remonta ao final da década de 1980. Células musculares carótidas recém-isoladas preparadas com papaína apresentaram uma forma alongada, mostraram viabilidade (resistência à captação trypan blue) e responderam a estímulos contraínicos (mais alto Ca2+ e histamina)65. Anos depois, esse método foi aplicado na elaboração de células DSM (ver Tabela 1). A escolha do tipo colagenase II em vez de outros tipos diz respeito à sua atividade proteolítica relativamente alta idealmente adequada para tecidos musculares lisos, incluindo dSM. De fato, o tratamento colagenase sozinho poderia produzir células DSM únicas, embora exigindo exposição extensa de enzimas (≥60 min)53,54. Como a atividade colagenase depende de Ca2+ e a enzima está inativa as condições Ca2+livres, a digestão enzimática ideal de peças de DSM requer a presença de Ca2+ 66. No nosso caso, o DS-C contém 100-200 μM [Ca2+](Tabela 2). Após o tratamento enzimático, as peças dSM digeridas são lavadas suavemente várias vezes com DS frio sem enzimas ou Ca2+ para remover qualquer enzima ligada aos tecidos. O DS gelado ajuda a preservar a integridade celular DSM e a limitar a atividade enzimática de qualquer papaína ou colagenase restante. Na última etapa, a trituração de peças DSM tratadas por enzimas com uma pipeta Pasteur polida de fogo libera uma única célula DSM. As células DSM são imediatamente colocadas em uma câmara de gravação para estudos de grampo de patch ou outros tipos de experimentação ou armazenadas no gelo em DS para uso mais tarde no mesmo dia (normalmente dentro de 8 horas de preparação, mas as células permanecem viáveis por até 24 h).

Identificamos várias considerações importantes para obter com sucesso células DSM únicas. O primeiro diz respeito à qualidade da origem da origem dos espécimes DSM humanos. Para preservar idealmente a integridade do tecido, as amostras de DSM obtidas de cirurgias de bexiga aberta são colocadas em DS frio o mais rápido possível e mantidas em um ambiente frio. Especificamente, após a extração cirúrgica do paciente, o espécime da bexiga é imediatamente colocado em uma mesa lateral totalmente preparada na sala de cirurgia. Exame grosseiro de todo o espécime (geralmente obtido durante cistectomia radical ou simples) e sua abertura segue. Após a inspeção visual, um pedaço de amostra urinária de espessura total é removido de uma área remota do espécime grosseiramente não envolvido com tumor e imediatamente colocado em um copo (50 ou 100 mL) contendo solução de dissecção fria (~4 °C)(DS) (Tabela 2) e, em seguida, firmemente fechada com uma tampa. Devido à natureza planejada da colheita do tecido, o pessoal da sala de cirurgia e o pessoal auxiliar que faz a colheita são alertados no início da caixa cirúrgica para ter os materiais disponíveis na sala de cirurgia no momento da extração do tecido. Essas precauções, juntamente com a natureza rotineira e repetitiva das etapas de processamento, mantêm o tempo de isquemia quente para o tecido - da extração à colocação no recipiente refrigerado com solução DS - a menos de 5 min. O recipiente é então colocado em uma geladeira ou no gelo em um refrigerador para manter o ambiente frio e transportado (gelado) para o laboratório. Uma vez que o espécime chega em laboratório, começam as etapas de dissecação e dissociação enzimática. É muito difícil prever se um determinado espécime DSM produzirá células DSM de alta qualidade após dissociação enzimática, por isso prosseguimos com as etapas de dissociação enzimática. Em muitos casos, paralelamente a experimentos eletrofisiológicos, nosso grupo realiza gravações de tensão isométrica em tiras dSM preparadas a partir dos mesmos espécimes DSM. Descobrimos que geralmente podemos obter células DSM de alta qualidade a partir de preparações que também fornecem com sucesso tiras viáveis para estudos de contração isométrica (nossa observação inédita).

O segundo fator diz respeito a diferentes variações de lote enzimático. Observamos que, tanto para papaína quanto coloagenase tipo II, cada vez que um novo lote de enzima chega de um fornecedor, a atividade enzimática em DS para digestão de tecidos pode variar. Nós, portanto, otimizamos rotineiramente a concentração de enzimas e os intervalos de incubação para cada novo lote. Para minimizar a contribuição de variabilidade do lote, pedimos maiores quantidades do mesmo lote e fazemos um grande lote de soluções de estoque em 2 alíquotas de enzimas e as armazenamos a ~-20 °C até o uso. Com o tempo, no entanto, os estoques congelados (armazenados até 2 semanas) podem perder sua atividade enzimática. A terceira variável diz respeito à temperatura dos tratamentos de digestão enzimática. Atividades enzimáticas tanto de papaína quanto colagenase exibem dependência de temperatura. Papaína e colagenase tipo II exibem atividade nas faixas de temperatura que abrangem fisiologia corporal normal67,68. Por isso, pretendemos manter os tratamentos enzicultores estáveis em ~37 °C, evitando temperaturas mais altas para preservar a integridade celular DSM. A quarta consideração diz respeito à variabilidade da qualidade das células DSM presentes em cada preparação que vai desde altamente viáveis (apresentando excelentes características musculares lisas clássicas) até células não saudáveis e superdigeridas. Um intervalo prolongado de incubação de enzimas é uma das principais razões para obter um alto número de células danificadas. Tratamentos enzienzymes excessivos também prejudicam estruturas proteicas de canais de íons, receptores e transportadores, afetando negativamente sua funcionalidade. A interpretação dos resultados obtidos a partir de células enzimáticas obtidas, recém-isoladas, deve ter essa consideração em mente. A otimização das condições de digestão enzimáticavisa aumentar o percentual de células altamente viáveis. Abordagens experimentais que dependem de um maior número de células viáveis, como análises de micromatriz, requerem otimizações mais robustas do que aquelas realizadas com sucesso em menos células, como eletrofisiologia de grampo de patch-clamp de célula única ou imagem Ca2+. A consideração dos fatores acima mencionados tem guiado nossos esforços de pesquisa na última década na obtenção de células DSM únicas de alta qualidade.

A técnica perfurada de patch-clamp tem sido uma abordagem eletrofisiológica de base por mais de um quarto de século. Várias publicações fornecem detalhes das considerações técnicas69,70,71,72,73. A perfuração celular pode ser obtida com anfeticina-B, nystatin, gramicidina ou β-escin (ver referência32para visão geral de cada um). A principal vantagem das gravações perfuradas de patch-clamp sobre outras abordagens eletrofisiológicas é que o ambiente intracelular nativo - incluindo o Intracelular Ca2+e as moléculas de sinalização (por exemplo, cAMP, PKA, fosfatos e fosforasterases) - são preservadas. Essa técnica é, portanto, idealmente adequada para investigar correntes de canais de íons inteiros e seus mecanismos regulatórios em condições fisiológicas próximas. Uma ressalva chave é que a composição celular intracelular não pode ser precisamente controlada ao contrário de outros métodos eletrofisiológicos, como gravações convencionais de patch inteiro e de um único canal (dentro e fora). Em nossa experiência, três fatores rotineiramente contribuem para resultados experimentais bem sucedidos de experimentos de fixação de patch-perforado por amphotericina-B. A primeira é a qualidade da célula DSM escolhida para tentar uma gravação. Quando as células DSM são altamente viáveis exibindo um semi-contraído (semelhante a serpentina), aparência brilhante de alto contraste com um halo bem definido ao redor da superfície celular e se prende firmemente ao fundo de vidro da câmara de gravação, então a formação de foca selação giga e perfuração celular ocorrem relativamente fácil. O segundo e terceiro fatores para o sucesso, respectivamente, referem-se à qualidade da origem e solubilização da anhoticina-B (na solução de sulfoxida/DMSO de dimetile e tubulata intracelular). Observamos discrepâncias entre diferentes fornecedores em termos de variabilidade de origem e lote. Todos os dias preparamos uma nova solução de solução de estoque de anfeticina-B a partir do pó seguida de sua diluição na solução de pipeta intracelular. Essas etapas requerem extensa sonagem e vórtice. Com solução de pipeta contendo anhoticina-B recém-feita, perfuração celular bem sucedida (<50 MΩ) following giga-seal formation can be usually obtained within 30 min. The concentration of amphotericin-B in the pipette solution also requires optimization dependent on the amphotericin-B lot and source. Under our experimental conditions, the final amphotericin-B concentrations in the pipette range from 200 to 500 µg/mL. Since amphotericin-B exhibits light sensitivity, its solutions need to be kept in the dark. Using the amphotericin-B perforated patch-clamp technique, our group recorded voltage-step induced K mω)="" following="" giga-seal="" formation="" can="" be="" usually="" obtained="" within="" 30="" min.="" the="" concentration="" of="" amphotericin-b="" in="" the="" pipette="" solution="" also="" requires="" optimization="" dependent="" on="" the="" amphotericin-b="" lot="" and="" source.="" under="" our="" experimental="" conditions,="" the="" final="" amphotericin-b="" concentrations="" in="" the="" pipette="" range="" from="" 200="" to="" 500="" µg/ml.="" since="" amphotericin-b="" exhibits="" light="" sensitivity,="" its="" solutions="" need="" to="" be="" kept="" in="" the="" dark.="" using="" the="" amphotericin-b="" perforated="" patch-clamp="" technique,="" our="" group="" recorded="" voltage-step="" induced="">+Ca2+e correntes de cation não seletivas de células humanas, cobaias, rato e/ou rato DSM17,21,22,23,29,30,31,35,60. Aqui, descrevemos condições para registrar correntes de cárcere não-seletiva em células DSM humanas. 9-Fenanthrol, um bloqueador de canais TRPM4, atenuou as correntes induzidas por etapa de tensão apoiando o papel desses canais no controle da excitabilidade DSM. Como nota, geralmente requer pelo menos 45 min depois de obter um selo giga e iniciação de perfuração para registrar as melhores correntes de fixação não seletiva induzidas por etapas não seletivas. Rampas de tensão também podem ser usadas como alternativa aos protocolos de etapas de tensão30,64. Aqui, um protocolo de etapa de tensão a partir de um potencial de membrana de retenção hiperpolarizada foi preferido em vez de um protocolo de rampa, uma vez que a abordagem anterior minimiza o efeito da inativação dependente da tensão e permite uma média de corrente evocada ao longo de uma duração de uma tensão-passo onde a rampa fornece um único ponto de dados por tensão. Este último ponto se aplica especialmente às células DSM humanas, pois as correntes apresentam atividade variável durante as etapas de tensão (Figura 5EFigura 6). A técnica de fixação perfurada por anhoticina-B tem sido essencial na identificação das propriedades das células DSM e outros tipos de células e continuará a auxiliar no fornecimento de novas descobertas no futuro. Além disso, células DSM simples recém-isoladas podem ser usadas com sucesso para medir K de célula seleção inteira+Cl-, e Ca2+correntes com o modo convencional da técnica de fixação de patches, gravação potencial de membrana com o grampo atual e gravações de canal único como exemplificados por nossos relatórios anteriores23,29,35,64.

Além dos métodos de fixação de patch-clamp de célulaúnicaúnica, as células DSM recém-isoladas podem ser estudadas com outras abordagens técnicas, incluindo ca2+ imagem, RT-PCR/q-RT-PCR, imunocitoquímica, em ensaio de ligação de proximidade situ, e abordagens genômicas (por exemplo, micromatriz, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. À medida que os métodos de determinação de transcriptome de células únicas continuam a evoluir e tornar-se altamente sensíveis, imaginamos em uma capacidade futura de vincular rotineiramente e especificamente propriedades elétricas ou farmacológicas de células DSM individuais com seus perfis transcriptome/proteome. Isso será alcançado pela primeira gravação de uma célula DSM e, em seguida, extraindo mRNA ou proteína seguida de análises transcriômicas/proteômicas. Embora tais métodos já tenham sido testados em células não DSM, eles são atualmente tecnicamente desafiadores, não têm sensibilidade para serem considerados rotineiros e limitados à detecção bem sucedida de alguns produtos genéticos selecionados74. A expressão de perfil-função molecular que liga estudos quando feitos em células DSM obtidas a partir de bexigas urinárias derivadas de controle e pacientes-doadores doentes fornecerá insights sobre processos fisiológicos essenciais para conduzir funções normais de DSM, patógense e na identificação de novas abordagens terapêuticas eficazes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções NIH-R01DK106964 e P20DK123971 a Georgi V. Petkov. Os autores agradecem ao Dr. Viktor Yarotskyy e à Sra. Sarah Maxwell pela avaliação crítica do manuscrito. Também somos gratos aos cirurgiões da equipe de urologia do MUSC e da UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter e Anthony Patterson, bem como os residentes da MUSC e UTHSC Urology: Drs. Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata para sua ajuda na coleta de tecidos humanos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de poliestireno de 5 ml com fundo redondoFalcon352054Tubes para DS contendo enzimas usadas em etapas de digestão
9-PhenanthrolSigma-Aldrich211281inibidor de canal TRPM4
Anfotericina-BFisherBP928-250Usado para adesivo / perfuração celular
Anfotericina BPadrões de Referência da Farmacopeia Europeia5Usado para adesivo / perfuração celular
Anfotericina BSigma-AldrichA9528-100MGUsado para perfuração de patch / célula
Misturador de vórtice analógicoVWR58816-121
Ácido aspárticoSigma-AldrichA9006Solução de pipeta intracelular
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA7906DS
CaCl2Sigma-AldrichC1016Solução extracelular e SD
Vidro CapilarSutterBF150-110-7.5Capilar para preparação de eléctrodos de remendo puxados
Hidrato de hidróxido de césioSigma-AldrichC8518Solução de pipeta intracelular
O software Clampex ver. 10 inclui programas de aquisição de dados (Clampex) e de análise (Clampfit)Axon Instruments/ Molecular DevicespCLAMP-10Software comercial e parte da configuração do equipamento patch-clamp
Colagenase tipo 2Worthington Biochemical CorporationLS004177DS-C
CsClSigma-Aldrich203025Soluções extracelulares e intracelulares
Cera dentalMiltex Dental Wax Technologies, Inc.
Termômetro Digital 18058351 com SondaFisher Scientific15-077-32Colocado em banho de tecido para monitorar a temperatura
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Solvente
DL-Ditiotreitol (DDT)Sigma-AldrichD9779Agentes redutores usados em conjunto com Papaína
EGTASigma-AldrichE3889Quelante Ca2+, utilizado em solução de pipeta intracelular
Extrator de micropipetas flamejante/castanhoSutterP-97Necessário para puxar eléctrodos com pontas muito finas
Suporte/suporte para tubos de espuma flutuanteVWR Scientific82017-634Utilizado para segurar tubos com enzimas para controlo de temperatura
GlicoseSigmaG8270
Ácido glutâmico (sal Na)Sigma-AldrichG1626DS
HEPESSigma-AldrichH3375Tampão de pH
KClFisher ScientificBP366-1Solução extracelular
Sistema de aquisição de dados de baixo ruídoAxon Instruments/ Molecular DevicesDigidata 1440AParte da configuração do equipamento patch-clamp
Agitador magnéticoVWR01-442-684
MgCl2 (hexahidratado)Sigma-AldrichM2670Soluções extracelulares e intracelulares
MicroForgeNarishigeMF-830Usado para eletrodos de polimento a fogo
NaClSigma-AldrichS7653Soluções extracelulares e intracelulares
NaOHSigma-AldrichS8045
NifedipinaSigma-AldrichN7634Canal de Ca2+ dependente de voltagem tipo L bloqueador
Microscópio invertido Nikon, TS100 com platina T1-SM com objetivas de 5x, 10x, 20x e 40xNikonDescontinuadoParte da configuração do equipamento Patch-clamp
Agulha de seringa não metálica, MicroFilWPIMF-34G-5Enchimento de solução de pipeta intracelular
PapainWorthington Biochemical CorporationLS003126DS-P
Pipeta PasteurFisherBrand13-678-20AAs pontas são quebradas e polidas a fogo e usadas para titulação de tecidos tratados enzimaticamente para liberar células DSM únicas de peças
Amplificador Patch-clampAxon Instruments/ Molecular DevicesAxon Axopatch 200BParte da configuração do equipamento patch-clamp
Computador PCDELLConfiguração personalizadaParte da configuração do equipamento patch-clamp
Medidor de pH AsperaInstrumentsPH700
Tubo de polietilenoIntramedic427-436Tubo para superfusão de banho extracelular conectado à câmara de gravação com fundo de vidro
Cloreto de tetraetilamônioSigma-AldrichT2265Bloqueador de canais iônicos de canais Kv e BK adicionados à solução de banho extracelular
Thermo Scientific Precision banho-maria agitado (modelo 2870)Thermo ScientificDescontinuadoBanho-maria para controle de temperatura da digestão enzimática empregado como alternativa à configuração do banho de circulação da câmara de tecido Banho de
tecido, 100 mLRadnoti1583-101Conectado a um banho circulante e cheio de água, tubos com peças DS e DSM são colocados na configuração para controlar a temperatura das etapas de digestão
Tubo de vinilColePalmer06405-3Usos múltiplos, incluindo para conectar o banho de tecido ao banho-maria circulante
Banho circulador de água, Haake D1 LHaakeDescontinuadoConectado ao banho de tecido
Balança de ponderaçãoMettler ToledoXS64
ZeissAxiovert 40C microscópio invertido com objetivas de 10x e 40xCarl-ZeissDescontinuadoParte da configuração do equipamento de fixação de remendo

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