Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.
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Artigo de método
Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Investigações de fatores que influenciam a divisão celular e a forma celular em bactérias são comumente realizadas em conjunto com a microscopia de fluorescência de alta resolução, já que observações feitas em nível populacional podem não refletir verdadeiramente o que ocorre em um único nível celular. A microscopia de lapso de tempo de células vivas permite que os investigadores monitorem as mudanças na divisão celular ou na morfologia celular que fornecem insights valiosos sobre a localização subcelular de proteínas e o momento da expressão gênica, como acontece, para potencialmente ajudar a responder a importantes questões biológicas. Aqui, descrevemos nosso protocolo para monitorar mudanças phenotípicas em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus usando um microscópio de deconvolução de alta resolução. O objetivo deste relatório é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser adotado por outros investigadores interessados em realizar experimentos de microscopia de fluorescência para estudar diferentes processos biológicos em bactérias, bem como outros organismos.
Introdução
O campo da biologia celular bacteriana tem sido significativamente reforçada pelos avanços recentes em técnicas de microscopia1,2. Entre outros instrumentos, microscópios capazes de realizar experimentos de microscopia fluorescência de lapso de tempo continuam a ser uma ferramenta valiosa. Os investigadores podem monitorar vários eventos fisiológicos em tempo real usando proteínas fluorescentes, como, fusãos transcricionais e de repórter translacional baseadas em GFP (GFP), d-aminoácidos fluorescentes (FDAA)3,ou usar outras manchas para rotular a parede celular, membrana e DNA. Portanto....
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Protocolo
1. Condições gerais de crescimento
- Inocular 2 mL de médio de crescimento adequado complementado com antibióticos (quando necessário) com uma única colônia da cepa (s) para ser imagem. Incubar essas culturas de sementes durante a noite a 22 °C em uma incubadora tremendo.
NOTA: As condições específicas de crescimento bacteriano utilizadas neste artigo são fornecidas na seção de resultados representativos. - Diluir culturas durante a noite 1:20 em novos meios de comunicação em um frasco de 125 mL, suplemento com antibióticos (quando necessário).
- Crescer a cultura (s) em 37 °C em uma incubadora tremendo até meados da fase logarítica (OD....
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Resultados
Fenótipos gpsb
Anteriormente, mostramos que o Sa-GpsB é uma proteína essencial, pois o esgotamento do GpsB usando um RNA antisenso resulta em lysiscelular 9. Aqui descrevemos como o surgimento de vários fenótipos de divisão celular e mudanças na localização de proteínas poderiam ser capturados usando o protocolo de microscopia timelapse descrito neste artigo. Para este fim, S. aureus cepas RB143 [SH1000 abrigando pEPSA5 (vetor vazio)] e GGS8 [SH1000 abrigando pGG59 (
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Discussão
A microscopia permaneceu um pilar nos estudos relativos a organismos microbianos. Dado o tamanho das células em escala de mícron, estudos de nível unicelular têm tradicionalmente invocado microscopia eletrônica (EM). Embora em tornou-se uma técnica bastante poderosa nos últimos anos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas, além de acesso limitado ao usuário16. Melhorias nas técnicas de microscopia de fluorescência e desenvolvimento de diferentes sondas fluorescentes, como a FDAA
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos aos nossos membros do laboratório por seus comentários sobre este artigo. Este trabalho foi financiado por uma concessão start-up da Universidade do Sul da Flórida (PE).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 Grau de | Biologia Molecular - Baixo EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopia |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopia |
| Prato de fundo de vidro | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopia |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Sem dioxano |
| Microscópio | GE | DeltaVision Elite | Personalizado Olympus IX-71 Suporte de Microscópio Invertido; Torre de iluminação personalizada e módulo iluminador de luz transmitida. Objetivas: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); ÓLEO OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski para 100X Objective; Câmera CoolSnap HQ2; Montagem SSI 7 cores; Câmara de controle ambiental - opaca. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | Inibidor de FtsZ |
| SoftWorx | GE | Software de imagem fornecido pelo fabricante |
Referências
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
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Reimpressões e permissões
