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Artigo de método

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

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DOI:

10.3791/59905

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23 de novembro de 2019

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, University of South Florida

Neste artigo

Resumo

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Resumo

Investigações de fatores que influenciam a divisão celular e a forma celular em bactérias são comumente realizadas em conjunto com a microscopia de fluorescência de alta resolução, já que observações feitas em nível populacional podem não refletir verdadeiramente o que ocorre em um único nível celular. A microscopia de lapso de tempo de células vivas permite que os investigadores monitorem as mudanças na divisão celular ou na morfologia celular que fornecem insights valiosos sobre a localização subcelular de proteínas e o momento da expressão gênica, como acontece, para potencialmente ajudar a responder a importantes questões biológicas. Aqui, descrevemos nosso protocolo para monitorar mudanças phenotípicas em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus usando um microscópio de deconvolução de alta resolução. O objetivo deste relatório é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser adotado por outros investigadores interessados em realizar experimentos de microscopia de fluorescência para estudar diferentes processos biológicos em bactérias, bem como outros organismos.

Introdução

O campo da biologia celular bacteriana tem sido significativamente reforçada pelos avanços recentes em técnicas de microscopia1,2. Entre outros instrumentos, microscópios capazes de realizar experimentos de microscopia fluorescência de lapso de tempo continuam a ser uma ferramenta valiosa. Os investigadores podem monitorar vários eventos fisiológicos em tempo real usando proteínas fluorescentes, como, fusãos transcricionais e de repórter translacional baseadas em GFP (GFP), d-aminoácidos fluorescentes (FDAA)3,ou usar outras manchas para rotular a parede celular, membrana e DNA. Portanto, não é nenhuma surpresa que a microscopia de fluorescência permaneça popular entre os biólogos de células microbianas. Além de simplesmente mostrar os fenótipos finais, fornecer informações sobre como os fenótipos observados surgem usando microscopia timelapse poderia agregar valor significativo aos resultados e, potencialmente, oferecer pistas sobre o que os processos celulares estão sendo alvo de potenciais candidatos a medicamentos4.

Os protocolos para realizar imagens de alta resolução usando um microscópio de fluorescência totalmente motorizado, invertido e de amplo campo (ver a Tabela de Materiais)são fornecidos neste artigo. Esses protocolos poderiam ser adaptados para atender às necessidades de outros microscópios de fluorescência que são capazes de realizar microscopia timelapse. Embora o software discutido aqui corresponda ao software específico fornecido pelo fabricante, conforme indicado na Tabela de Materiais, software comumente fornecido por outros fabricantes de microscópio ou o ImageJ5livremente disponível, têm ferramentas equivalentes para analisar dados de microscopia. Para condições em que o timelapse não é propício, experimentos de curso de tempo podem ser conduzidos conforme descrito neste artigo. Os protocolos descritos aqui fornecem um guia detalhado para estudar as mudanças phenotípicas em duas espécies bacterianas diferentes: B. subtilis e S. aureus. Veja a Tabela 1 para cepas usadas.

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Protocolo

1. Condições gerais de crescimento

  1. Inocular 2 mL de médio de crescimento adequado complementado com antibióticos (quando necessário) com uma única colônia da cepa (s) para ser imagem. Incubar essas culturas de sementes durante a noite a 22 °C em uma incubadora tremendo.
    NOTA: As condições específicas de crescimento bacteriano utilizadas neste artigo são fornecidas na seção de resultados representativos.
  2. Diluir culturas durante a noite 1:20 em novos meios de comunicação em um frasco de 125 mL, suplemento com antibióticos (quando necessário).
  3. Crescer a cultura (s) em 37 °C em uma incubadora tremendo até meados da fase logarítica (OD600 = 0,5).
    NOTA: O indutor ou o inibidor poderiam ser adicionados diretamente à cultura crescente (s) na fase apropriada do crescimento.
  4. Células de colheita em condições de cultura desejadas para a preparação da amostra de microscopia, conforme descrito na seção a seguir.

2. Preparação da amostra

  1. Prepare 1% agarose combinando 0.25g da classe da biologia molecular, do baixo EEO, agarose com os 25 mL do meio do crescimento suplementados com os antibióticos apropriados (onde necessário) para a microscopia do timelapse ou a água estéril. Aqueça a mistura com a ajuda de um microondas por aproximadamente 30 s e despeje-o em um estéril 100 mm x 15 milímetros placa de Petri e deixá-lo solidificar.
  2. Tome um alibamento de 5-50 μL da cultura celular, dependendo da necessidade e manchar as células. Células de mancha com corantes apropriados nesta fase (por exemplo, adicionar corante fluorescente FM4-64 (mancha de membrana) para um experimento (Figura 1)).
    1. Pipette um aliba de 5 μL da amostra de cultura ou amostra manchada a ser imagemna parte inferior de um prato de cultura de 35 mm de vidro inferior (com 14 mm de diâmetro de micropoço e coverslip nº 1.5 não revestido; veja a Tabela de Materiais).
      CUIDADO: Não use poli-L-lisina revestido coverslips especialmente para microscopia timelapse como eles poderiam induzir padrão de crescimento diferente (temos observado isso com poli-D-lisina também; dados não mostrados) e / ou afetar a dinâmica da proteína6.
    2. Para minimizar o uso de corantes, mancha suspensão celular de 3-4 μL (colhida em OD600 = 0,5; aproximadamente 2,7 x 107 e 3,4 x 107 para B. subtilis e S. aureus respectivamente por cultura de 1 mL) diretamente no prato inferior de vidro.
    3. Coloque uma laje de agarose pré-cortada (11 mm de diâmetro ou de qualquer tamanho desejado para se sobrepor à área do deslizamento de terra; corte usando a extremidade aberta de um tubo estéril ou uma lâmina de barbear) em cima da amostra e toque suavemente para se certificar de que a laje de agarose está deitada contra o coverslip.
  3. Posterior à imagem (ver a seção seguinte), se o número de células no campo de visão não for desejável, ajuste a densidade celular da amostra por meio de diluição ou concentração por centrifugação e altere a proporção de células na amostra usando o crescimento médio/tampão conforme necessário.
    NOTA: Para minimizar a autofluorescência que emana do meio de cultura, as células podem ser lavadas em tampão (por exemplo, na sorino tampão de fosfato padrão 1x) e resuspensas em quantidade adequada de buffer antes da imagem. É possível que nesta etapa células menores ou vesículas não podem ser mantidos após a centrífuga e, portanto, ser perdido.
  4. Adicione a água usando uma pipeta (~5 μL gotas) ao espaço dentro do prato da cultura (em torno do coverslip) para impedir que a almofada do agarose seque, e para ajudar a manter a umidade durante a aquisição da imagem, especial para experiências do timelapse.
  5. Permita que os pratos de cultura equilibrem-se à temperatura dentro da câmara de incubação, um compartimento opaco embutido fornecido pelo fabricante, do microscópio por 15-20 min.
    NOTA: Ligue o elemento de aquecimento e definir a câmara de incubação para uma temperatura desejada várias horas antes da imagem. Isso garantirá que o hardware se estabilize à nova temperatura. Para imagens de timelapse prolongadas, coloque um copo ou frasco com água dentro da câmara do microscópio, longe da área de trabalho, para manter a umidade.

3. Imagem

  1. No dia do experimento, ligue o sistema de microscópio. Inicie o software de imagem (ver Tabela de Materiais)clicando no ícone apropriado na área de trabalho. Inicialmente inicialize o microscópio clicando na opção Inicialize Microscópio (botão retratado com um microscópio sobre ele) na caixa de diálogo inicial do software. Certifique-se de que o objetivo seja totalmente reduzido usando o ajuste grosseiro do microscópio antes da inicialização.
    NOTA: Após a inicialização, três caixas de diálogo adicionais devem aparecer além do menu inicial: resolve3D, coleta de dados e monitor de filtro.
  2. Coloque uma queda de 1.517 (índice refrativo) de óleo no objetivo de imersão de óleo 100x fornecido pelo fabricante (Aperture Numerical = 1,4, Distância de Trabalho = 0,12 mm; ver Tabela de Materiais).
    NOTA: É importante escolher o óleo apropriado da imersão para a temperatura em que a imagem latente é conduzida.
  3. Carregue o prato inferior de vidro contendo amostra na carcaça do metal (caixão) e deslize delicadamente na braçadeira do estágio.
  4. Use o botão de ajuste grosseiro para elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o fundo de vidro do prato. Use a parte do olho e o botão fino do ajuste para trazer a amostra no foco. Uma vez que as células estão em foco vire o botão do pedaço do olho para o modo da câmera, movendo o interruptor seletor localizado na frente do corpo do microscópio para a esquerda.
  5. Comece a experimentar usando o software de imagem. Na janela resolve3D, selecione o ícone da experiência do projeto/funcionamento descrito por uma garrafa. Uma nova caixa de diálogo deve aparecer intitulada experiência de design/execução.
    1. Defina o número de z-pilhas e espessura da amostra usando o projeto e, em seguida, a guia de secção sobre o projeto / executar a caixa de diálogo experimento.
      NOTA: Para os experimentos na seção de resultados representativos, foram utilizadas 17 pilhas z a 200 nm para imagens estáticas e quatro pilhas Z a um intervalo de 200 nm para microscopia de timelapse.
    2. Para medir a espessura das células da amostra, ajuste manualmente o plano Z incrementalmente usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo resolve3D. Marque onde as células ficam fora de foco como o limite superior e inferior para a aquisição de imagem. Importe essas informações antes de executar o experimento.
    3. Para ajudar a minimizar a fototoxicidade e o fotobranqueamento durante a imagem de timelapse, reduza o número de pilhas Z e escolha o plano médio das células para aquisição de imagem.
  6. Selecione o conjunto de filtro apropriado para o experimento usando o projeto e, em seguida, canaliza a aba na caixa de diálogo de experimentos de design/execução (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
    1. Além disso, selecione uma referência para a coleta de informações POL/DIC. Ajuste a transmissão percentual (intensidade de luz) e a duração da exposição para canais individuais selecionados antes da imagem, selecionando as opções apropriadas na caixa de diálogo resolve3D.
      NOTA: Em um campo de visão de teste que não é considerado para o teste do experimento, essas configurações para identificar se os parâmetros selecionados obtêm dados significativos de fluorescência sem perder sinal fraco ou supersá-los. Em seguida, importe esses parâmetros para a configuração experimental.
  7. Abra a lista de pontos selecionando o botão de lista pontos na caixa de diálogo resolve3D. Uma nova caixa de diálogo deve aparecer na lista de pontos. Marque vários campos de vista para serem usados no experimento encontrando campos de visão apropriados usando os controles de estágio do microscópio e selecionando a opção de ponto de marca na caixa de diálogo da lista de pontos.
    NOTA: Um ponto de substituição terá que ser selecionado cada vez que o microscópio é redirecionado em um ponto na lista de pontos. Isso pode ser feito concentrando o microscópio no ponto apropriado na lista e, em seguida, selecionando o botão de ponto de substituição. É importante não tocar no botão de ajuste grosseiro/fino analógico ao reorientar; use apenas o software para ajustar o foco.
  8. Defina parâmetros de timelapse selecionando primeiro o design e, em seguida, a guia timelapse na caixa de diálogo de experimentos de design/execução. Selecione a caixa de seleção de timelapse. Digite os parâmetros de lapso de tempo apropriados em termos de imagens timelapse / tempo total.
  9. Definir pontos a serem imageados a partir da lista de pontos, selecionando primeiro o design e, em seguida, os pontos de guia sobre o design / executar experiência dialogar. Selecione a opção de lista de pontos de visita e digite pontos para serem imagemdos na caixa de texto separados por commas ou hífens se for uma sequência completa.
  10. Antes de iniciar um experimento, eite nomes de arquivos e locais de arquivo usando a guia de execução na caixa de diálogo de design/execução. A localização do arquivo pode ser alterada selecionando o botão de configurações, selecionando a pasta de dados e, em seguida, selecionando a pasta apropriada ou criando uma nova. Alterar os nomes dos arquivos, inserindo o novo nome do arquivo na caixa de texto do nome do arquivo de imagem.
  11. Comece o experimento selecionando o botão de reprodução na caixa de diálogo do experimento começar.
    NOTA: Para timelapse, verifique continuamente o foco em cada campo de visão ao longo do experimento usando configuração DIC (para evitar fotobranqueamento desnecessário) e reorientar e atualizar as informações na lista de pontos como as células tendem a sair de foco ao longo do tempo.

4. Processamento de imagem

  1. Abra os arquivos de imagem brutos (R3D) desejados para geração de números.
    NOTA: Arquivos recentemente salvos podem ser localizados usando o botão de pasta de dados na caixa de diálogo inicial do software de imagem.
  2. Executar o programa de desconvolução, para remover fora de foco fluorescência luz7,8, a fim de produzir um arquivo de imagem D3D desconvolved. Selecione a guia de processo na caixa de diálogo inicial e, em seguida, selecione desconvolve. Uma nova caixa de diálogo aparecerá intitulada deconvolve.
    1. Defina os parâmetros de desconvolturação arrastando o número de imagem apropriado (localizado no canto superior esquerdo de cada arquivo de imagem) para a entrada na caixa de diálogo de deconvolução. Na caixa de diálogo de desconvolução, selecione o botão mais opções e desselecione o rolloff de fronteira de culturas após o processamento da caixa de verificação (caso contrário, as imagens não podem ser sobrepostas sobre o arquivo DIC correspondente).
    2. Clique no botão faça-o na caixa de diálogo de desconvolução para desconvolve arquivo de imagem crua.
      NOTA: Os parâmetros de desconvoltura poderiam ser ajustados conforme indicado pelo manual de orientação do fabricante de software para os resultados desejados.
  3. Se necessário, realize subtração manual de ruído de fundo e ajuste de brilho/contraste em qualquer ou qualquer canal de comprimento de onda (cor). Faça isso selecionando o botão de ajuste de contraste no arquivo de imagem desconvolved.
  4. Salve a imagem como um arquivo TIFF selecionando primeiro a opção de arquivo na parte superior da caixa de diálogo D3D. Em seguida, selecione salvar como TIFF, identificar e selecionar as pilhas Z apropriadas (que estão dentro do foco), selecione ou desselecione os conjuntos de filtro desejados.
  5. Realize a quantificação de dados usando qualquer software fornecido pelo fabricante ou programas disponíveis gratuitamente, como o ImageJ5.
    1. Para quantificação do tamanho da célula clique na guia da ferramenta no arquivo de imagem D3D apropriado e, em seguida, selecione a opção de distâncias de medida. Medir distâncias selecionando pontos de partida e final no arquivo de imagem desejado usando o mouse através de cliques esquerdos.
      NOTA: É melhor ampliar a imagem durante a quantificação do tamanho celular.
    2. Para quantificação do sinal de fluorescência use a opção de inspetor de dados a guia de ferramentas no arquivo de imagem D3D apropriado.
      NOTA: É melhor ampliar a imagem e ter apenas filtros relevantes selecionados ao completar a quantificação do sinal de fluorescência.
    3. Para quantificar o sinal de fluorescência, desenhe uma caixa com opção de coluna/linha definida como dimensão específica. Selecione uma área com sinal para ser quantificado e registre o valor. Medir o sinal de fundo usando a caixa do mesmo tamanho para selecionar uma área imediatamente fora das células. Subtraia o valor de fundo do valor registrado a partir do sinal de fluorescência obtido dentro da célula.

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Resultados

Fenótipos gpsb
Anteriormente, mostramos que o Sa-GpsB é uma proteína essencial, pois o esgotamento do GpsB usando um RNA antisenso resulta em lysiscelular 9. Aqui descrevemos como o surgimento de vários fenótipos de divisão celular e mudanças na localização de proteínas poderiam ser capturados usando o protocolo de microscopia timelapse descrito neste artigo. Para este fim, S. aureus cepas RB143 [SH1000 abrigando pEPSA5 (vetor vazio)] e GGS8 [SH1000 abrigando pGG59 (

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Discussão

A microscopia permaneceu um pilar nos estudos relativos a organismos microbianos. Dado o tamanho das células em escala de mícron, estudos de nível unicelular têm tradicionalmente invocado microscopia eletrônica (EM). Embora em tornou-se uma técnica bastante poderosa nos últimos anos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas, além de acesso limitado ao usuário16. Melhorias nas técnicas de microscopia de fluorescência e desenvolvimento de diferentes sondas fluorescentes, como a FDAA

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos nossos membros do laboratório por seus comentários sobre este artigo. Este trabalho foi financiado por uma concessão start-up da Universidade do Sul da Flórida (PE).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseFisher BioReagentsBP160-100 Grau deBiologia Molecular - Baixo EEO
DAPIInvitrogenD3571Microscopia
FM4-64InvitrogenT3166Microscopia
Prato de fundo de vidroMatTekP35G-1.5-14-CMicroscopia
IPTGFisher BioReagentsBP1755-10Sem dioxano
MicroscópioGEDeltaVision ElitePersonalizado Olympus IX-71 Suporte de Microscópio Invertido; Torre de iluminação personalizada e módulo iluminador de luz transmitida. Objetivas: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); ÓLEO OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski para 100X Objective; Câmera CoolSnap HQ2; Montagem SSI 7 cores; Câmara de controle ambiental - opaca.
PC190723MilliporeSigma3445805MGInibidor de FtsZ
SoftWorxGESoftware de imagem fornecido pelo fabricante

Referências

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