En murine cellelinje baseret model af kronisk CDK9 hæmning at studere udbredte ikke-genetiske Transkriptional forlængelse defekter (TE^absolut) i kræft

Summary

Protokollen beskriver en in vitro-murine karcinom model af ikke-genetisk defekt transkriptionsforlængelse. Her bruges kronisk hæmning af CDK9 til at undertrykke produktiv forlængelse af RNA pol II langs pro-inflammatoriske respons gener til at efterligne og studere den klinisk overserverede TE^absolut fænomen, til stede i omkring 20% af alle kræfttyper.

Abstract

Vi har tidligere rapporteret, at en delmængde af kræft er defineret af globale transkriptionelle dereguleringer med udbredte mangler i mRNA transkriptionen forlængelse (TE)-vi kalder sådanne kræftformer som TE^absolut. Især, TE^absolut kræft er karakteriseret ved falsk transkriptionen og defekt mRNA behandling i et stort sæt af gener, såsom INTERFERON/Jak/stat og TNF/NF-κb veje, fører til deres undertrykkelse. TE^absolut under type af tumorer i renal celle karcinom og metastaserende melanompatienter signifikant korrelerer med dårlig respons og udfald i immunterapi_. I betragtning af vigtigheden af at undersøge TE^absolut kræft-da det porerer en betydelig vejspærring mod immunterapi-målet med denne protokol er at etablere en in vitro te^{helt sikkert} musemodel til at studere disse udbredte, ikke-genetiske transkriptionelle abnormiteter i kræft og få ny indsigt, nye anvendelser for eksisterende lægemidler, eller finde nye strategier mod sådanne kræftformer. Vi detaljer brugen af kronisk flavopiridol medieret CDK9 hæmning til ABRO fosforylering af Serin 2 rester på C-Terminal REPEAT domæne (CTD) af RNA polymerase II (RNA pol II), undertrykke frigivelsen af RNA pol II i produktive transkriptionen forlængelse. I betragtning af at TE^absolut kræft ikke er klassificeret under nogen specifik somatisk mutation, en farmakologisk model er fordelagtig, og bedst efterligner de udbredte transkriptional og epigenetiske defekter observeret i dem. Brugen af en optimeret subletale dosis af flavopiridol er den eneste effektive strategi i at skabe en generaliserbar model af ikke-genetisk udbredt forstyrrelse i transkriptionsforlængelse og mRNA-behandlings defekter, tæt efterligne den klinisk observerede te ^{helt sikkert} egenskaber. Derfor kan denne model af TE^{helt sikkert} udnyttes til dissekere, celle-autonome faktorer, der gør dem i stand til at modstå immunmedierede celle angreb.

Introduction

Et centralt sats begrænsende trin i ekspression af næsten alle aktive gener er overgangen af RNA-polymerase II (RNA pol II) fra promotor-proximal pauser til produktiv forlængelse^1,2. I betragtning af, at epigenetiske dysregulering af transkriptional forlængelse hjælper i progression af flere humane maligniteter defineret som TE^afgjort, hvilket fører til suboptimal signalering i de pro-inflammatoriske respons veje svarende til en dårlig respons og resultat til immunterapi³, er det overordnede mål med denne protokol at etablere en nyttig in vitro-model til at studere disse udbredte ikke-genetiske transkriptionelle abnormiteter i kræft. I lyset heraf er brugen af kronisk farmakologisk hæmning af CDK9 en effektiv strategi for at skabe en generaliserbar model for ikke-genetisk udbredte forstyrrelser i transkriptionsforlængelsen og mRNA-behandlings defekter. Rationalet bag brugen af kronisk CDK9 hæmning er, at det ophæver fosforylering af Serin 2-rester på C-terminalens gentagelses domæne (CTD) af RNA pol II og dermed undertrykker frigivelsen af RNA pol II til produktiv transskription forlængelse. Også, TE^afgjort kræft, beskrevet tidligere af vores gruppe³, er ikke klassificeret under nogen specifik somatisk mutation. Derfor er en ikke-genetisk (farmakologisk) model er fordelagtig og bedst efterligner de udbredte transkriptionelle og epigenetiske defekter observeret i dem. Metoden heri beskriver generering og karakterisering af kronisk flavopiridol behandling model af murine cancerceller. Denne metode forstyrrer påviseligt transskription forlængelse langs gener karakteriseret ved længere genomisk længder, med klar promotorer og inducerbare udtryk såsom TNF/NF-κb og interferon/stat signalering, dybt kontrolleret på niveau med transkriptionsforlængelse^3,4,5. Samlet set denne optimerede murine cellelinje model af transkriptional forlængelse fejl-den eneste model til vores viden til at studere den nyligt beskrevne TE^absolut tumorer-drev resistens over for anti-tumor immun angreb, hvilket gør et nyttigt system til at udnytte og undersøge sårbarheden af ikke-genetiske defekter i kernen transskription maskiner i kræft i forhold til immunmedierede celle angreb.

Protocol

Udvalget for institutionel dyreomsorg og-anvendelse og det institutionelle udvalg for Biosikkerhed i Cincinnati children's Research Foundation godkendte alle forsøgsprocedurer for dyr (IACUC-protokollen #2017-0061 og IBC-protokollen #IBC2016-0016), og disse eksperimenter blev udført i overensstemmelse med standarder som beskrevet i NIH guide til pleje og brug af forsøgsdyr.

1. kronisk hæmning af RNA pol II ved flavopiridol behandling — grundlæggende strategi

1. Frø B16/F10 mus melanom celler i lav densitet (0,2 x 10⁶) i en 10 cm kultur plade i deres tilsvarende medium (Dulbecco's modificerede Eagle medium [DMEM], 10% føtal kvægserum [FBS], 1% penicillin og streptomycin [pen/STREP]) og Inkubér natten over i en 37 °C, 5% CO₂ befuret inkubator.
2. Efter dag vaskes cellerne med 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS), og der tilsættes et nyt parti af kultur medier med en subletale-dosis (anslået til 25 nm) af flavopiridol — en hæmmer af RNA pol II-afløbs faktoren p-tefb (cyclin T/CDK9) — i en uge uden yderligere sub-culturing.
3. Efter en uge med flavopiridol behandling, udføre bekræftende assays at evaluere modellens evne til at rekapitulere forskellige attributter af transkriptionelle forlængelse defekter set i TE^absolut kræft.

2. bekræftende immun assay til vurdering af defekt RNA pol II funktion og svækkelse af interferon (IFN) pathway og tumor nekrose faktor (TNF) pathway signalering af i den genererede mus te^{helt sikkert} model

1. Kultur lige antal (10⁵) af flavopiridol behandlet B16/F10 mus melanom celler og forældre B16/F10 mus melanom celler i to forskellige sæt af 12 brønd plader (et sæt til RNA pol II funktionel karakterisering og det andet sæt til cytokin stimulation) ved 37 °C i en 5% CO₂ -befuret inkubator natten over.
2. Næste dag, behandle cellerne i cytokin stimulation sæt med mus IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL), eller TNF-α (5 ng/mL) for 45 min ved 37 °C.
3. Nu ekstrahere protein fra celler i både cytokin og RNA pol II funktionelle karakteriserings sæt ved hjælp af en fulgt assay (Ripa) lyse buffer på følgende måde:
   1. Vask cellerne med 1x PBS og lyse det med 50 μL af lysis buffer per brønd. Skrabe, og derefter pellet de lyserede celler ved 4 °C, 21.130 x g.
   2. Måle proteinet i celle lysat supernatanter ved hjælp af en standard kolorimetrisk analyse for proteinkoncentration efter opløsning af rengøringsmiddel (Bradford eller en lignende analyse).
4. Der belastes samme mængde målt protein (15 μg) fra hver prøve for at køre i en 4% − 18% natriumdodecyl sulfat (SDS) polyacrylamidgel og overføre dem til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner.
5. PVDF-membranerne blokeres i 5% tør mælk i Tris-bufferet saltvand − Polysorbat 20 (TBST) i 1 time efterfulgt af en inkubation natten over ved 4 °C med primære antistoffer (RNA pol II 1:1000; p-SER2 RNA pol II 1:1000; p-SER5 RNA pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; i alt H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-actin 1:5000) i 5% bovint serumalbumin.
6. Efter dag vaskes PVDF-membranerne med 1x TBST i 15 min ved stuetemperatur (RT) og Inkuber dem med passende sekundære antistoffer (anti-rat [1:5000] for RNA pol II, p-SER2 RNA pol II og p-SER5 RNA pol II; anti-kanin (1:5000) for H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NFκB og p-NFκB) i 50 min ved RT. detektér protein signalerne ved hjælp af kommercielt tilgængeligt peberrod-peroxidase (HRP)-substrat med forbedret kemiluminescens.
   Bemærk: β-actin primær brugt er HRP-konjugeret, derfor kan det udvikles uden en sekundær.

3. bekræftende analyse til vurdering af mRNA-behandlings defekter i den genererede mus TE^{helt sikkert} model

1. Frø lige antal (0,2 x 10⁶) af flavopiridol behandlet B16/F10 mus melanom celler og forældre B16/F10 mus melanom celler i 6-brønd plader ved 37 °c i en 5% Co₂ befuret inkubator natten over.
2. Udtræk total RNA fra de dyrkede celler ved 60% konfluency ved hjælp af et RNA-ekstraktions reagens eller-Kit (tabel over materialer).
3. Nedbryder rRNA fra det totale ekstraherede RNA på følgende måde:
   Bemærk: en low-input-protokol er blevet tilvalgt fra et kommercielt tilgængeligt sæt til at nedbryder rRNA
   1. Sæt et vandbad eller en varmeblok til 70 − 75 °C og et andet vandbad eller en varmeblok ved 37 °C.
   2. Det totale RNA (100 − 500 ng i 2 μL nuklease frit vand) tilsættes med 1 μL selektiv rRNA-udtynding og 30 μL hybridiserings buffer i et mikrocentrifuge glas, blandes forsigtigt ved vortexning og Inkuber dem ved 70 − 75 °C i 5 minutter.
   3. Nu overføres rørene til en 37 °C vand bad/varmeblok, og lad Prøven afkøles til 37 °C over en periode på 30 min.
   4. Resuspension af den selektive rRNA-nedbrydende sonde magnetiske perler ved vortexing og alikvot 75 μL af perler i et 1,5 mL RNase-frit mikrocentrifuge glas.
   5. Anbring vulst ophænget på en magnetisk separator i 1 min. Lad perlerne bosætte sig. Forsigtigt Aspirér og kassér supernatanten. Gentag vask perlerne igen ved at tilsætte 75 μL nuklease frit vand og kassere supernatanten efter magnetisk adskillelse.
   6. De vaskede perler opslæmmes i 75 μl hybridiserings buffer og alikvot 25 μl af den til et andet rør, og den fastholdes ved 37 °c til senere brug.
   7. De resterende 50 μL perler placeres på en magnetisk separator i 1 min., og supernatanten kasseres. Resuspension af perlerne i 20 μL hybridiserings buffer og vedligehold den ved 37 °C til senere brug.
   8. Efter afkøling af RNA/selektiv rRNA depletering Probe blandingen til 37 °C i 30 min, centrifugeres kortvarigt røret for at samleprøven til bunden af røret.
   9. Overfør 33 μL RNA/selektiv rRNA-udtynding af sonde blandingen til de forberedte magnetiske perler fra trin 3.3.7. Bland med lav hastighed vortexing.
   10. Slangen inkubates ved 37 °C i 15 minutter. Under inkubationen, bland forsigtigt indholdet lejlighedsvis. Efterfulgt af kort centrifugering for at indsamle prøven til bunden af røret.
   11. Anbring røret på en magnetisk separator i 1 minut for at pille rRNA-Probe-komplekset. Denne gang ikke kassere supernatanten. Supernatanten indeholder rRNA-depleteret RNA.
   12. Sæt røret på 25 μL perler fra trin 3.3.6 på en magnetisk separator i 1 min. Aspirér og kassér supernatanten. Tilsæt supernatanten fra trin 3.3.11 til det nye rør af perler. Bland med lav hastighed vortexing.
   13. Slangen inkubates ved 37 °C i 15 minutter. Under inkubationen, bland forsigtigt indholdet lejlighedsvis. Centrifugeglasset centrifugeres kortvarigt for at samleprøven til bunden af røret.
   14. Anbring røret på en magnetisk separator i 1 minut for at pille rRNA-Probe-komplekset. Du må ikke kassere supernatanten. Supernatanten (ca. 53 μL), der indeholder rRNA-depleteret RNA, overføres til et nyt rør.
   15. Mål koncentrationen af RNA-udbyttet med et spektrofotometer.
4. Brug den ene halvdel af de rRNA-depleterede prøver som input til magnetiske perler, der indeholder oligo (dT) 25 til at udtrække polyA⁺ RNA på følgende måde:
   Bemærk: denne protokol om isolering af polyA Tail Messenger RNA ved hjælp af oligo dT-sekvenser, der er bundet til overfladen af magnetiske perler, er blevet Co-valgt fra et kommercielt tilgængeligt Kit (tabel over materialer).
   1. Resuspendér oligo dT-perlerne i hætteglasset ved kortvarigt at vortexning for > 30 s og Overfør 200 μL oligo dT-perler til et rør. Tilføj den samme mængde (200 μL) bindings buffer, og gensuspender.
   2. Anbring røret i en magnet i 1 min. og kassér supernatanten. Nu, fjerne røret fra magneten og resuspendere de vaskede oligo dT perler i 100 μL bindende buffer.
   3. Juster lydstyrken af det samlede RNA-prøve input rRNA-depleteret til 100 μL med 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Nu tilsættes 100 μL bindings buffer.
   4. Varme til 65 °C i 2 minutter for at forstyrre sekundære RNA-strukturer. Nu, straks sted på isen.
   5. Tilsæt 200 μL total RNA til de 100 μL vaskede perler. Bland grundigt og Tillad binding ved at rotere kontinuerligt på en rotor i 5 minutter ved RT.
   6. Placer røret på magneten i 1-2 min og fjern forsigtigt alle supernatanten og fjern forsigtigt alle supernatanten.
   7. Fjern røret fra magneten, og tilsæt 200 μL vaske buffer.
5. Mål renheden og koncentrationen af det ekstraherede polyA⁺ RNA med et spektrofotometer.
   Bemærk: Et 260/280-forhold på 1.90 − 2,00 og et 260/230-forhold på 2,00 − 2.20 for alle RNA-prøver anses for at være acceptabelt.
6. Brug den resterende halvdel af de rRNA-depleterede prøver fra afsnit 3,3 som input til protein A kolonner (leveres i RNA immunopræcipitation [RIP] kit, tabel over materialer) til immunoprecipitate Femprimeret RNAs ved hjælp af monoklonal 7-methylguanosin antistof på følgende måde:
   Bemærk: denne protokol af isolerende m7G-udjævnet Messenger RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-immunopræcipitation-kit er blevet Co-valgt og yderligere modificeret.
   1. Vask proteinet en magnetisk perler opnået fra RIP kit i henhold til producentens protokol til pre-binde antistoffet til perlerne.
   2. Overføre 3 μg 7-methylguanosin-antistof (kanin-IgG i sættet kan anvendes den negative kontrol) til perlerne i et mikrocentrifuge glas suspenderet i 100 μL vaskebuffer fra sættet.
   3. Inkubér med lav hastigheds rotation i 30 minutter ved RT. centrifugerør kortvarigt, og Placer derefter rørene på en magnetisk separator, Fjern og kassér supernatanten.
   4. Fjern rørene, og tilsæt 500 μL vaskebuffer fra kittet og vortex kortvarigt. Centrifuger rørene kortvarigt efterfulgt af magnetisk adskillelse, Fjern og kassér supernatanten.
   5. Gentag trin 3.6.4 igen.
   6. Tilsæt ca. 120 ng rRNA-depleteret (fra afsnit 3,3) til de forvaskede 7-methylguanosin-antistof bundne perler. Tilsæt 1 μL Rnasehæmmer. Inkuber ved RT for 1 − 1,5 time med mild agitation.
   7. Drej perlerne ned ved 300 x g i 10 s, og Fjern supernatanten, der indeholder ikke-7-methylguanosin (ikke-7,5) mRNA, til et nyt mikrocentrifuge glas.
   8. Tilsæt 100 μL vaskebuffer og vask det to gange mere på samme måde. Den indsamlede supernatanten samles i det samme mikrocentrifugerør, som er mærket ikke-7-methylguanosin) mRNA. Opbevares på is.
   9. Elute det udjævnede (7-methylguanosin) mRNA fra perlerne med 300 μL urea lyse buffer (ULB) indeholdende 7 M urinstof, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA og 10 mM Tris, pH 7,5 ved opvarmning af perlerne ved 65 °C i 2 − 3 min.
   10. Bland 300 μL af de eluede prøver (loft og ikke-fastgjort mRNA) med 300 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1; kommercielt tilgængeligt) (opbevares ved 4 °C). Bland godt ved invertering og lad i ca 10 min derefter blandes igen forsigtigt.
   11. Centrifugeres ved 18.928 x g i 2 minutter og pipetten forsigtigt det øverste lag til frisk rør og kassér bundlaget.
   12. Der tilsættes 300 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol (25:24:1; opbevares ved 4 °C) på prøverne. Bland godt ved at invertere og derefter centrifugeres ved 18.928 x g i 1 min. forsigtigt, pipette det øverste lag til et friskt rør og kassér bundlaget.
   13. Tilsæt 300 μL 2-porpanol og 30 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) til det udjævnede og ikke-reducerede RNA. Vend prøven et par gange, og anbring den ved-20 °C i 20 timer.
   14. Nu centrifugeres prøverne ved 18.928 x g i 10 minutter ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten og tilsæt 500 μL 70% ethanol.
   15. Centrifugeres igen ved 18.928 x g i 10 minutter ved 4 °c. Kassér forsigtigt supernatanten og tør pellet på RT i mindre end 5 min. resuspension af pellet i nuklease frit vand.
7. Mål renhed og koncentration af RNA-udbyttet med et spektrofotometer. 260/280-forholdet skal være i intervallet 1.90 − 2,00 og 260/230-forholdet i intervallet 2,00 − 2.20 for alle RNA-prøver.

4. bekræftende analyse til vurdering af respons af mus TE^{helt sikkert} model til fasl medierede celledød

1. Frø lige antal (30.000 celler) af flavopiridol behandlet B16/F10 mus melanom celler og forældre B16/F10 mus melanom celler i en 96-brønd kultur plade i deres tilsvarende medium (DMEM), og Inkuber natten over i en 37 °C, 5% CO₂ befuret Inkubator.
2. Cellerne i en kultur hætte med forskellige koncentrationer af h_hans6fasl (0,1 − 1.000 ng/ml) behandles i nærværelse af 10 μg/ml anti-hans-antistoffer og Inkubér i 24 timer ved 37 °c, 5% Co₂ befuret inkubator.
3. Fjern døde celler ved at vaske med 1x PBS buffer. Fastgør de vedlagte celler i 4% PARAFORMALDEHYD i 20 minutter ved RT. kassér 4% PARAFORMALDEHYD (ingen grund til at vaske), og pletter med krystalviolet opløsning (20% methanol, 0,5% krystalviolet i 1x PBS) i 30 min.
4. Fjern overskydende pletter ved forsigtigt at skylle pladerne i ledningsvand. Hold pladerne tørre ved RT.
5. Krystalviolet opløses i 100 μL 1x nonionisk overfladeaktivt stof opløst i 1x PBS og måles i celletætheden ved at måle absorbansen ved 570 nm i en mikroplade læser.

5. sonderende analyse til vurdering af respons af mus TE^{helt sikkert} model til antigen specifikke cytotoksiske T-celle angreb

1. Isolering og aktivering af OT-I CD8 + cytotoksisk T-celle angreb (CTL)
   1. Purify CD8 + celler fra deres af OT-I TCR TG RAG-1 −/− mus ved magnetisk celleseparation ved hjælp af en mus CD8 T celle isolation kit som følger:
      1. Høst to deres fra to OT-I TCR TG RAG-1 −/− mus i komplette rpmi medier.
      2. Mash deres i et 70 μm filter holdes på et 50 ml rør fyldt med 20 ml rpmi, ved hjælp af bagsiden af en sprøjte indtil kun fedt er efterladt i filteret.
      3. Centrifugér gennemstrømningen ved 220 x g i 5 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten.
      4. Tilsæt 1 mL røde blodlegemer (RBC) lysis-buffer til milt pellet fra det foregående Centrifugerings trin, og afpipettér blandingen i 1 min.
      5. Neutraliser opløsningen ved at tilføje op til 10 mL RPMI.
      6. Centrifugeres ved 220 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres og resuspenderes i 10 mL RPMI.
      7. Tag en lille alikvot til optælling. Centrifuger de resterende ved 220 x g i 5 minutter ved 4 °c.
      8. For hver million celler tælles, resuspension pellet i 1 mL kommercielt tilgængelige magnetisk adskillelse system buffer (Mojo buffer eller en lignende buffer).
      9. Forbered en antistof cocktail af volumen 100 μL for hver 1 mL pelleteret celler i trin 5.1.1.8. Antistof cocktail omfatter: biotin anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ, og CD44.
      10. Tilsæt denne cocktail til de 1 mL pelleteret celler og holde på is i 15 min.
      11. Tilsæt 100 μl magnetisk (streptavidin) perler til hver 100 μl af antistof cocktail tilsættes til 1 ml resuspenderet foderpiller milt celler. Hold på is i 15 min.
      12. Der tilsættes 7 mL kommercielt tilgængelig magnetisk separations system buffer. Nu, alikvot ca 3 − 4 ml af blandingen til en frisk rør. Bland godt og Fastgør det til magneten i 5 min.
      13. Væsken (indeholder CD8 + celler) til et friskt rør på is. Nu, alikvot de resterende 3 − 4 mL blanding fra trin 5.1.1.12 til røret og Fastgør det til magneten i 5 min. Decant væsken (andet parti af CD8 + celler isoleret) til det samme rør, der indeholder den første batch af CD8 + celler holdes på is.
   2. Frø konstrueret overholder fibroblast APC-(MEC. B7. Sigova) linje til at udtrykke en specifik ægalbumin (OVA)-afledte, H-2kb-begrænset peptid epitop OVA257-264 (SIINFEKL), sammen med co-stimulerende molekyle b 7.1, ved 75.000 celler pr brønd i 24-brønd plader, ved 37 °c, 5% Co₂ befugtede inkubator.
      Bemærk: den anvendte fibroblast er en gave fra Dr. Edith Janssen-laboratoriet på CCHMC. Linjen blev oprindeligt oprettet i Dr. Stephen P. Schoenbergers laboratorium i La Jolla Institute for allergi og Immunologi⁶.
   3. Efter 24 timer, vask enkeltlags af APC en gang med iscove modificerede dulbecco's medium (imdm) kommercielt tilgængelige med Hepes buffer, natriumpyruvat, L-glutamin og høj glukose), og tilsæt 0,5 x 10⁶ naive OT-I CD8 + celler (fra trin 5.1.1.13) i 2 ml imdm suppleret med 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamin og HEPES og 10% FBS.
   4. Efter 20 timer høstes forsigtigt de ikke-vedlige OT-I-celler (ved at indsamle medierne i kultur skålen med flydende OT-I-celler og pelletering af cellerne ved 191 x g i 2 min; Tæl de levedygtige OT-i-celler) og overfør dem til co-kultur.
2. Co-kultur af CD8 + celler med B16/F10-OVA celler
   1. Seed OT-I-afledte CD8 + celler i et forhold på 1:1 (300.000 celler hver) i en co-kultur med B16/F10 (mangler antigen ovalbumin), ubehandlet B16/F10-OVA, og B16/F10-OVA celler præ-behandlet med flavopiridol (25 nM) i 1 uge, i 6-brønd retter med komplet DMEM 20 h ved 37 °C i en 5% CO₂ befuret inkubator.
   2. Efter 20 h, fjerne OT-I-afledte CD8 + celler (ved at indsamle medierne i kulturen skålen med flydende OT-I afledte CD8 + celler). De klædige B16/F10-OVA-celler vaskes i 1x PBS.
   3. Trypsinize de tre grupper af vedlagte B16/F10-OVA-celler i 0,05% EDTA indeholdende trypsin i 5 min. pellet de trypsiniserede celler ved 191 x g i 5 min.
   4. Plette de høstede B16/F10-OVA celler ved at inkubere dem i Cold PBS (indeholdende 0,5% FBS og 0,05% natriumazid) med levedygtighed farvestof og relevante mærket antistoffer (fixable levedygtighed farvning Dye e780, AF647-konjugeret mus CD8 og BV421-konjugeret mus CD45 ).
   5. Analyser levedygtigheden af de tre grupper af B16/F10-OVA celler ved flow cytometri.

Representative Results

Her giver vi en detaljeret ordning (figur 1) til at etablere en te^absolut celle model opnået ved kronisk sub-dødelig (figur 2) behandling med Flavopiridol ved 25 nm. I figur 3, på 3 dage af behandling med flavopiridol, B16 OVA celler viser delvise egenskaber af te^absolut men efter en uges behandling, B16/F10 OVA celler viser et dybtgående tab af fosforylering på SERIN 2 position på CTD af RNA pol II langs med et signifikant fald i H3K36me3 — en Histon modifikation impliceret i definering af exon grænser og en inhibitor af Run-Away kryptiske transskriptioner. Som en konsekvens, TE^absolut celle model viser kritiske mRNA behandling defekter med klart forhøjede forhold af forkert udjævnede og ikke-poly-adenylated mRNAs (figur 4a, B). Der ses også specifik undertrykkelse af vigtige inflammatoriske reaktions pathway gener og FasL medieret celledød i figur 5 og figur 6. Den pålagte resistens over for interferon (IFN-α, IFNγ) og TNF-α stimuleret fosforylering af STAT1 og NFκB, og resistens over for celledød ved døden receptor ligand FasL reducerer drastisk cytotoksicitet af et immuncelle angreb mod TE^absolut Tumorer. Disse bekræftende teknikker er designet til at teste omfanget af indflydelse kronisk forstyrrelse af transkriptionen forlængelse har på en bred vifte af stimulus-lydhør gener, og om en sådan forstyrrelse i en given muse cellelinje model er tilstrækkelig nok til at Spørg en akut mangel på funktionelle mRNA i inflammatoriske respons signalering gener, efterligne de grundlæggende essentialities af TE^absolut kræft i klinisk. Baseret på vores undersøgelse af flavopiridol-behandlingen er undertrykkelse af fosforylering ved den anden Serin rest (pSER2) af RNA pol II CTD kritisk, da det markerer transkriptionsforlængelse. En subletale dosis for en given muse karcinom cellelinje skal opnå en reduktion i pSER2 niveauer ud over at have en ubetydelig virkning på vækstraten og levedygtighed af celle linjen. Selv om vi konsekvent se en reduktion i pSER2 og H3K36me3 niveauer på 25 nM flavopiridol behandlinger, det garanterer ikke en undertrykkelse af både pSTAT1 og pNFκB niveauer (på IFN-α, IFNγ og TNF-α stimulationer, hhv.). Hver muse karcinom cellelinje er unik (B16/F10 OVA eller CT26 celler, der dyrkes i forskellige laboratorier over en periode kan have lidt ændrede virkninger), og de kan have enten JAK1 eller CCNT1 delvist at redde virkningerne af flavopiridol i at undertrykke inflammatoriske respons pathway gener. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at kontrollere kinetikken af pSTAT1 og pNFκB på forskellige tidspunkter (5 − 70 min) for at forstå den temporalitet af flavopiridol medierede effekter og dens redning ved enten JAK1 eller CCNT1. Derfor kan JAK1 og/eller CCNT1 være nødvendigt at blive slået ned for at etablere denne model.

Når flavopiridol modellen er etableret og karakteriseret ved hjælp af førnævnte assays, giver vi en sonderende analyse for at teste, om TE^absolut celle model giver resistens over for cytotoksisk T-Cell (CTL) angreb. Baseret på vores optimerede protokol, flavopiridol behandlede B16/F10 celler stabilt overudtrykker OVA-genet (B16 OVA) Co-inkuberet med de aktiverede CD8 + CTLs (specifik for OVA257-264 epitope) med selektiv toksicitet for OVA-ekspression celler (en gave fra Dr. Stephen P. Schoenbergers laboratorium⁶) var ikke modtagelige for OT-I CTL-medieret tumorlyse. B16/F10 OVA-celler (ikke forbehandlet med flavopiridol) gennemgik massiv celledød i dette system, mens B16/F10 forældre celler overlevede, da de ikke udtrykker OVA-antigen (figur 7). Det fremgår klart af resultatet af den foreslåede sonderende analyse, at kronisk flavopiridol-induceret TE^{helt sikkert} kan skænke et middel til at flygte fra anti-tumor immun angreb selv in vivo. Dette kan yderligere testes i in vivo tumormodeller til at kontrollere tilbøjeligheden af TE^{helt sikkert} modeller til at undslippe medfødte og adaptive anti-tumor immunrespons. Anti-asialo behandlinger kan anvendes til at regulere aktiviteten af NK celler in vivo i tumor bærende mus. Også, immun check point terapi (anti-CTLA4 og anti-PD1) kan administreres til TE^absolut tumor bærende mus.

I helhed, TE^definitivt bekræftende assays sammen med den foreslåede sonderende analyse sammen demonstrere nytten af at INDARBEJDE denne te^{helt sikkert} celle model i en hel række andre tumor-immun Testbetingelser. Denne model kan hjælpe med at analysere de molekylære detaljer som følge af defekt transkriptional forlængelse i tumorceller og deres respons på immuncelle interaktioner.

Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsstrømmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: cellevækst Karakteristik af B16 OVA celler kronisk behandlet med lavdosis flavopiridol: levedygtighed (målt ved levedygtighed reagens) af kontrol og flavopiridol-behandlede celler B16 OVA på angivne dage efter behandling. Dette tal er blevet ændret fra Modur et al.³. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: bekræftende assay til vurdering af RNA pol II og Histon profilen: immunoblots af indikeret Histon og RNA pol II mærker i B16 OVA-celler behandlet med flavopiridol i 72 h eller 1 uge. Dette tal er blevet ændret fra Modur et al.³. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: bekræftende assay til vurdering af alvorlige defekter i mRNA-behandling. Nøgletal af 5 ′-ikke-fastgjort til 5 ′-udjævnet (A) og 3 ′-ikke-polyadenyleret til 3 ′-Polyadenylated (B) mRNA koncentrationer efter rRNA udtømning i de angivne cellelinjer. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen baseret på tre tekniske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: bekræftende assay til vurdering af cytokinstimulations profilen. Immunoblots af STAT1, pSTAT1, NFκB og p NFκB i kontrol og flavopiridol forbehandlede B16 OVA-celler stimuleret med IFN-α, IFNγ eller TNF-α i 30 min ved (5 ng/mL). Dette tal er blevet ændret fra Modur et al.³. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: bekræftende assay til vurdering af resistens over for FasL medieret celledød in vitro. Kontrol og flavopiridol forbehandlede B16 OVA-celler behandlet med FasL i 24 timer udlæseligt målt ved rentabilitetsanalyse. Dette tal er blevet ændret fra Modur et al.³. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: sonderende analyse for at vurdere resistens af TE^{helt sikkert} model til antigen-begrænset cytotoksisk T cellemedieret angreb in vitro. Venstre: skematisk skema af den sonderende analyse. Til højre: relativ levedygtighed af B16/F10-OVA-celler, som er co-dyrket med aktiverede CD8 + CTLS (1:1 ratio) isoleret fra deres af OT-I-mus. P: Welch- t-test med to stikprøver. Dette tal er blevet ændret fra Modur et al.³. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

RNA pol II forlængelse kontrol er dukket op som en afgørende løftestang til regulering stimulus-lydhør genekspression til gavn for maligne celler^5,7,8. Overvindelse af promotor-proksimal pauser til forlængelse og efterfølgende mRNA-produktion kræver kinaseaktiviteten af P-tefb^9,10,11. Vores model udnytter flavopiridol (25 nM), en hæmmer af den essentielle cyclin-afhængige kinase CDK9, til at efterligne de defekter, der er observeret under Pol II forlængelse i TE^afgjort kræft – en tidligere ukendt fænotype i kræft, der blev opdaget af vores gruppe tidligere³.

CDK9 kinase aktivitet har længe været kendt for at være afgørende for fosforylering af Serin 2 rester i CTD af den store underenhed af Pol II. Kritisk, vi har formået at optimere flavopiridol behandlet kronisk hæmning af CDK9 (25 nM for 1 uge) i B16/F10 æg, således at, ud over at hæmme CTD fosforylering, 25 nM flavopiridol behandling i 1 uge forhindrer korrekt post-transkriptional ændringer af mRNA i en uventet måde og effektivt ophæver p-TEFb-afhængig produktiv forlængelse langs lange gener såsom pro-inflammatoriske respons signalering gener, markant at ændre deres udtryks mønstre både på mRNA og protein niveauer. Til vores bedste viden, er der ingen anden model er beskrevet i litteraturen, som effektivt opnår det samme.

Denne let at etablere, generaliserbare model af TE^absolut kan derfor udnyttes til dissekere, både transkriptionelle og epigenetiske modifikationer muliggør te^absolut kræft at tilpasse sig immunmedierede celle angreb. Desuden, denne murine model bevarer sin TE^absolut-lignende reduktion af total og phospho-RNA pol II niveauer 21 dage efter flavopiridol frigivelse i in vivo vækst assay³ (ikke nævnt i protokollen her), tyder på omfanget af stabiliteten af denne ikke-genetisk model for yderligere in vivo forsøg. Der skal dog udvises forsigtighed for at optimere den nøjagtige subleale dosis af flavopiridol til andre murine linjer (f. eks. ca. 20 Nm flavopiridol behandling i 1 uge er den subleale dosis for MC38 murine karcinom line; ikke anvendes i denne protokol), virkningen af variation i celle plating tæthed, kulturforhold, og cytokin stimulation betingelser kan variere for forskellige murine linjer. Den protokol, der er beskrevet her, giver en grundlæggende ramme for at minimere de variabler, der vides at være kritiske for genereringen af TE^Definitely-lignende funktioner ved kronisk CDK9 hæmning. Desuden, humane karcinom cellelinjer, såsom T47D og CAL51 er blevet testet med kortsigtede (3 dage) flavopiridol behandlinger, der giver anledning til lignende TE^absolut-lignende RNA pol II profiler, hvilket indikerer nytten af flavopiridol baseret kronisk hæmning af CDK9 medieret transkriptionen forlængelse i at skabe selv model menneskelige linjer til at studere TE^{helt sikkert}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 well plates	Falcon	353043
20% methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-well plates	Falcon	351147
4–18% SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% dry milk	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosine antibody	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend	100727
antibiotic and antimycotic	Gibco	15240-062
anti-His antibody	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead staining dye e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	Dilution 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
total H3	Cell Signaling	4499	Dilution 1:2000
Tri reagent	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	Cell Signaling	12620S	Dilution 1:5000
β-ME	G Biosciences	BC98