Summary
Protokollet Detaljer en in vitro murina carcinoma modell av icke-genetiska defekt transkription förlängning. Här, kronisk hämning av CDK9 används för att förtrycka produktiv förlängning av RNA-pol II längs pro-inflammatoriska svar gener för att efterlikna och studera kliniskt överserveras TEdefinitivt fenomen, närvarande i cirka 20% av alla cancertyper.
Abstract
Vi har tidigare rapporterat att en delmängd av cancer definieras av globala transkriptionella avregleringar med utbredda brister i mRNA transkription förlängning (te)-vi kallar sådana cancer som tedefinitivt. Särskilt TEdefinitivt cancer kännetecknas av falska transkription och felaktig mRNA bearbetning i en stor uppsättning av gener, såsom INTERFERON/Jak/stat och TNF/NF-κb vägar, vilket leder till deras förtryck. TEdefinitivt subtyp av tumörer i njurcellscancer och metastaserande melanom patienter korrelerar signifikant med dålig respons och utfall i immunterapi. Med tanke på vikten av att undersöka TEdefinitivt cancer-eftersom det förebådar en betydande vägspärrar mot immunterapi-målet med detta protokoll är att upprätta en in vitro-tedefinitivt musmodell för att studera dessa utbredda, icke-genetiska transkriptionella avvikelser i cancer och få nya insikter, nya användningsområden för befintliga läkemedel, eller hitta nya strategier mot sådana cancerformer. Vi detalj användningen av kronisk flavopiridol medierad CDK9 hämning att upphäva fosforylering av serin 2 rester på C-terminalen upprepa domän (CTD) av RNA-polymeras II (RNA-pol II), undertrycka frisättning av RNA-pol II till produktiv transkription Förlängning. Med tanke på att TEdefinitivt cancer inte klassificeras under någon specifik somatisk mutation, en farmakologisk modell är fördelaktigt, och bäst härmar de utbredda transkriptionella och epigenetiska defekter som observerats i dem. Användningen av en optimerad subletala dos av flavopiridol är den enda effektiva strategin för att skapa en generaliserbar modell av icke-genetiska utbredda störningar i transkription förlängning och mRNA bearbetningsdefekter, nära imitera den kliniskt observerade te definitivt egenskaper. Därför, denna modell av TEdefinitivt kan utnyttjas för att dissekera, cell-autonoma faktorer som gör det möjligt för dem att motstå immunmedierad cell attack.
Introduction
Ett nyckelhastighetsbegränsande steg i uttrycket av nästan alla aktiva gener är övergången av RNA-polymeras II (RNA-pol II) från Promotorn-proximal paus till produktiv förlängning1,2. Med tanke på att epigenetisk dysreglering av transkriptionell förlängning bistår i utvecklingen av flera mänskliga maligniteter definieras som TEdefinitivt, vilket leder till suboptimala signalering i pro-inflammatoriska responsvägar som uppgår till en dålig respons och utfall till immunterapi3, det övergripande målet med detta protokoll är att etablera en användbar in vitro-modell för att studera dessa utbredda icke-genetiska transkriptionella avvikelser i cancer. Mot denna bakgrund är användningen av kronisk farmakologisk hämning av CDK9 en effektiv strategi för att skapa en generaliserbar modell av icke-genetiska utbredda störningar i transkriptionsförlängning och mRNA-bearbetningsdefekter. Logiken bakom att använda kronisk CDK9 hämning är att det upphäver fosforylering av serin 2 rester på C-terminalen upprepa domän (CTD) av RNA-pol II, därmed undertrycka frisättning av RNA-pol II till produktiv transkription förlängning. Också, TEdefinitivt cancer, beskrivs tidigare av vår grupp3, klassificeras inte under någon specifik somatisk mutation. Därför är en icke-genetisk (farmakologisk) modell fördelaktig och bäst härmar de utbredda transkriptionella och epigenetiska defekter som observerats i dem. Metoden häri beskriver generering och karakterisering av kronisk flavopiridol behandlingsmodell av murina cancerceller. Denna metod stör bevisligen transkriptionsförlängning längs gener som kännetecknas av längre genomiska längder, med redo initiativtagare och inducerbara uttryck såsom TNF/NF-κb och interferon/stat signalering, djupt kontrollerad på nivån för transkriptionsförlängning3,4,5. Sammantaget denna optimerade murina cell linje modell av transkriptionella förlängning defekter-den enda modellen till vår kännedom att studera den nyligen beskrivna tedefinitivt tumörer-driver resistens mot anti-tumör immun angrepp, vilket gör ett användbart system för att utnyttja och undersöka sårbarheter i icke-genetiska defekter i kärntranskription maskiner i cancer vis-à-vis immunmedierad cell attack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella djuromsorg och användning kommittén och institutionella biosäkerhet kommittén för Cincinnati Children ' s Research Foundation godkänt alla försöksdjur experimentella förfaranden (IACUC protokoll #2017-0061 och IBC protokoll #IBC2016-0016), och dessa experiment utfördes i enlighet med standarder som beskrivs i NIH guide till vård och användning av försöksdjur.
1. kronisk hämning av RNA-pol II av flavopiridol behandling – grundläggande strategi
- Utsäde B16/F10 mus melanomceller i låg densitet (0,2 x 106) i en 10 cm odlings platta i motsvarande medium (Dulbecco modifierade Eagle medium [DMEM], 10% foster bovint serum [FBS], 1% penicillin och streptomycin [Pen/STREP]) och inkubera över natten i en 37 ° c, 5% CO2 befuktade inkubator.
- Efter dag, tvätta cellerna med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt en ny sats av odlingsmedier med en subletal dos (uppskattad som 25 nM) flavopiridol – en hämmare av RNA pol II-förlängningen p-TEFb (Cyclin T/CDK9) – under en vecka utan ytterligare under odling.
- Efter en vecka av flavopiridol behandling, utföra bekräftande analyser för att utvärdera modellens förmåga att recapitulate olika attribut av transkriptionella töjning defekter ses i tedefinitivt cancer.
2. bekräftande immunoblot-analys för att bedöma defekt RNA-pol II-funktion och försämring av interferon (IFN)-väg och tumörnekrosfaktor (TNF) väg signalering av i den genererade musen TEdefinitivt modell
- Kultur lika antal (105) av flavopiridol behandlade B16/F10 mus melanomceller och föräldra-/F10 mus melanomceller i två olika uppsättningar av 12 väl plattor (en uppsättning för RNA pol II funktionell karakterisering och den andra uppsättningen för cytokin stimulering) vid 37 ° c i en 5% CO2 fuktad inkubator över natten.
- Nästa dag, behandla cellerna i cytokin stimulering set med mus IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL), eller TNF-α (5 ng/mL) för 45 min vid 37 ° c.
- Nu extrahera protein från celler i både cytokin och RNA-pol II funktionella karakteriseringsset med hjälp av en radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffert på följande sätt:
- Tvätta celler med 1x PBS och lyse den med 50 μL av lyseringsbufferten per brunn. Skrapa, och sedan pelleten de lyserade cellerna vid 4 ° c, 21 130 x g.
- Mät proteinet i cell lysate samman supernatanterna med hjälp av en standard kolorimetrisk analys för proteinkoncentration efter rengöring av rengöringsmedel (Bradford eller en liknande analys).
- Ladda lika mycket uppmätt protein (15 μg) från varje prov som ska köras i en polyakrylamidgel på 4% − 18% natriumdodecylsulfat (SDS) och överför dem till polyvinylidendifluoridmembran (PVDF).
- Blockera PVDF-membranen i 5% torrmjölk i Tris-buffrad saltlösning − polysorbat 20 (TBST) under 1 h följt av en nattinkubation vid 4 ° c med primära antikroppar (RNA pol II 1:1000; p-SER2 RNA pol II 1:1000; p-SER5 RNA pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; Totalt H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-actin 1:5000) i 5% bovint serumalbumin.
- Efter dagen tvättar du PVDF-membranen med 1x TBST i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) och inkubera dem med lämpliga sekundära antikroppar (anti-råtta [1:5000] för RNA pol II, p-SER2 RNA pol II och p-SER5 RNA pol II; anti-kanin (1:5000) för H3K36me3, totalt H3, STAT1, p-STAT1, NFκB, och p-NFκB) för 50 min vid RT. detektera protein signalerna med hjälp av kommersiellt tillgänglig pepparrots peroxidas (HRP) substrat med förbättrad chemiluminescence.
Anmärkning: β-Actin primära används är HRP-konjugerat, därför kan det utvecklas utan en sekundär.
3. bekräftande analys för att bedöma mRNA-bearbetningsdefekter i den genererade musen TEdefinitivt modell
- Utsäde lika antal (0,2 x 106) av flavopiridol behandlade B16/F10 mus melanomceller och förälder B16/F10 mus melanomceller i 6-well plattor vid 37 ° c i en 5% Co2 fuktade inkubator över natten.
- Extrahera totalt RNA från odlade celler vid 60% confluency med hjälp av en RNA-extraktion reagens eller Kit (tabell över material).
- Bryter rRNA från det totala extraherade RNA på följande sätt:
Obs: ett Low-input-protokoll har adjungerats från ett kommersiellt tillgängligt kit för att tömma rRNA- Ställ ett vattenbad eller värmeblock till 70 − 75 ° c, och ett annat vattenbad eller värmeblock vid 37 ° c.
- Tillsätt totalt RNA (100 − 500 ng i 2 μl nukleasfritt vatten) med 1 μl selektiv rRNA-utarmningssond och 30 μl hybridiseringsbuffert i ett microcentrifugerör, blanda försiktigt med vortexa och inkubera dem vid 70 − 75 ° c i 5 min.
- Nu, överföra rören till en 37 ° c vattenbad/värmeblock, och låt provet svalna till 37 ° c under en period av 30 min.
- Omsuspendera selektiv rRNA utarmning sond magnetiska pärlor av vortexing, och alikvot 75 μl av pärlor i en 1,5 ml RNase-fri microcentrifug röret.
- Placera pärlfjädringen på en magnetisk separator i 1 min. Låt pärlorna att bosätta sig. Försiktigt aspirera och Kassera supernatanten. Upprepa tvättning av pärlorna igen genom att tillsätta 75 μL nukleasfritt vatten och Kassera supernatanten efter magnetisk separation.
- Omsuspendera de tvättade pärlorna i 75 μL hybridiseringsbuffert och alikvot 25 μL av det till ett annat rör och behåll det vid 37 ° c för senare användning.
- Placera de återstående 50 μL-pärlorna på en magnetisk separator i 1 min och Kassera supernatanten. Omsuspendera pärlorna i 20 μL hybridiserings buffert och behåll den vid 37 ° c för senare användning.
- Efter kylning av RNA/selektiv rRNA utarmning sond blandningen till 37 ° c för 30 min, kort Centrifugera röret för att samla in provet till botten av röret.
- Överför 33 μL av RNA/selektiv rRNA utarmning sond blandningen till de beredda magnetiska pärlor från steg 3.3.7. Blanda med låg hastighet vortexing.
- Inkubera röret vid 37 ° c i 15 min. Under inkubering, blanda försiktigt innehållet ibland. Följd av kort centrifugering för att samla provet till botten av röret.
- Placera röret på en magnetisk separator i 1 min till pellets den rRNA-sond komplex. Denna gång inte kasta supernatanten. Supernatanten innehåller rRNA-utarmat RNA.
- Placera röret med 25 μL pärlor från steg 3.3.6 på en magnetisk separator i 1 min. Aspirera och Kassera supernatanten. Tillsätt supernatanten från steg 3.3.11 till det nya röret av pärlor. Blanda med låg hastighet vortexing.
- Inkubera röret vid 37 ° c i 15 min. Under inkubering, blanda försiktigt innehållet ibland. Kort Centrifugera röret för att samla provet till botten av röret.
- Placera röret på en magnetisk separator i 1 min till pellets den rRNA-sond komplex. Kassera inte supernatanten. Överför supernatanten (ca 53 μL) innehållande rRNA-utarmat RNA till ett nytt rör.
- Mät koncentrationen av RNA-utbytet med en spektrofotometer.
- Använd hälften av de rRNA-utarmade proverna som indata till magnetiska pärlor som innehåller oligo (dT) 25 för att extrahera polyA+ RNA på följande sätt:
Anmärkning: detta protokoll för att isolera polyA svans budbärare RNA med oligo dT sekvenser bundna till ytan av magnetiska pärlor har adjungerats från en kommersiellt tillgänglig Kit (tabell över material).- Omsuspendera oligo DT-pärlorna i injektionsflaskan med en kort vortexa för > 30 s och överför 200 μl oligo DT-pärlor till ett rör. Lägg till samma volym (200 μL) bindningsbuffert och Omsuspendera.
- Placera röret i en magnet i 1 min och Kassera supernatanten. Ta nu bort röret från magneten och Omsuspendera de tvättade oligo dT-pärlorna i 100 μL bindningsbuffert.
- Justera volymen för det inkommande rRNA-utarmade totala RNA-provet till 100 μL med 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Lägg nu till 100 μL bindningsbuffert.
- Värm till 65 ° c i 2 minuter för att störa sekundära RNA-strukturer. Nu, omedelbart plats på is.
- Tillsätt 200 μL totalt RNA till de 100 μL-tvättade pärlorna. Blanda grundligt och Tillåt bindning genom att rotera kontinuerligt på en rotor i 5 minuter vid RT.
- Placera röret på magneten för 1-2 min och försiktigt ta bort alla supernatanten och försiktigt ta bort alla supernatanten.
- Ta bort röret från magneten och tillsätt 200 μL tvättbuffert.
- Mät renhet och koncentration av det extraherade polyA+ RNA med en spektrofotometer.
Anmärkning: ett 260/280-förhållande på 1,90 − 2,00, och ett 260/230-förhållande på 2,00 − 2,20 för alla RNA-prover anses acceptabla. - Använd resterande halva av de rRNA-utarmade proverna från avsnitt 3,3 som indata till protein A-kolonner (tillhandahålls i RNA immunoprecipitation [RIP] kit, tabell över material) till immunoprecipitate femprime-utjämnade rnas med hjälp av monoklonala 7-metylguanosin antikropp på följande sätt:
Anmärkning: detta protokoll för att isolera m7G utjämnade Messenger-RNA med hjälp av en kommersiellt tillgänglig RNA immunoprecipitation Kit har adjungerade och ytterligare modifierade.- Tvätta proteinet med en magnetisk pärla som erhålls från RIP-satsen enligt tillverkarens protokoll för att före binda antikroppen till pärlorna.
- Överför 3 μg 7-metylguanosinanti kropp (kanin-IgG som finns i satsen kan användas den negativa kontrollen) till pärlorna i ett microcentrifugerör som suspenderas i 100 μL tvättbuffert från satsen.
- Inkubera med låg hastighets rotation i 30 minuter vid RT. Centrifugera rören kort och placera sedan rören på en magnetisk separator, ta bort och Kassera supernatanten.
- Ta bort rören och tillsätt 500 μL tvättbuffert från satsen och skaka en kort stund. Centrifugera rören kort följt av magnetisk separation igen, ta bort och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 3.6.4 en gång till.
- Tillsätt runt 120 ng av rRNA utarmat (från avsnitt 3,3) till den förtvättade 7-metylguanosin antikropp bundna pärlor. Tillsätt 1 μL RNase hämmare. Inkubera vid RT för 1 − 1,5 h med mild agitation.
- Snurra ner pärlorna på 300 x g för 10 s och ta bort supernatanten som innehåller outjämnade (icke-7-metylguanosin) mRNA till ett nytt microcentrifugerör.
- Tillsätt 100 μL tvättbuffert och tvätta den ytterligare två gånger på samma sätt. Pool den insamlade supernatanten i samma microcentrifug röret märkt outjämnade (icke-7-metylguanosin) mRNA. Förvara på isen.
- Eluera det utjämnade (7-metylguanosin) mRNA från pärlorna med 300 μL av urelyseringsbuffert (ULB) innehållande 7 M urea, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA och 10 mM Tris, pH 7,5 genom upphettning av pärlorna vid 65 ° c i 2 − 3 min.
- Blanda 300 μL av de eluerade proverna (utjämnade och icke-utjämnade mRNA) med 300 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1; kommersiellt tillgänglig) (förvaras vid 4 ° c). Blanda väl genom att invertera och låt verka ca 10 min blanda sedan igen försiktigt.
- Centrifugera vid 18 928 x g i 2 min och Pipettera försiktigt det översta lagret till färskt rör och kassera bottenskiktet.
- Tillsätt 300 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1; lagrad vid 4 ° c) till proverna. Blanda väl genom att invertera och sedan Centrifugera på 18 928 x g i 1 min. försiktigt, Pipettera det översta lagret till en ny slang och kassera bottenskikt.
- Tillsätt 300 μL av 2-porpanol och 30 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) till det utjämnade och icke-utjämnade RNA. Invertera provet några gånger och Lägg det vid-20 ° c i 20 timmar.
- Nu Centrifugera proverna på 18 928 x g i 10 min vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt 500 μL 70% etanol.
- Centrifugera igen vid 18 928 x g i 10 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten försiktigt och torka av pelleten vid RT i mindre än 5 min. Omsuspendera pelleten i nukleasfritt vatten.
- Mät renhet och koncentration av RNA-avkastning med en spektrofotometer. Förhållandet 260/280 ska vara i intervallet 1,90 − 2,00 och 260/230-kvoten i intervallet 2,00 − 2,20 för alla RNA-prover.
4. bekräftande analys för att bedöma responsen av mus TEdefinitivt modell till fasl medierad celldöd
- Utsäde lika antal (30 000 celler) av flavopiridol behandlade B16/F10 mus melanomceller och föräldrar B16/F10 mus melanomceller i en 96-brunn kultur tallrik i motsvarande medium (DMEM), och inkubera över natten i en 37 ° c, 5% CO2 befuktade Inkubator.
- Behandla cellerna i en kultur huva med olika koncentrationer av hhans6fasl (0,1 − 1000 ng/ml) i närvaro av 10 μg/ml anti-his antikropp och inkubera i 24 h vid 37 ° c, 5% Co2 befuktade inkubator.
- Ta bort döda celler genom att tvätta med 1x PBS buffert. Fix de bifogade cellerna i 4% PARAFORMALDEHYD för 20 min vid RT. Kassera 4% PARAFORMALDEHYD (inget behov av att tvätta), och fläcken med kristall violett lösning (20% metanol, 0,5% Crystal Violet i 1x PBS) för 30 min.
- Ta bort överflödig fläck genom att försiktigt skölja plattorna i kranvatten. Håll plattorna torra vid RT.
- Återlös kristallviolett i 100 μL 1x nonioniskt ytaktivt ämne upplöst i 1x PBS och mät CELLTÄTHETEN genom att mäta absorbansen vid 570 nm i en mikroplattläsare.
5. undersökande analys för att bedöma responsen av mus TEdefinitivt modell för antigen specifika cytotoxiska T-cell attack
- Isolering och aktivering av OT-I CD8 + cytotoxiska T-cells attack (CTL)
- Rena CD8 + celler från mjälte av OT-I TCR TG Rag-1 −/− möss genom magnetisk cellseparation med hjälp av en mus CD8 T cell isolering kit enligt följande:
- Skörda två mjälte från två OT-I TCR TG Rag-1 −/− möss i komplett RPMI media.
- Mosa mjälte i ett 70 μm filter hålls på en 50 ml tub fylld med 20 ml RPMI, med hjälp av bak i en spruta tills endast fett lämnas kvar i filtret.
- Centrifugera flödet genom vid 220 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 mL av den röda blod cellen (RBC) lysis buffert till mjälten pelleten från föregående centrifugering steg och Pipettera blandningen i 1 min.
- Neutraliserar lösningen genom att tillsätta upp till 10 mL RPMI.
- Centrifugera vid 220 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera i 10 mL RPMI.
- Ta en liten alikvot för räkning. Centrifugera resterande vid 220 x g i 5 min vid 4 ° c.
- För varje miljon celler som räknas, Omsuspendera pelleten i 1 mL kommersiellt tillgänglig magnetisk separeringssystem buffert (Mojo buffert eller en liknande buffert).
- Förbered en antikropps cocktail av volym 100 μL för varje 1 mL pelleterade celler i steg 5.1.1.8. Antikropps cocktail innehåller: biotin anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ, och CD44.
- Tillsätt denna cocktail till de 1 mL pelleterade cellerna och håll på isen i 15 min.
- Tillsätt 100 μl magnetisk (streptavidin) pärlor till varje 100 μl av antikropps cocktail tillsätts i 1 ml återsuspenderade inblandning pelleterat mjältceller. Håll på is i 15 min.
- Tillsätt 7 mL kommersiellt tillgänglig magnetisk separeringssystem buffert. Nu, alikvot ca 3 − 4 ml av blandningen till en ny slang. Blanda väl och fixa det till magneten i 5 min.
- Dekanera vätskan (innehåller CD8 + celler) till en ny slang på isen. Nu, alikvot resterande 3 − 4 ml blandning från steg 5.1.1.12 till röret och fixa det till magneten för 5 min. dekanera vätskan (andra omgången av CD8 + celler isolerade) till samma rör som innehåller den första omgången av CD8 + celler som hålls på is.
- Utsäde konstruerade anhängare fibroblast APC-(MEC. B7. Sigova) linje för att uttrycka en specifik äggalbumin (ova)-derived, H-2kb-begränsad peptid epitop OVA257-264 (siinfekl), tillsammans med co-stimulerande molekyl b 7.1, på 75 000 celler per brunn i 24-bra tallrikar, vid 37 ° c, 5% Co2 fuktad inkubator.
Obs: den anhängare fibroblast används är en gåva från Dr Edith Janssen ' s Lab på CCHMC. Linjen skapades ursprungligen i Dr Stephen P. Schoenberger ' s Lab i La Jolla Institute for allergi och immunologi6. - Efter 24 h, tvätta enskiktslager av APC en gång med Iscove modifierade Dulbecco ' s medium (imdm) kommersiellt tillgängliga med Hepes buffert, natriumpyruvat, L-glutamin och hög glukos), och tillsätt 0,5 x 106 naiva OT-I CD8 + celler (från steg 5.1.1.13) i 2 ml imdm kompletterat med 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamin och HEPES och 10% FBS.
- Efter 20 h, försiktigt skörda icke-adherent OT-I celler (genom att samla in media i kulturen skålen med flytande OT-I celler och pulverform pelleteringsmedel cellerna vid 191 x g för 2 min; räkna den LIVSKRAFTIGA OT-i celler) och överföra dem för co-kultur.
- Rena CD8 + celler från mjälte av OT-I TCR TG Rag-1 −/− möss genom magnetisk cellseparation med hjälp av en mus CD8 T cell isolering kit enligt följande:
- Co-kultur av CD8 + celler med B16/F10-OVA celler
- Utsäde OT-I-härledda CD8 + celler vid ett förhållande av 1:1 (300 000 celler vardera) i en medkultur med B16/F10 (saknar antigen ovalbumin), obehandlad B16/F10-OVA, och B16/F10-OVA celler förbehandlade med flavopiridol (25 nM) för 1 vecka, i 6-bra rätter med komplett DMEM media för 20 h vid 37 ° c i en 5% CO2 fuktad inkubator.
- Efter 20 h, ta bort OT-I-härledda CD8 + celler (genom att samla in media i kulturen skålen med flytande OT-jag härledda CD8 + celler). Tvätta de anhängare B16/F10-OVA cellerna i 1x PBS.
- Trypsinize de tre grupperna av bifogade B16/F10-OVA celler i 0,05% EDTA innehåller trypsin för 5 min. pellet de trypsinized cellerna vid 191 x g för 5 min.
- Färga de skördade B16/F10-OVA-cellerna genom att ruva dem i kallt PBS (innehållande 0,5% FBS och 0,05% natriumazid) med livsdugligt färgämne och relevanta märkta antikroppar (fixerbar livskraft färgning Dye E780, AF647-konjugerad mus CD8 och BV421-konjugerad mus CD45 ).
- Analysera genomförbarheten hos de tre grupperna av B16/F10-OVA-celler med flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här ger vi ett detaljerat system (figur 1) för att upprätta en tedefinitivt cell modell som erhållits genom kronisk sub-dödande (figur 2) behandling med Flavopiridol vid 25 nm. I figur 3, på 3 dagars behandling med flavopiridol, visar B16 OVA-celler partiella egenskaper hos tedefinitivt men efter en veckas behandling visar B16/F10 OVA-celler en djupgående förlust av fosforylering vid SERIN 2 position på CTD av RNA-pol II längs med en signifikant minskning av H3K36me3-en Histon modifiering inblandad i att definiera exon gränser och en hämmare av run-away kryptiska transkriptioner. Som en följd av TEdefinitivt cell modell visar kritiska mRNA bearbetning defekter med uppenbart ökade förhållanden av felaktigt utjämnade och icke-Poly-adenylerade mrnas (figur 4a, B). Också, specifikt förtryck av viktiga inflammatoriska responsvägar gener och FasL medierad celldöd väg ses i figur 5 och figur 6. Den införda resistensen mot interferon (IFN-α, IFNγ) och TNF-α stimulerad fosforylering av STAT1 och NFκB, och resistens mot celldöd genom död receptorn ligand FasL minskar drastiskt cytotoxiciteten av en immun cells attack mot TEdefinitivt Tumörer. Dessa bekräftande tekniker är utformade för att testa omfattningen av inflytande kronisk störning av transkription förlängning har på ett brett spektrum av stimulans-lyhörd gener, och om en sådan störning i en viss mus cell linje modell är tillräckligt tillräckligt för att snabb en akut brist på funktionella mRNA i inflammatoriska svar signalering gener, imitera grundläggande essentialities av TEdefinitivt cancer kliniskt. Baserat på vår studie av flavopiridol behandling, dämpning av fosforylering vid den andra serin rester (pSER2) av RNA-pol II CTD är kritisk, eftersom det markerar transkription förlängning. En subletal dos för en viss mus carcinom cellinjer måste uppnå en minskning av pSER2 nivåer förutom att ha en obetydlig effekt på ökningstakten och livskraften i cellinjer. Även om vi konsekvent ser en minskning av pSER2 och H3K36me3 nivåer på 25 nM flavopiridol behandlingar, det garanterar inte ett förtryck av både pSTAT1 och pNFκB nivåer (på IFN-α, IFNγ och TNF-α-stimuleringar, respektive). Varje mus carcinom cellinje är unik (B16/F10 OVA eller CT26 celler odlade i olika laboratorier under en tidsperiod kan ha något förändrade effekter) och de kan ha antingen JAK1 eller CCNT1 delvis rädda effekterna av flavopiridol i undertrycka inflammatoriska responsvägen gener. I sådana fall kan kinetik av pSTAT1 och pnfκb nivåer måste kontrolleras vid olika tidpunkter (5 − 70 min) för att förstå temporalitet flavopiridol medierade effekter och dess räddning av antingen JAK1 eller CCNT1. Följaktligen kan JAK1 och/eller CCNT1 behöva slås ner för att fastställa denna modell.
När flavopiridol modellen är etablerad och kännetecknas med hjälp av ovan nämnda analyser, ger vi en undersökande analys för att testa om TEdefinitivt cell modellen ger resistens mot cytotoxiska T-cell (CTL) attack. Baserat på vårt optimerade protokoll, flavopiridol behandlade B16/F10 celler stabilt överuttrycker OVA genen (B16 OVA) Co-inkuberas med aktiverade CD8 + CTL (specifik för OVA257-264 epitop) med selektiv toxicitet till OVA-uttrycker celler (en gåva från Dr. Stephen P. Schoenberger ' s Lab6) var inte mottagliga för OT-I CTL-medierad tumörlys. B16/F10 OVA-celler (inte förbehandlade med flavopiridol) genomgick massiv celldöd i detta system, medan B16/F10 föräldra celler överlevde, eftersom de inte uttrycker OVA-antigen (figur 7). Det framgår av resultatet av den föreslagna undersökande analysen att kronisk flavopiridol-inducerad TEdefinitivt kan skänka ett sätt att fly från anti-tumör immun angrepp även in vivo. Detta kan testas ytterligare i in vivo tumörmodeller för att kontrollera benägenheten av TEdefinitivt modeller för att undkomma medfödda och adaptiva anti-tumör immunsvar. Anti-asialo behandlingar kan användas för att reglera aktiviteten av NK-celler in vivo i tumör som bär möss. Också, immun kontrollpunkt terapi (anti-CTLA4 och anti-PD1) kan administreras till TEdefinitivt tumör som bär möss.
I helhet, TEdefinitivt bekräftande analyser tillsammans med den föreslagna undersökande analysen tillsammans Visa nyttan av att införliva denna tedefinitivt cell modell i en hel mängd andra tumör-immun Testvillkor. Denna modell kan hjälpa tolka ut de molekylära detaljerna till följd av defekt transkriptionella förlängning i tumörceller och deras svar på immuncellernas interaktioner.
Figur 1: schematisk representation av arbetsflödet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cell tillväxtkarakteristika för B16 OVA-celler som kroniskt behandlats med lågdos flavopiridol: lönsamhet (mätt med genomförbarhet reagens) för kontroll och flavopiridol-behandlade celler B16 OVA vid indikerade dagar efter behandling. Denna siffra har modifierats från Modur et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bekräftande analys för att bedöma RNA-pol II och histonprofil: Immunoblots av indikerade HISTONOCH RNA pol II-märken i B16 OVA-celler behandlade med flavopiridol för 72 h eller 1 vecka. Denna siffra har modifierats från Modur et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bekräftande analys för att bedöma allvarliga defekter vid behandling med mRNA. Förhållanden av 5 ′-outjämnade till 5 ′-utjämnade (A) och 3 ′-icke-polyadenyleras till 3 ′-polyadenylerade (B) mRNA koncentrationer efter rRNA utarmning i de angivna cellinjer. Felstaplar representerar standardavvikelse baserat på tre tekniska replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bekräftande analys för att bedöma profilen för cytokinstimulering. Immunoblots av STAT1, pSTAT1, NFκB och p NFκB i kontroll och flavopiridol förbehandlade B16 OVA-celler stimuleras med IFN-α, IFNγ eller TNF-α för 30 min vid (5 ng/mL). Denna siffra har modifierats från Modur et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: bekräftande analys för att bedöma resistens mot FasL medierad celldöd in vitro. Kontroll och flavopiridol förbehandlade B16 OVA-celler behandlade med FasL för 24 h avläsning mätt med genomförbarhet analys. Denna siffra har modifierats från Modur et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: undersökande analys för att bedöma resistens av TEdefinitivt modell till antigen-begränsad cytotoxisk T cell medierad attack in vitro-. Vänster: diagrammatiskt schema för den undersökande analysen. Höger: relativ livskraft B16/F10-OVA celler Co-odlade med aktiverade CD8 + ctls (1:1 ratio) isolerade från mjälte av OT-I möss. P: Welch två-prov t-test. Denna siffra har modifierats från Modur et al.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-pol II-förlängningen har framträtt som en avgörande hävstång för att reglera stimulans-lyhörd genuttryck till förmån för maligna celler5,7,8. Övervinna promotor-proximala pausa till förlängning och efterföljande mRNA produktion kräver Kinas aktiviteten av P-tefb9,10,11. Vår modell använder flavopiridol (25 nM), en hämmare av de väsentliga Cyclin-beroende Kinas CDK9, att efterlikna de defekter som observerats under Pol II förlängning i TEdefinitivt cancer-en tidigare okänd fenotyp i cancer upptäcktes av vår grupp tidigare3.
CDK9 Kinas aktivitet har länge varit känt för att vara avgörande för fosforylering av serin 2-rester i CTD hos den stora subenheten i pol II. Kritiskt, vi har lyckats optimera flavopiridol behandlas kronisk hämning av CDK9 (25 nM för 1 vecka) i B16/F10 OVA så att, förutom att hämma CTD fosforylering, 25 nM flavopiridol behandling för 1 vecka förhindrar korrekt post-transkriptionella modifieringar av mRNA på ett oförväntat sätt och effektivt upphäver p-tefb-beroende produktiv förlängning längs långa gener såsom pro-inflammatoriska svar signalering gener, avsevärt förändra deras uttrycksmönster både på mRNA och proteinnivåer. Till det bästa av vår kunskap, det finns ingen annan modell som beskrivs i litteraturen som effektivt uppnår samma.
Detta lätt att etablera, generaliserbart modell av tedefinitivt kan därför utnyttjas för att dissekera, både transkriptionella och epigenetiska modifieringar möjliggör tedefinitivt cancer att anpassa sig till immun-medierad cell attack. Dessutom, denna murin modellen behåller sin TEdefinitivt-liknande minskning av totala och fosho-RNA pol II nivåer 21 dagar efter flavopiridol release i in vivo Tillväxtanalys3 (som inte nämns i protokollet här), vilket tyder på omfattningen av stabiliteten i denna icke-genetisk modell för ytterligare in vivo experiment. Emellertid, försiktighet måste iakttas för att optimera den exakta subletala dosen av flavopiridol för andra murina linjer (t. ex., om 20 nm flavopiridol behandling för 1 vecka är den subletala dosen för MC38 murina carcinoma linje; används inte i detta protokoll), effekterna av variation i cell plätering densitet, odlingsförhållanden, och cytokin stimulering villkor kan variera för olika murina linjer. Det protokoll som beskrivs här ger en grundläggande ram för att minimera de variabler som är kända för att vara kritiska för generering av TEdefinitivt-liknande funktioner genom kronisk CDK9 hämning. Dessutom, mänskliga carcinoma cellinjer, såsom T47D och CAL51 har testats med kortsiktiga (3 dagar) flavopiridol behandlingar som ger upphov till liknande TEdefinitivt-liknande RNA pol II profiler, vilket indikerar nyttan av flavopiridol baserad kronisk hämning av CDK9 medierad transkription töjning att skapa även modell mänskliga linjer för att studera tedefinitivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NCI (CA193549) och CCHMC Research innovation pilot Awards till Kakajan Komurov, och Department of Defense (BC150484) Award till Navneet Singh. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Cancer Institute eller Department of Defense. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
