Artigo de método

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

DOI:

10.3791/59913

10 de julho de 2019

Neste artigo

Resumo

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Aqui, nós apresentamos um protocolo para enriquecer locais de ligação do RNA endógeno ou "pegadas" de complexos do RNA: proteína (RNP) das pilhas de mamífero. Essa abordagem envolve duas imunoprecipitações de subunidades de RNP e, portanto, é apelidado de imunoprecipitação de RNA em tandem (RIPiT).

Resumo

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A imunoprecipitação do RNA em tandem (RIPiT) é um método para enriquecer pegadas do RNA de um par de proteínas dentro de um complexo do RNA: proteína (RNP). O RIPiT emprega duas etapas de purificação. Primeiramente, a imunoprecipitação de um subunidade etiquetado de RNP é seguida pela digestão suave de RNase e pela eluição não-desnaturando subseqüente da afinidade. Uma segunda imunoprecipitação de outra subunidade da RNP permite o enriquecimento de um complexo definido. Depois de uma eluição de desnaturação de RNAs e proteínas, as pegadas de RNA são convertidas em bibliotecas de sequenciamento de DNA de alta produtividade. Ao contrário do mais popular ultravioleta (UV) reticulação seguido por imunoprecipitação (clip) abordagem para enriquecer RBP sites de ligação, RipIt é UV-reticulação independente. Daqui o ripit pode ser aplicado às proteínas numerosas atuais no de do RNA e além de que são essenciais à regulação do RNA mas não contatam diretamente o RNA ou o UV-Crosslink mal ao RNA. As duas etapas da purificação em RIPiT fornecem uma vantagem adicional de identificar os locais obrigatórios onde uma proteína do interesse actua na parceria com um outro cofactor. A dupla estratégia de purificação também serve para melhorar o sinal, limitando o fundo. Aqui, fornecemos um procedimento passo-sábio para executar o RIPiT e para gerar bibliotecas de sequenciamento de alto débito de pegadas de RNA isoladas. Também esboçamos as vantagens e aplicações do RIPiT e discutimos algumas das suas limitações.

Introdução

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Dentro das células, o RNA existe no complexo com proteínas para formar os complexos RNA: protein (RNPs). RNPs são montados em torno das proteínas de ligação do RNA (RBPs, aqueles que ligam diretamente o RNA) mas igualmente compreendem de non-RBPs (aqueles que ligam RBPs mas não o RNA), e são frequentemente dinâmicos na natureza. Rbps e seus cofatores funcionam coletivamente dentro de rnps para executar funções regulatórias. Por exemplo, na via de deterioração de mRNA mediada por disparates (NMD), as proteínas UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) reconhecem o Ribossome prematuramente finalizado. Cada uma das proteínas de UPF pode ligar ao RNA, mas é somente quando montam junto que....

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Protocolo

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1. estabelecimento de linhas de célula HEK293 estáveis expressando tetraciclina-inducible FLAG-Tagged proteína de interesse (POI)

  1. Sementes HEK293 células com um local de meta de recombinação de FLP (FRT) de forma estável em uma densidade de 10 x 104 células/ml em meio de crescimento (Dulbecco ' s modificado médio de Eagle [DMEM] + 10% soro fetal bovino [FBS] + 1% penicilina-estreptomicina [Penn/Strep]) em 6- placas bem. Permita que as pilhas cresçam durante a noite em uma incubadora humidificada em 37 ° c e em 5% CO2 (condições de crescimento padrão para todas as etapas subseqüentes).
  2. No dia seguinte, as células devem ser ~ 70....

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Resultados

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Um RIPiT bem sucedido conduzirá à imunoprecipitação de ambas as proteínas do interesse e de outras proteínas de interação conhecidas, e a ausência de proteínas não-interagindo. Como observado na Figura 3a, ambos os magoh e EIF4AIII foram detectados na eluição do RIPIT, mas HNRNPA1 não foi (pista 6). Paralelamente, as pegadas de RNA que foram copurificadas com os complexos RNP foram detectadas via autoradiografia (Figura 3B) ou B.......

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Discussão

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Discutimos aqui algumas considerações-chave para executar com sucesso o RIPiT. Acima de tudo, IPs individuais devem ser otimizados para alcançar a maior eficiência possível em cada etapa. A quantidade de grânulos do agarose da bandeira para o número de entrada das pilhas descreveu aqui provou ser robusta para uma vasta gama de proteínas que nós testamos. Como apenas uma pequena fração das proteínas parceiras é coimunoprecipitada com a proteína FLAG, a quantidade de anticorpos necessários para o segundo IP eficiente é ger.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela concessão GM120209 de NIH (GS). Os autores agradecem o núcleo de recursos compartilhados da OSUCCC Genomics para seus serviços (CCC support Grant NCI p30 CA16058).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gel de afinidade anti-FLAGSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3.000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µ CiPerkinSeringasDescartáveis Elmer BLU502A250UC
BD com Pontas Luer-Lok (200)Fisher14-823-435
Betaine 5MSigmaB0300
biotina-dATPTriLinkN-5002
biotina-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Sonifier Branson, Modelo SSE-1Branson
CircLigase IVWR76081-606ssDNA ligase I
DMEM, Glicose AltaThermoFisher11995-065
Tampão de carga de DNA NEBNEB
Dynabeads Proteína ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Linha CelularThermoFisherR78007
GeneRuler Escadade DNA de Baixo AlcanceThermoScientificFERSM1203
Hygromycin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 wellBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
adaptador miRCAT-33 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
Mirus transIT-X2 reagente de transfecçãoMirusMIR 6004
Mth RNA ligaseNEBE2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Corante de Carregamento de Gel Roxo (6x)NEB NEB#7025
Q5 DNA PolimeraseNEBM0491S/L
RNase I, E. coli, 1.000 UEppicenterN6901K
Coluna SPIN-XCorningCLS8160-24EA
Grânulos de estreptavidinaThermoFisher60210
Superscript III (SSIII)ThermoScientific18080044enzima transcriptase reversa
SybrGoldThermoFisherS11494corante de gel de ácido nucleico de ouro
T4 Polinucleotídeo Quinase-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetraciclinaSigma87128
Termoestável 5&agudo; App DNA/RNA LigaseNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNGNATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
Qualquerum desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′
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Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191

Referências

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  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E.

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Etiquetas

RNA ImmunoprecipitationRIPiT Seq MethodUV Crosslinking IndependentRNA Footprint AnalysisProtein Complex EnrichmentExon Junction ComplexHEK293 CellsFLAG Agarose BeadsMagnetic Bead ConjugationPhenol Chloroform Extraction

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