Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para enriquecer locais de ligação do RNA endógeno ou "pegadas" de complexos do RNA: proteína (RNP) das pilhas de mamífero. Essa abordagem envolve duas imunoprecipitações de subunidades de RNP e, portanto, é apelidado de imunoprecipitação de RNA em tandem (RIPiT).

Resumo

A imunoprecipitação do RNA em tandem (RIPiT) é um método para enriquecer pegadas do RNA de um par de proteínas dentro de um complexo do RNA: proteína (RNP). O RIPiT emprega duas etapas de purificação. Primeiramente, a imunoprecipitação de um subunidade etiquetado de RNP é seguida pela digestão suave de RNase e pela eluição não-desnaturando subseqüente da afinidade. Uma segunda imunoprecipitação de outra subunidade da RNP permite o enriquecimento de um complexo definido. Depois de uma eluição de desnaturação de RNAs e proteínas, as pegadas de RNA são convertidas em bibliotecas de sequenciamento de DNA de alta produtividade. Ao contrário do mais popular ultravioleta (UV) reticulação seguido por imunoprecipitação (clip) abordagem para enriquecer RBP sites de ligação, RipIt é UV-reticulação independente. Daqui o ripit pode ser aplicado às proteínas numerosas atuais no de do RNA e além de que são essenciais à regulação do RNA mas não contatam diretamente o RNA ou o UV-Crosslink mal ao RNA. As duas etapas da purificação em RIPiT fornecem uma vantagem adicional de identificar os locais obrigatórios onde uma proteína do interesse actua na parceria com um outro cofactor. A dupla estratégia de purificação também serve para melhorar o sinal, limitando o fundo. Aqui, fornecemos um procedimento passo-sábio para executar o RIPiT e para gerar bibliotecas de sequenciamento de alto débito de pegadas de RNA isoladas. Também esboçamos as vantagens e aplicações do RIPiT e discutimos algumas das suas limitações.

Introdução

Dentro das células, o RNA existe no complexo com proteínas para formar os complexos RNA: protein (RNPs). RNPs são montados em torno das proteínas de ligação do RNA (RBPs, aqueles que ligam diretamente o RNA) mas igualmente compreendem de non-RBPs (aqueles que ligam RBPs mas não o RNA), e são frequentemente dinâmicos na natureza. Rbps e seus cofatores funcionam coletivamente dentro de rnps para executar funções regulatórias. Por exemplo, na via de deterioração de mRNA mediada por disparates (NMD), as proteínas UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) reconhecem o Ribossome prematuramente finalizado. Cada uma das proteínas de UPF pode ligar ao RNA, mas é somente quando montam junto que....

Protocolo

1. estabelecimento de linhas de célula HEK293 estáveis expressando tetraciclina-inducible FLAG-Tagged proteína de interesse (POI)

1. Sementes HEK293 células com um local de meta de recombinação de FLP (FRT) de forma estável em uma densidade de 10 x 10⁴ células/ml em meio de crescimento (Dulbecco ' s modificado médio de Eagle [DMEM] + 10% soro fetal bovino [FBS] + 1% penicilina-estreptomicina [Penn/Strep]) em 6- placas bem. Permita que as pilhas cresçam durante a noite em uma incubadora humidificada em 37 ° c e em 5% CO₂ (condições de crescimento padrão para todas as etapas subseqüentes).
2. No dia seguinte, as células devem ser ~ 70....

Resultados

Um RIPiT bem sucedido conduzirá à imunoprecipitação de ambas as proteínas do interesse e de outras proteínas de interação conhecidas, e a ausência de proteínas não-interagindo. Como observado na Figura 3a, ambos os magoh e EIF4AIII foram detectados na eluição do RIPIT, mas HNRNPA1 não foi (pista 6). Paralelamente, as pegadas de RNA que foram copurificadas com os complexos RNP foram detectadas via autoradiografia (Figura 3B) ou B.......

Discussão

Discutimos aqui algumas considerações-chave para executar com sucesso o RIPiT. Acima de tudo, IPs individuais devem ser otimizados para alcançar a maior eficiência possível em cada etapa. A quantidade de grânulos do agarose da bandeira para o número de entrada das pilhas descreveu aqui provou ser robusta para uma vasta gama de proteínas que nós testamos. Como apenas uma pequena fração das proteínas parceiras é coimunoprecipitada com a proteína FLAG, a quantidade de anticorpos necessários para o segundo IP eficiente é ger.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gel de afinidade anti-FLAG	Sigma	A2220
ATP, [γ-32P]- 3.000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µ Ci	PerkinSeringas	Descartáveis Elmer BLU502A250UC
BD com Pontas Luer-Lok (200)	Fisher	14-823-435
Betaine 5M	Sigma	B0300
biotina-dATP	TriLink	N-5002
biotina-dCTP	Perkin Elmer	NEL540001EA
Sonifier Branson, Modelo SSE-1	Branson
CircLigase I	VWR	76081-606	ssDNA ligase I
DMEM, Glicose Alta	ThermoFisher	11995-065
Tampão de carga de DNA NEB	NEB
Dynabeads Proteína A	LifeTech	10002D
Flp-In-T-REx 293 Linha Celular	ThermoFisher	R78007
GeneRuler Escada	de DNA de Baixo AlcanceThermoScientific	FERSM1203
Hygromycin B	ThermoFisher	10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well	Bio-Rad	4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel	Bio-Rad	4566033
adaptador miRCAT-33 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
Mirus transIT-X2 reagente de transfecção	Mirus	MIR 6004
Mth RNA ligase	NEB	E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)	Fisher	BP1752I-100
Corante de Carregamento de Gel Roxo (6x)	NEB NEB	#7025
Q5 DNA Polimerase	NEB	M0491S/L
RNase I, E. coli, 1.000 U	Eppicenter	N6901K
Coluna SPIN-X	Corning	CLS8160-24EA
Grânulos de estreptavidina	ThermoFisher	60210
Superscript III (SSIII)	ThermoScientific	18080044	enzima transcriptase reversa
SybrGold	ThermoFisher	S11494	corante de gel de ácido nucleico de ouro
T4 Polinucleotídeo Quinase-2500U	NEB	M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q	NEB	M0351S
Tetraciclina	Sigma	87128
Termoestável 5&agudo; App DNA/RNA Ligase	NEB	M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNGNATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Qualquer		um desses protocolos é compatível apenas com a plataforma de sequenciamento Illumina
Typhoon 5 Bimolecular Imager	GE Healthcare Life Science	29187191