Method Article

Otimização, design e evitando armadilhas em manual multiplex fluorescente imuno-histoquímica

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A avaliação do microambiente do tecido intacto para análise da infiltração celular e da organização espacial é essencial para a compreensão da complexidade dos processos da doença. As técnicas do princípio usadas no passado incluem immunohistochemistry (IHC) e imunofluorescência (se) que permitem o visualização das pilhas como um instantâneo a tempo usando entre 1 e 4 marcadores. Ambas as técnicas têm deficiências, incluindo dificuldade em manchar alvos pouco antigênicos e limitações relacionadas à reatividade entre espécies. IHC é confiável e reprodutível, mas a natureza da química e dependência do espectro de luz visível permite que apenas alguns marcadores para ser usado e faz colocalização desafiador. O uso de IF amplia os marcadores potenciais, mas tipicamente depende do tecido congelado devido à extensa autofluorescência tecidual após fixação de formalina. A citometria de fluxo, uma técnica que permite a rotulagem simultânea de múltiplos Epitopes, AB roga muitas das deficiências de If e de IHC, entretanto, a necessidade de examinar pilhas como uma única suspensão da pilha perde o contexto espacial das pilhas que descartam importante biológico Relações. Multiplex fluorescente imunoistoquímica (mfIHC) pontes estas tecnologias permitindo multi-epitope fenotipagem celular em formalina fixa parafina incorporado (FFPE) tecido, preservando a arquitetura global do microambiente e espacial relação de células dentro do tecido intacto ininterrompido. Os fluoróforos fluorescentes elevados da intensidade que lig covalentemente ao epítopo mapeado do tecido permitem aplicações múltiplas de anticorpos preliminares sem preocupação da Cruz-reactividade específica da espécie por anticorpos secundários. Embora esta tecnologia tenha sido comprovada para produzir imagens confiáveis e precisas para o estudo da doença, o processo de criação de uma estratégia de coloração útil mfIHC pode ser demorado e exigente devido à extensa otimização e design. Para fazer imagens robustas que representem interações celulares precisas in situ e para mitigar o período de otimização para a análise manual, apresentamos aqui métodos para preparação de slides, otimização de anticorpos, design multiplex, bem como erros comumente encontrados durante o processo de coloração.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O visualização de um microambiente intacto do tumor (TME) é essencial em avaliar não somente a infiltração celular em malignidades contínuas mas a pilha às interações da pilha também. O multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfihc) emergiu como uma ferramenta eficaz para o fenotipagem do multi-antígeno das pilhas no estudo do cancro e das doenças associadas1,2,3,4, 5,6,7. Isso, em combinação com novos softwares e programas projetad....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todo o trabalho foi aprovado pelo Conselho de revisão interno da Universidade de Michigan.

1. otimizando os anticorpos primários e a preparação de slides

  1. Determine a concentração ideal de anticorpos para multiplex usando o IHC convencional.
    1. Teste os anticorpos para o multiplex pelo immunohistochemistry convencional manual (IHC)13.
    2. Use tecidos específicos que têm um tipo abundante da pilha para cada anticorpo testado tal como o uso do tecido da amígdala para o teste do anticorpo CD3.
    3. Use a concentração de referência para o IHC recomendado pela empresa e, em seguida, complete o IHC c....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O processo geral de obtenção de um ensaio multiplex de 7 cores segue um padrão repetitivo. A Figura 1 descreve o processo em um formulário diagramático. Uma vez que os slides são cortados e secos ou são recebidos do laboratório e cozido em um forno de hibridação a 60 ° c para 1 h, em seguida, proceder à desparaffinização e reidratação, fixar as lâminas em formalina novamente seguido pela recuperação do antígeno. Cada rodada de multiplexação começa na recuperação do antígeno e termina na remo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os espécimes intactos do tecido da biópsia contínua do tumor e do resection cirúrgico permanecem ferramentas diagnósticas e preditivas importantes para a análise da doença assim como o prognóstico paciente. Multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfIHC) é uma técnica nova que combine os benefícios do immunohistochemistry (IHC), da imunofluorescência (se) e do fluxo cytometry. Métodos prévios para sondar as células in situ permitiram a avaliação de arranjos célula a célula em um ambiente tecidual8

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por sua assistência com a configuração e otimização da coloração multiplex original. Os autores também gostariam de agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por dicas usando o software de análise. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelos institutos nacionais de câncer de saúde o prêmio número P30CA046592, K08CA201581 (Tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos instituto....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% etanolFisherHC8001GAL
70% etanolFisherHC10001GL
95% etanolFisherHC11001GL
Software de análiseAkoya BiosciencesCLS135783inForm versão 2.3.0
Montagem antidesbotamentoThermoFisherP36961ProLong
Diamond Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Cover SlipsFisher12-548-5E
Limpeza de tarefa delicadaKimberly-Clark34120
Diluente fluorescenteAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA diluente
Fluorophore 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Fluoróforo 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluoróforo 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluoróforo 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluoróforo 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluoróforo 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluoróforo DAPIAkoya BiosciencesFP14903 gotas em TBST ou PBS
Caixa resistente ao calorTissue-Tek25608-904Caixa de slides de plástico-verde
UmidificadaIbi ScientificAT-12
Forno de hibridizaçãoFisherBiotech
Caneta de barreira hidrofóbicaVectorH-4000ImmEdge
microscópioPerkin ElmerCLS140089Mantra estação de trabalho de patologia quantitativa
MicroondasPanasonicNN-A661Scom tecnologia de inversor
Formalina tamponada neutraFisher ScientificSF100-410% tampão de recuperação de antígeno de formalina tamponada neutra
pH 6Akoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 tampão de recuperação de antígenoAkoya BiosciencesAR900AR9
Solução salina tamponada com fosfatoFisherBP3994PBS
Caixa deslizante de plásticoTissue-Tek25608-906
Filme plásticoFisherNC9070936
Polissorbato 20FisherBP337-800Tween 20
Primário anticorpo CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Anticorpo primário CD3DakoA04521:400
Anticorpo primário CD8Spring BioM53901:400
Anticorpo primário FOXP3DakoM35151:400
Anticorpo primário pancitoqueratinaSinalização celular126531:500
Anticorpo primário PD-L1Célula Sinalização136841:200
Anticorpo secundárioAkoya BiosciencesARH1001EAPolímero Opala
Conjunto de coloração de lâminaMicroscopia Eletrônica Sciences6254001
Tris tamponado com solução salinaCorning46-012-CMTBS
Rack de slides verticalMicroscopia Eletrônica Sciences50-294-72
XyleneFisher
Câmara X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles