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Artigo de método

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

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DOI:

10.3791/59926

⸱

25 de junho de 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.

Resumo

Executar ensaios baseados em anticorpos para a coleta de insulina secretada pós-amostra geralmente requer algumas horas para um dia de tempo de ensaio e pode ser caro, dependendo do ensaio específico. Os ensaios de luciferase secretados aceleram os resultados e reduzem substancialmente o custo do ensaio por amostra. Aqui nós apresentamos uma aproximação relativamente subutilizado para avaliar a atividade secretora do insulin das pilhas do β pancreatic usando o luciferase do Gaussia introduzido genetically dentro do C-peptide. Durante o processamento proteolítico do proinsulin, o C-peptide é extirpado liberando o luciferase dentro do vesícula secretora do insulin onde é cosecretado com insulin. Os resultados podem ser obtidos em poucos minutos após a coleta da amostra por causa da velocidade dos ensaios de luciferase. Uma limitação do ensaio é que é uma medida relativa da secreção de insulina e não uma quantitação absoluta. Entretanto, este protocolo é econômico, evolutivo, e pode ser executado usando a maioria de leitores padrão da placa da luminescência. As pipetas multicanais analógicas e digitais facilitam várias etapas do ensaio. Muitas variações experimentais diferentes podem ser testadas simultaneamente. Uma vez que um conjunto focado de condições são decididas, as concentrações de insulina devem ser medidas diretamente usando ensaios baseados em anticorpos com curvas padrão para confirmar os resultados do ensaio luciferase.

Introdução

O método apresentado aqui permite que a secreção de insulina de uma linha de célula beta geneticamente modificada seja ensaiada rapidamente e de forma acessível no formato 96-well-Plate. A chave a este protocolo é uma versão modificada do insulin com o luciferase naturalmente-secreted da Gaussia (gluc, ~ 18 KDa) introduzido ( Veja Figura 1) no C-peptide para gerar o insulin-Gaussia (insgluc)1,2. Outras proteínas maiores, como a GFP (~ 25 kDa), foram inseridas com sucesso no peptídeo C de insulina e exibiram o processamento pós-translacional esperado de proinsulina-GFP para insulina e GFP-C-peptídeo3,4. Para o ensaio neste protocolo, o gluc foi aperfeiçoado Codon para a expressão dos mamíferos e duas mutações foram introduzidas para realçar a cinética Glow-like5,6. Múltiplas combinações e repetições de condições de tratamento podem ser facilmente testadas em formato 96-bem-Plate e os resultados da secreção podem ser obtidos imediatamente após o experimento.

Uma vantagem principal, como observado previamente2, é o baixo custo desta medida da secreção luciferase-baseada (< $0.01/well) que o diferencia dos custos e dos aspectos técnicos relativamente mais elevados de ensaios enzima-lig da imunoabsorção (ELISAs) ( > $2/bem) e a fluorescência tempo-resolvida homogénea (HTRF) ou a outra transferência da energia da ressonância de Förster (FRET)-baseou o anticorpo (> $1/well) ensaios. Em comparação com estes ensaios baseados em anticorpos, que medem a concentração de insulina referenciando uma curva padrão, o ensaio InsGLuc mede a atividade secretora como uma comparação relativa aos poços de controle na placa. Por esse motivo, cada experimento requer a inclusão de controles adequados. Esta distinção é um trade-off para permitir medições rápidas e baratas. No entanto, a secreção de insgluc demonstrou ser altamente correlacionada com a secreção de insulina,medida por Elisa1,2. Esta tecnologia foi dimensionada para a triagem de alta taxa de transferência1,2,7 e levou à identificação de novos moduladores de secreção de insulina, incluindo um inibidor de canal de potássio voltagem-gated7 bem como um inibidor de produto natural da função de célula β, a cromomicina a28. O uso de InsGLuc é mais adequado para pesquisadores que planejam continuamente testar muitas condições de tratamento diferentes para o seu impacto na secreção de insulina. Em experimentos de acompanhamento é necessário repetir os principais achados em uma linha celular β parental, e otimamente em ilhotas murinas ou humanas, e medir a secreção de insulina usando um ensaio baseado em anticorpos.

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Protocolo

1. preparação de reagentes, suportes e amortecedores (tabela 1)

  1. Prepare MIN6 mídia completa em 500 mL de alta glicose (4,5 g/L) o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com os seguintes aditivos: 15% soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 292 μg/mL L-glutamina e 50 μM β-Mercaptoetanol.
    Nota: a linha celular estável neste caso é mantida em 250 μg/mL de antibiótico G418.
  2. Prepare o tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRBH) fazendo uma solução contendo 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2e 1 mg/ml radioimunoensaio-grau de albumina sérica bovina (BSA). A glicose deve ser adicionada quando especificado a partir de um estoque de 2 M.
    Nota: KRBH é utilizado para incubar as células com e sem estimulação, a fim de avaliar a insulina e/ou Gaussia luciferase secreção.
  3. Prepare a solução de estoque de Coelenterazina (CTZ) da seguinte maneira. Prepare o metanol acidificado adicionando 106 μL de HCl concentrado a 10 mL de metanol. Em seguida, dissolva a CTZ liofilizada em metanol acidificado a 1 mg/mL e armazene a-80 ° c em tubos com tampa de rosca.
    Nota: Estes estoques mantêm a atividade suficiente em ensaios rotineiros da luciferase, mesmo depois de 1 ano do armazenamento apropriado.
  4. Prepare o tampão do ensaio da luciferase de Gaussia (GLuc) baseado na literatura9 as well as a informação10 da patente para ajudar na meia-vida do ensaio da luciferase de Gaussia no formato da placa do poço 96. Use a fórmula: 25 mM TRIS pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/mL nd2po4, 300 mm ascorbato de sódio, 200 mm na2so3 em água. Congelar estoques em-20 ° c. Depois de descongelar, guarde o tampão a 4 ° c.
  5. Para preparar a solução de trabalho da Gaussia luciferase, adicione 4,2 μL/mL da solução em estoque de 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ ao tampão do ensaio GLuc. Isso resulta em uma solução de trabalho 2x de 10 μM de CTZ que terá uma concentração final de 5 μM no ensaio.

2. cultura de InsGLuc MIN6 células e semeadura para ensaios de secreção

  1. Para cultura MIN6 células, Trypsinize e semente as células uma vez por semana usando técnicas de cultura de células padrão. Mude a mídia nas células a cada dois a três dias. Inclua o antibiótico de seleção apropriado, como 250 μg/mL de G418 na mídia.
    1. Para fornecer um número suficiente de células semanalmente para experimentos, mantenha as células em T75 frascos. Semeando 6 x 106 células por T75 em 10 ml de mídia normalmente produzirá 30 x 106 para 40 x 106 células total por T75 após 7 dias de cultura.
  2. Para preparar as células para o revestimento em placas 96-well, lave um T75 confluente de células MIN6 InsGLuc duas vezes com PBS e adicione 2 mL de tripsina. Incubar a 37 ° c durante ~ 5 min ou até que as células se dissociem do balão. Determine a concentração de células por mililitro.
    1. Diluir as células na mídia completa para 1 x 106 células/ml para resultar em 1 x 105 células em 100 μl por poço em uma placa 96-bem. As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após 3 – 4 dias.
      Nota: para estender o período da cultura, a metade da concentração da pilha pode ser chapeada. As alterações na mídia não são necessárias antes do dia do ensaio, a menos que as células devam ser submetidas a tratamentos experimentais.

3. glicose-estimulado Gaussia luciferase ensaio de secreção

  1. No dia do ensaio Prepare KRBH suficiente para o experimento (etapa 1,2). Um mínimo de 50 mL de KRBH por placa de 96 poços é necessário, portanto, prepare pelo menos 75 mL para garantir uma reserva suficiente para o experimento. Prepare o amortecedor extra se as combinações diferentes de condições do tratamento da droga exigirem KRBH para a diluição.
  2. Prepare um reservatório com KRBH sem glicose. Decantar o meio de 96-bem placa (s), invertendo rapidamente a placa sobre um dissipador de laboratório e, em seguida, blot firmemente em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de meio.
  3. Usando uma pipeta eletrônica ou manual de 8 canais, Pipete 100 μL/poço KRBH do reservatório em toda a placa (s) de 96 poços. Repita para um total de duas lavas.
  4. (Etapa opcional de tratamentos compostos agudos) Se não estiver realizando tratamentos medicamentoso, prossiga com as etapas 3,5 e 3,6 sem modificação. Para testar os efeitos de pequenas moléculas na secreção de insulina, os compostos podem ser adicionados às células durante o período de pré-incubação, período de estimulação, ou ambos.
    1. Uma técnica é adicionar compostos em lote ao KRBH em tubos de 1,5 mL e usar uma pipeta digital ajustável de 8 canais para transferir a droga-KRBH dos tubos para as células em placas 96-well.
      Nota: se uma pipeta ajustável não está disponível, uma placa 96-well da réplica da medicina-KRBH pode ser feita e uma pipeta padrão de 8 canais pode ser usada para transferir o amortecedor. Outras modificações no paradigma do tratamento podem ser feitas para tratar as células por 24 h nos meios de comunicação prévio ao ensaio, conforme descrito anteriormente1,8.
  5. Adicione 100 μL de KRBH contendo a concentração desejada de glicose ou compostos e coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h.
    Nota: dependendo do layout experimental, é extremamente útil ter uma pipeta multicanal eletrônica que permite a transição das distâncias do canal de uma coluna de oito tubos de 1,5 mL para as 8 fileiras de uma placa de 96 poços.
  6. Após o 1 h de pré-incubação, decantar o tampão no dissipador e borrar firmemente na toalha de papel. Adicionar 100 μL de KRBH sem glucose por poço para lavar o fundo acumulado da Gaussia luciferase. Decantar a placa novamente e adicionar condições de controle e estimulantes à placa em 100 μL por poço. Coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h.
  7. Colete cuidadosamente 50 μL de sobrenadante usando uma pipeta multicanal, alterando as pontas entre as condições de tratamento conforme necessário, e transfira o sobrenadante para uma placa de ensaio branco opaco limpa 96-bem.
    Nota: placas de fundo claro com paredes brancas podem ser usadas se necessário, embora uma quantidade significativa de sinal de luciferase seja perdida.
  8. Após a coleta de 50 μL de sobrenadante KRBH, a amostra pode ser ensaiada imediatamente. Se necessário, sele e armazene amostras em 4 ° c por alguns dias (meia-vida da atividade do gluc ~ 6 dias) ou-20 ° c por até um mês11,12.

4. ensaio secretado da luciferase da Gaussia

  1. Para preparar a solução de trabalho do ensaio GLuc, pipete a quantidade necessária de solução de estoque de CTZ (4,2 μL/mL) no tampão de ensaio GLuc. Para evitar aquecer o CTZ, pipete o CTZ rapidamente no congelador-80 ° c ou mantenha o tubo em gelo seco.
  2. Utilizando uma pipeta multicanal electrónica, adicione rapidamente 50 μL da solução de trabalho de ensaio GLuc por poço em todo o prato de 96 poços contendo os sobrenadantes KRBH recolhidos. Se houver qualquer gota nas laterais de qualquer poços, gire brevemente a placa em uma mesa-Top centrífuga swing-balde.
  3. Leia a luminescência em um leitor de placa adequado dentro de alguns minutos e ler cada poço com um tempo de integração de 0,1 s.

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Resultados

Para avaliar o desempenho do ensaio condições de controle, uma curva de dose-resposta de glicose simples ou uma estimulação usando o paradigma de diazóxido podem ser concluídas. No caso do primeiro, a pré-incubação das células para 1 h em condições livres de glicose seguidas pelo tratamento de 1 h com concentrações crescentes de glicose deve resultar em pouca atividade secretora e abaixo de 5 mM, enquanto o aumento da secreção é observado acima de 8 mM de glicose (Fig...

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Discussão

Nisto nós apresentamos um método para avaliar ràpida as respostas glicose-estimuladas da secreção do insulin das pilhas de MIN6 β. Para as melhores respostas no ensaio é importante para sementes as células MIN6 na densidade adequada e permitir-lhes tornar-se 85-95% confluente. Isto melhora respostas da pilha β à glicose por causa dos contatos e da sincronização melhorados da pilha-pilha, que ocorre ambos nas ilhotas preliminares17,18,...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a todos os membros atuais e antigos do laboratório de Cobb por trabalho valioso e discussões, e Dionne Ware para assistência administrativa. Michael Kalwat é apoiado por um juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Este trabalho foi possibilitido através da NIH R37 DK34128 e da Welch Foundation Grant I1243 para Melanie Cobb. As partes adiantadas deste trabalho foram apoiadas igualmente por um NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais de cultura de células
rIns-GLuc célulasLinha celular parental MIN6 expressando de forma estável pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc e mantida em 250 ug/ml G418
DMEMSigmaD64294,5 g/L de meio de glicose
soro bovino fetal, inativadopor calor SigmaF4135
Penicilina/ EstreptomicinaThermo-Fisher ScientificSV30010
beta-mercaptoetanolThermo-Fisher ScientificBP 176-100
glutamina Thermo-Fisher ScientificBP379-100
Tripsina-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Solução estoque 250 mg/mL em água. Congelar alíquotas a -20C.
Frascos de cultura de tecidos T75Fisher Scientific07-202-000
Placas de cultura de tecidos de 96 poçosCelltreat229196
Reservatórios de reagentes (50 mL)Corning4870
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Reagentes de ensaio de secreção
BSA (grau RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-GlicoseSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7,4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Medicamentos opcionais para experimentos de estimulação
DiazoxideSigmaD9035Solução de estoque: 50 mM em NaOH 0,1N. Adicione uma quantidade igual de HCl 0,1N a qualquer tampão onde o diazóxido seja adicionado.
epinefrina (sal de bitartarato)SigmaE4375Solução de estoque: 5 mM em água
PMA (forbol 12-miristato)SigmaP1585Solução de estoque: 100 µ M em DMSO
strong>NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais de ensaio Guassia
Fosfato dissódico (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
GlicerolThermo-Fisher ScientificG334
Brometo de SódioThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Solução de estoque: 0,5 M pH 8
Base TrisRPIT60040-1000.0Solução de estoque: 1 M pH 8
Ácido AscórbicoFisher ScientificAAA1775922A patente dos EUA US7718389 sugeriu que o ascorbato pode aumentar a estabilidade da celenterazina.
Na2SO3SigmaS0505-250GPatente dos EUA US8367357 sugerido que o sulfito pode diminuir o fundo devido à BSA
Coelenterazina (nativa)Nanolight / Prolume3035MGSolução estoque: 1 mg/ml em MeOH acidificado (2,36 mM)
OptiPlate-96, Microplaca Opaca Branca de 96 poçosPerkin Elmer6005290Qualquer placa branca opaca de 96 poços deve ser suficiente. Placas inferiores transparentes também funcionarão, no entanto, algum sinal será perdido.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Synergy H1 Leitor de placas híbrido ou equivalenteBioTek8041000É necessário um leitor de placas com detecção de luminescência e capacidade de placas de 96 poços.
Pipeta VOYAGER de 8 canais (50-1250 µ L)Integra4724Uma pipeta multicanal automatizada é extremamente útil para a adição rápida de reagentes de luciferase e células de plaqueamento em formato de 96 poços
canais 200 µ Pipeta LTransferpette S 20-200 µ L2703710
MIN6 estáveis < 8

Referências

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