Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Executar ensaios baseados em anticorpos para a coleta de insulina secretada pós-amostra geralmente requer algumas horas para um dia de tempo de ensaio e pode ser caro, dependendo do ensaio específico. Os ensaios de luciferase secretados aceleram os resultados e reduzem substancialmente o custo do ensaio por amostra. Aqui nós apresentamos uma aproximação relativamente subutilizado para avaliar a atividade secretora do insulin das pilhas do β pancreatic usando o luciferase do Gaussia introduzido genetically dentro do C-peptide. Durante o processamento proteolítico do proinsulin, o C-peptide é extirpado liberando o luciferase dentro do vesícula secretora do insulin onde é cosecretado com insulin. Os resultados podem ser obtidos em poucos minutos após a coleta da amostra por causa da velocidade dos ensaios de luciferase. Uma limitação do ensaio é que é uma medida relativa da secreção de insulina e não uma quantitação absoluta. Entretanto, este protocolo é econômico, evolutivo, e pode ser executado usando a maioria de leitores padrão da placa da luminescência. As pipetas multicanais analógicas e digitais facilitam várias etapas do ensaio. Muitas variações experimentais diferentes podem ser testadas simultaneamente. Uma vez que um conjunto focado de condições são decididas, as concentrações de insulina devem ser medidas diretamente usando ensaios baseados em anticorpos com curvas padrão para confirmar os resultados do ensaio luciferase.
Introdução
O método apresentado aqui permite que a secreção de insulina de uma linha de célula beta geneticamente modificada seja ensaiada rapidamente e de forma acessível no formato 96-well-Plate. A chave a este protocolo é uma versão modificada do insulin com o luciferase naturalmente-secreted da Gaussia (gluc, ~ 18 KDa) introduzido ( Veja Figura 1) no C-peptide para gerar o insulin-Gaussia (insgluc)1,2. Outras proteínas maiores, como a GFP (~ 25 kDa), foram inseridas com sucesso no peptídeo C de insulina e exibiram o processamento pós-translacional esperado de proinsulina....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparação de reagentes, suportes e amortecedores (tabela 1)
- Prepare MIN6 mídia completa em 500 mL de alta glicose (4,5 g/L) o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com os seguintes aditivos: 15% soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 292 μg/mL L-glutamina e 50 μM β-Mercaptoetanol.
Nota: a linha celular estável neste caso é mantida em 250 μg/mL de antibiótico G418. - Prepare o tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRBH) fazendo uma solução contendo 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2e 1 mg/ml radioimunoensaio-grau ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para avaliar o desempenho do ensaio condições de controle, uma curva de dose-resposta de glicose simples ou uma estimulação usando o paradigma de diazóxido podem ser concluídas. No caso do primeiro, a pré-incubação das células para 1 h em condições livres de glicose seguidas pelo tratamento de 1 h com concentrações crescentes de glicose deve resultar em pouca atividade secretora e abaixo de 5 mM, enquanto o aumento da secreção é observado acima de 8 mM de glicose (Fig.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Nisto nós apresentamos um método para avaliar ràpida as respostas glicose-estimuladas da secreção do insulin das pilhas de MIN6 β. Para as melhores respostas no ensaio é importante para sementes as células MIN6 na densidade adequada e permitir-lhes tornar-se 85-95% confluente. Isto melhora respostas da pilha β à glicose por causa dos contatos e da sincronização melhorados da pilha-pilha, que ocorre ambos nas ilhotas preliminares17,18,.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a todos os membros atuais e antigos do laboratório de Cobb por trabalho valioso e discussões, e Dionne Ware para assistência administrativa. Michael Kalwat é apoiado por um juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Este trabalho foi possibilitido através da NIH R37 DK34128 e da Welch Foundation Grant I1243 para Melanie Cobb. As partes adiantadas deste trabalho foram apoiadas igualmente por um NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais de cultura de células | |||
| rIns-GLuc células | Linha celular parental MIN6 expressando de forma estável pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc e mantida em 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4,5 g/L de meio de glicose |
| soro bovino fetal, inativado | por calor Sigma | F4135 | |
| Penicilina/ Estreptomicina | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoetanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamina Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | ||
| Tripsina-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Solução estoque 250 mg/mL em água. Congelar alíquotas a -20C. |
| Frascos de cultura de tecidos T75 | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| Placas de cultura de tecidos de 96 poços | Celltreat | 229196 | |
| Reservatórios de reagentes (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes de ensaio de secreção | |||
| BSA (grau RIA) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glicose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7,4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Medicamentos opcionais para experimentos de estimulação | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Solução de estoque: 50 mM em NaOH 0,1N. Adicione uma quantidade igual de HCl 0,1N a qualquer tampão onde o diazóxido seja adicionado. |
| epinefrina (sal de bitartarato) | Sigma | E4375 | Solução de estoque: 5 mM em água |
| PMA (forbol 12-miristato) | Sigma | P1585 | Solução de estoque: 100 µ M em DMSO |
| strong>Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Materiais de ensaio Guassia | |||
| Fosfato dissódico (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glicerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Brometo de Sódio | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Solução de estoque: 0,5 M pH 8 |
| Base Tris | RPI | T60040-1000.0 | Solução de estoque: 1 M pH 8 |
| Ácido Ascórbico | Fisher Scientific | AAA1775922 | A patente dos EUA US7718389 sugeriu que o ascorbato pode aumentar a estabilidade da celenterazina. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | Patente dos EUA US8367357 sugerido que o sulfito pode diminuir o fundo devido à BSA |
| Coelenterazina (nativa) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Solução estoque: 1 mg/ml em MeOH acidificado (2,36 mM) |
| OptiPlate-96, Microplaca Opaca Branca de 96 poços | Perkin Elmer | 6005290 | Qualquer placa branca opaca de 96 poços deve ser suficiente. Placas inferiores transparentes também funcionarão, no entanto, algum sinal será perdido. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Synergy H1 Leitor de placas híbrido ou equivalente | BioTek | 8041000 | É necessário um leitor de placas com detecção de luminescência e capacidade de placas de 96 poços. |
| Pipeta VOYAGER de 8 canais (50-1250 µ L) | Integra | 4724 | Uma pipeta multicanal automatizada é extremamente útil para a adição rápida de reagentes de luciferase e células de plaqueamento em formato de 96 poços |
| canais 200 µ Pipeta L | Transferpette S 20-200 µ L | 2703710 |
Referências
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
