Artigo de método

Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda

DOI:

10.3791/59942

⸱

19 de fevereiro de 2020

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Yamanashi School of Medicine, 2Shimadzu Corporation

Neste artigo

Resumo

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Este artigo introduz métodos de preparação de amostras para um método analítico único em tempo real baseado na espectrometria de massa ambiente. Este método nos permite realizar a análise em tempo real das moléculas biológicas in vivo sem nenhum pré-tratamento especial.

Resumo

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A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta poderosa em química analítica porque fornece informações muito precisas sobre moléculas, como proporções de massa para carga(m/z),que são úteis para deduzir pesos moleculares e estruturas. Embora seja essencialmente um método analítico destrutivo, os recentes avanços na técnica de ionização ambiental nos permitiram adquirir dados, deixando o tecido em um estado relativamente intacto em termos de integridade. A ionização de eletrospray de sonda (PESI) é um método direto chamado porque não requer pré-tratamento complexo e demorado de amostras. Uma agulha fina serve como catador de amostras, bem como um emissor de ionização. Com base na propriedade muito afiada e fina da ponta da sonda, a destruição das amostras é mínima, permitindo-nos adquirir as informações moleculares em tempo real de seres vivos in situ. Aqui, introduzimos três aplicações da técnica PESI-MS que serão úteis para pesquisa e desenvolvimento biomédico. Trata-se da aplicação ao tecido sólido, que é a aplicação básica dessa técnica para o diagnóstico médico. Como esta técnica requer apenas 10 mg da amostra, pode ser muito útil nos ambientes clínicos de rotina. A segunda aplicação é para diagnósticos médicos in vitro onde o soro sanguíneo humano é medido. A capacidade de medir amostras de fluidos também é valiosa em vários experimentos biológicos onde um volume suficiente de amostra para técnicas analíticas convencionais não pode ser fornecido. A terceira aplicação se inclina para a aplicação direta de agulhas de sonda em animais vivos, onde podemos obter dinâmicas em tempo real de metabólitos ou drogas em órgãos específicos. Em cada aplicação, podemos inferir as moléculas que foram detectadas pela ESM ou usar inteligência artificial para obter um diagnóstico médico.

Introdução

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Espectrometria de massa (MS) é uma realização tecnológica do reducionismo; reduz o objeto de análise a uma unidade que pode ser interpretada com base em espécies moleculares ou cascatas. Portanto, é um método representativo de química analítica. É composto por quatro processos: ionização, análise, detecção e aquisição espectral. Como a ionização da molécula é o primeiro processo de espectrometria em massa, ela geralmente restringe a forma dos analytes a serem processados. A maioria dos procedimentos de ionização requerem a destruição da estrutura, morfologia e processos biológicos em tempo real de amostras orgânicas. Por exemplo, a ionização de eletrospray (ESI) exige que as amostras estejam em estado líquido para ionização eficiente1. As amostras, portanto, devem passar por uma complexa preparação bioquímica, que altera a composição das moléculas. Alternativamente, enquanto a desorização do laser auxiliado por matriz (MALDI) pode reconstruir mapas moleculares de tecido seccionado fino2,3, sua eficiência de ionização é muito baixa para detectar todas as moléculas nas amostras, e é particularmente ruim em analisar ácidos graxos. Considerando essas limitações, a ionização de eletrospray de sonda (PESI)4 pode ser usada para observar as mudanças em tempo real nos sistemas biológicos in situ sem destruir a integridade estrutural5, enquanto o organismo biológico observado está tecnicamente em um estado vivo. Uma agulha muito fina é usada neste caso que serve simultaneamente como um catador de amostras e um emissor de íons. Isso significa que as complexas sequências de pré-tratamento amostral podem ser contornadas para obter espectros de massa que refletem os componentes moleculares do sistema vivo in situ.

Existem vários outros métodos de ionização que rivalizam com pesi-ms. Um deles é a espectrometria rápida de ionização evaporativa (REIMS)6. Essa técnica funciona bem durante a cirurgia porque é montada com uma faca elétrica e recolhe a pluma de íon gerada durante a incisão. Embora o REIMS seja muito útil para a cirurgia, é essencialmente um método destrutivo que requer a ablação elétrica do tecido. Portanto, não é útil para a análise detalhada de células e tecidos em uma amostra preparatória ou em análises laboratoriais. Além disso, por coletar uma grande quantidade de pluma contendo detritos teciduais, requer uma manutenção longa dos dispositivos após cada uso, limitando assim o uso desta máquina a procedimentos cirúrgicos especiais. Um método semelhante, chamado espectrometria de ionrômetro de ionrização de desorização a laser (LDI-MS)7, é outra técnica que não é invasiva e útil para a análise da superfície. Como essa técnica é boa em escanear a superfície de um espécime, ela alcança uma análise bidimensional abrangente como a espectrometria de massa de imagem MALDI8,9. No entanto, como o LDI-MS só é aplicável à análise da superfície, pesi-MS é vantajoso para analisar as amostras, por exemplo, dentro do tecido. Outra técnica, a MasSpec Pen10,foi relatada para atingir alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico de câncer de tireoide, mas o diâmetro da sonda está na ordem do mm e é específico para a análise da superfície, o que significa que não pode detectar pequenos nódulos de câncer ou lesões profundamente localizadas. Além disso, como este método usa um canal de fluxo microcapilar embutido na caneta da sonda, a contaminação cruzada deve ser levada em consideração, semelhante ao LDI-MS. Existem outras técnicas que foram aplicadas a configurações clínicas, como a sonda de fluxo e o cotonete11,mas não são generalizados.

PESI é uma miniaturização extrema do ESI, onde o capilar do nano-eletrospray converge em uma agulha sólida com um raio de curvatura de ponta de várias centenas de nm. A ionização ocorre na área extremamente restrita da ponta da agulha, formando um cone Taylor, no qual as amostras permanecem até que a ionização de todo o fluido na ponta seja concluída12. Se o analyte ficar na ponta da agulha metálica, o excesso de carga é continuamente gerado na interface entre a agulha metálica e os analytes. Portanto, a ionização sequencial de moléculas ocorre dependendo de sua atividade superficial. Esta propriedade faz da ponta da agulha uma espécie de cromatograma, separando os análites dependendo de sua atividade superficial. Mais tecnicamente, moléculas com a atividade superficial mais forte chegam à superfície do cone Taylor e são ionizadas mais cedo do que aquelas com atividade superficial mais fraca, que aderem à superfície da agulha até o final do processo de ionização. Assim, a ionização completa de todas as moléculas captadas pela agulha é alcançada13. Além disso, como essa técnica não envolve a adição de solvente supérfluo à amostra, várias centenas de femtolitros são suficientes para obter espectros de massa fortes o suficiente para análise suplementar14. Essas propriedades são vantajosas para a análise de amostras biológicas intactas. No entanto, uma grande desvantagem do PESI-MS reside na descontinuidade na ionização devido ao movimento recíproco da agulha ao longo do eixo vertical, semelhante a uma máquina de serrar. A ionização só ocorre quando a ponta da sonda atinge o ponto mais alto quando a altura do orifício do íon está alinhada no eixo horizontal. A ionização cessa enquanto a agulha capta amostras, e assim a estabilidade da ionização não é igual à do ESI convencional. Portanto, pesi-ms não é um método ideal para a proteômica.

Até o momento, o PESI-MS tem sido aplicado principalmente à análise de sistemas biológicos, abrangendo uma ampla gama de campos, desde pesquisas básicas até ambientes clínicos. Por exemplo, a análise direta do tecido humano preparado durante a cirurgia foi capaz de revelar o acúmulo de triacylglicerol tanto no carcinoma celular renal15 quanto na carcinoma faringeal16. Este método também pode medir amostras líquidas, como sangue, para se concentrar no perfil lipídico. Por exemplo, algumas moléculas foram delineadas durante mudanças alimentares em coelhos; foi relatado que algumas dessas moléculas diminuíram em estágios muito iniciais dos experimentos, indicando a alta sensibilidade e utilidade deste sistema para diagnóstico clínico17. Além disso, a aplicação direta a um animal vivo permitiu a detecção de alterações bioquímicas do fígado após apenas uma noite dejejum 5. Zaitsu et al.18 revisitaram este experimento5 e analisaram os perfis metabólicos do fígado quase da mesma forma, com resultados que reforçaram a estabilidade e a reprodutibilidade do nosso método original. Além disso, conseguimos discriminar o tecido cancerígeno do fígado não cancerígeno circundante em camundongos usando esta técnica19. Portanto, trata-se de uma técnica versátil de espectrometria de massa que é útil em várias configurações, tanto in vivo quanto in vitro. Do outro ponto de vista, o módulo PESI pode ser feito para caber vários espectrômetros de massa, ajustando o acessório de montagem. Neste pequeno artigo, introduzimos o básico e exemplos de aplicações (Figura 1),incluindo aplicações com animais vivos5.

De acordo com as normas e leis de cada país, partes desse protocolo precisarão ser revistas para atender aos critérios de cada instituição. A aplicação ao organismo vivo é a mais interessante e desafiadora porque pode fornecer alterações bioquímicas ou metabólicas em tecidos ou órgãos em animais vivos in situ. Embora este pedido tenha sido aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi, em 20135, outra rodada de aprovação agora será necessária devido às recentes mudanças nas regulamentações para os experimentos com animais. Várias modificações no esquema experimental são, portanto, aconselháveis. Em relação ao espectro de massa obtido em experimentos, levando em conta as flutuações de espectros de massa entre cada medida, não há um sistema espectral de compartilhamento de informações que seja comum com a comunidade de sequenciamento de nucleotídeos. Deve-se tomar cuidado quando o operador manuseia a agulha para evitar acidentes com agulhas, especialmente quando a retirada da agulha do suporte da agulha. Um dispositivo especial para desprender a agulha é muito útil para este fim. Como o compartimento do módulo PESI é uma câmara hermética e fechada, o vazamento da pluma de íon não ocorre se o espectrômetro de massa for operado de acordo com as instruções.

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Protocolo

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O comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi aprovou todos os protocolos e o uso de animais experimentais aqui declarados. O uso de amostras humanas foi aprovado pelo conselho de ética institucional da Universidade de Yamanashi.

1. Preparação de tecido sólido

NOTA: As amostras devem ser mantidas no gelo após sua remoção do animal ou do corpo humano para preservar o frescor do tecido. Se as medidas não seguirem imediatamente a dissecação, recomenda-se armazenar tecido a -80 °C. Não é aconselhável colocar o tecido em qualquer tipo de tampão ou soro, porque eles podem extrair certos conteúdos do tecido. O tecido que foi fixado com aldeídos ou embutido em parafina/cera ou criogel não é adequado para medições de ESM.

  1. Corte a amostra de tecido para aproximadamente 2 x 2 x 2 mm usando um bisturi ou faca. Alternativamente, soque a amostra com um trepan (um soco de biópsia descartável, tamanho 3 mm) usado para o exame de pele. Neste caso, corte o comprimento da coluna para 2 mm.
    NOTA: Qualquer tecido pode ser analisado usando este método. Neste experimento, fígado15 e rim19, foram analisados com sucesso para obter espectros de massa. Geralmente, órgãos parenchymal dão bons espectros de massa, enquanto aqueles que têm componentes fibrosos não.
  2. Se o tecido estiver contaminado com sangue, lave-se brevemente com soro soro-marinho com fosfato frio.
    NOTA: Para minimizar os danos do tecido pós-morte, complete esta etapa, o mais rápido possível, em temperatura ambiente. Se as medidas não forem feitas imediatamente, congele o tecido em nitrogênio líquido e armazene -80 °C.
  3. Coloque a amostra cortada ou perfurada (aproximadamente 10 mgs) em um microtubo plástico e adicione 100 μL de 50% de etanol.
    NOTA: O peso exato das amostras não é determinado porque a espectrometria de massa utilizada neste sistema não fornece dados quantitativos. Aproximadamente 10 mgé ótimo para o tecido parenquimal.
  4. Homogeneize a amostra usando um micropestle.
  5. Coloque 10 μL do homogeneeno no poço do cartucho (Figura 2).
  6. Coloque o cartucho na câmara de ionização do espectrômetro de massa e instale a sonda de agulha de aço inoxidável que será usada para a ionização amostral(Figura 2).
    NOTA: As agulhas de sonda são fornecidas pelo fabricante. Eles são feitos de aço inoxidável e têm um raio de curvatura de aproximadamente 400 nm.
  7. Feche firmemente a tampa da câmara para ativar automaticamente o dispositivo de segurança.
  8. Inicie o computador de bordo clicando no ícone Iniciar para analisar. Usando os painéis na tela, aplique uma tensão de 2,3 kV à agulha para gerar o eletrospray e certifique-se de que a frequência da agulha seja de 3 Hz.
  9. Aguarde 30 s para que a medida seja concluída.
    NOTA: A sessão cessa automaticamente quando a aquisição de dados é concluída. A qualidade da análise é monitorada por um cromatograma total de íons (TIC). O tempo de medição é definido para obter o espectro de massa representativo e pode ser encurtado ou prorrogado.
  10. Descarte o cartucho e a agulha em um descarte de risco biológico depois de medir cada amostra.
    NOTA: Apenas uma amostra pode ser medida de cada vez. Não é necessário calibrar a máquina antes de cada medição; calibração depende do check-up regular pelo fornecedor uma vez a cada seis meses.
  11. Analise o espectro de massa e exporte os dados de texto espectrais em massa utilizando o software associado ao espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais)conforme indicado nas etapas abaixo(Figura 3).
    1. Clique no arquivo lcd na janela do navegador de arquivos de dados do software.
    2. Escolha e clique em um único pico na janela de espectro de massa e para retratar automaticamente um cromatograma de íon extraído (EIC).
    3. Verifique o TIC e o EIC e clique no ícone de espectro médio para selecionar a janela de alcance do tempo para gerar o espectro de massa.
      NOTA: Nesta análise, as moléculas-alvo aparecem na relação massa-carga(m/z) janela (Figura 3). Além disso, como a duração da ionização por único golpe de movimento da agulha é muito curta, todos os espectros de massa obtidos são essencialmente espectros médios acima de 10 s (300 scans).
    4. Gere um arquivo de texto contendo intensidade de m/z e íon clicando na guia Export para análise posterior. Este arquivo de texto pode ser armazenado em qualquer pasta.
      NOTA: Quaisquer conservantes de RNA afetarão o padrão espectral nativo das amostras. Além disso, é aconselhável manusear e armazenar tecido sem qualquer líquido (como soro soro tampão de fosfato) para evitar a elusão de componentes moleculares do tecido para o líquido durante o armazenamento. Idealmente, amostras congeladas frescas ou frescas sem qualquer tratamento são usadas.

2. Preparação de fluidos corporais (soro)

NOTA: Todo esse procedimento é quase idêntico ao usado para tecido sólido. O cartucho para a amostra de fluido está disponível no fabricante. Como a contaminação por gorinteleiros vermelhos (RBCs) pode diminuir consideravelmente a eficiência da aquisição espectral do componente pretendido (plasma ou soro), certifique-se de eliminar todos os RBCs por centrifuging antes das medições.

  1. Pegue 10 μL da amostra de soro e coloque-a em um microtubo de 1,5 mL.
    NOTA: Tanto o soro fresco quanto o armazenado podem ser usados.
  2. Adicione 190 μL de 50% de etanol ao tubo de 1,5 mL, depois vórtice por 2 min à temperatura ambiente.
  3. Centrífuga o líquido a 15.000 x g por 1-5 min a 4 °C.
  4. Transfira 10 μL de supernatante para o poço do cartucho.
  5. Coloque o cartucho na câmara de ionização da máquina e instale a sonda de agulha de aço inoxidável que será usada para ionização amostral (Figura 2).
  6. Feche firmemente a tampa da câmara para ativar automaticamente o dispositivo de segurança.
  7. Inicie o computador de bordo clicando no ícone Iniciar para ionizar.
  8. Descarte o cartucho de amostra e a agulha descritos em 1,10 depois que as medidas forem tomadas.
  9. Analise os conjuntos obtidos da EIC conforme indicado abaixo (Figura 3).
    1. Abra o arquivo lcd no navegador de dados.
    2. Clique em um único pico para exibir o TIC e o EIC.
    3. Selecione a janela de intervalo para gerar espectros de massa usando o ícone de espectro médio.
    4. Exporte o arquivo gerado contendo a intensidade m/z e íon de um pico correspondente clicando na guia de exportação no monitor.
      NOTA: Este procedimento pode ser aplicado à saliva, urina e outros fluidos corporais também.

3. Preparação para in vivo PESI-MS em organismo vivo

NOTA: Nesta seção, um aplicativo para monitorar o perfil metabólico de 5-Fluoro-2'-deoxyuridina (5-FdU) em um modelo de rato vivo é introduzido. Use condições assépticas por toda parte.

  1. Infunda 100 μL de 100 mM solução 5-FdU na veia traseira de um rato de 2 meses de idade (aproximadamente 20 g de peso).
    NOTA: Não há preferência por sexo, idade ou tensão de rato. Embora este protocolo tenha sido aprovado no momento em que realizamos o experimento5,a viabilidade deste experimento depende das restrições éticas do país em que será realizado.
  2. Anestesiar o rato seguindo seu protocolo de cuidados com animais aprovado. Avalie a profundidade da anestesia pela falta de resposta à beliscar cauda.
    NOTA: Se o uso de pentobarbital de sódio não for permitido pelo comitê ético para experimentos animais, métodos alternativos podem ser utilizados, como cloridrato de cetamina.
  3. Raspe a cavidade abdominal usando uma navalha elétrica e aplique pomada veterinária aos olhos.
  4. Coloque o mouse anestesiado em uma posição supina e fixe as patas na placa de plástico usando fita de reparação. Esfregue o local cirúrgico com esfregões de 70% de álcool três vezes.
  5. Corte a cavidade abdominal usando tesouras. Primeiro, corte a pele lateralmente (10 mm) de pouco acima do diafragma. Corte lateralmente o músculo da parede abdominal do corpo e do peritôono (ca. 7 mm) e mantenha a ferida aberta usando fio inoxidável para expor a superfície hepática.
    NOTA: Não há necessidade de perfundir a superfície do fígado.
  6. Aplique a ponta da agulha da sonda na superfície do fígado. Ajuste a profundidade da agulha para aproximadamente 0,5 mm de profundidade para otimizar a eficiência da ionização, verificando o padrão TIC e espectral simultaneamente. Defina a alta tensão a 2,3 kV e a frequência a 3 Hz na tela do painel de controle.
  7. Retire o animal da placa de plástico.
  8. Sutura a ferida usando uma sutura intestinal cirúrgica e devolve o rato para a gaiola. Não deixe o rato desacompanhado até que tenha recuperado a consciência para manter a rerecência severa. Não devolva o rato para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
  9. Realize o curso de tempo da intensidade do íon no EIC e o procedimento de representação do EIC como em 1.11.1 a 1.11.4.

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Resultados

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Como retratado na Figura 3,os dados obtidos pela técnica PESI-MS são o espectro de massa, cujo m/z varia de 10 a 1.200 neste sistema. Embora se possa detectar moléculas de até m/z 2.000, houve poucos picos obtidos usando essa técnica ao longo da gama de massas de m/z 1.200. Por isso, analisamos picos de m/z 10 a 1.200. Havia grupos conspícuos de picos em torno de m/z 800 e 900; o primeiro representa componentes da ...

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Discussão

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Embora o PESI seja um derivado do ESI para espectrometria de massa4,é mais vantajoso para monitorar metabolômicas em tempo real, bem como para analisar reações bioquímicas sem realizar nenhum pré-tratamento complexo ou demorado5,14,15,17. É uma técnica de espectrometria de massa fácil e instantânea que pode ser aplicada ao estado integrado dos organismos vivos. Como não ...

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Divulgações

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O autor correspondente foi financiado por Shimadzu, fabricante e fornecedor de instrumentoPESI-MS.

Agradecimentos

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Agradecemos a Ayumi Iizuka por operar o PESI-MS e Kazuko Sawa-nobori por sua assistência de secretariado. Agradecemos bronwen Gardner, Ph.D., do Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) por editar um rascunho deste manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-Fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdU)Sigma-AldrichF8791-25MG25mg
perfurador biposy descartável (Trepan)kai Europa GmbHBP-30Ftamanho do furo 3mm
etanolnacalai tesque14710-25reagente extra puro
LabSolutionsShimadzuver. 5.96, analisador de dados
micropilãoUnited Scientific Fornecemicrotubo S13091
Treff9828550,5 mL transparente
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)ShimadzuDPiMS-2020Espectrômetro de massa equipado com PESI
PPGT solitionShimadzuNDAnexado ao DPiMS-2020

Referências

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