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Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

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DOI:

10.3791/59949

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17 de dezembro de 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Resumo

A imunoterapia adotiva é promissora para o tratamento do câncer e das doenças infecciosas. Descrevemos uma abordagem simples para transduzir as células T humanas primárias com receptor de antígeno quimérico (CAR) e expandir sua progênie ex vivo. Incluímos ensaios para medir a expressão do CAR, bem como diferenciação, capacidade proliferativa e atividade citolítica. Descrevemos ensaios para medir a produção de citocina efetoee e secreção inflamatória de citocina em células T CAR. Nossa abordagem fornece um método confiável e abrangente para a cultura das células T CAR para modelos pré-clínicos de imunoterapia adotiva.

Introdução

Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) fornecem uma abordagem promissora para redirecionar as células T contra antígenos tumorais distintos. Cars são receptores sintéticos que ligam um alvo de antígeno. Embora sua composição precisa seja variável, os CARs geralmente contêm 3 domínios distintos. O domínio extracelular direciona a ligação a um antígeno alvo e normalmente é composto por um único fragmento de anticorpo de cadeia ligado ao CAR através de uma dobradiça extracelular. O segundo domínio, comumente derivado da cadeia CD3 do complexo do receptor de células T (TCR), promove a ativação de células T após o engajamento da RCA. Um terceiro domínio costimulatory é incluído para realçar a função da pilha de T, engraftment, metabolismo, e persistência. O sucesso da terapia com células T CAR em várias neoplasias hematopoiéticas, incluindo leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B, leucemia linfocítica crônica (LlCa) e mieloma múltiplo destaca a promessa terapêutica desta abordagem1,2,3,4,5,6. As recentes aprovações da Food and Drug Administration (FDA) para duas terapias específicas de células T car específicas para CD19, tisagenlecleucel para TODOS pediátricos e adultos jovens e ciloleucel axicabtagene para linfoma difuso de grandes células B, reforça o mérito translacional da terapia de células T CAR.

As abordagens baseadas em CAR envolvem o isolamento das células T do sangue periférico, ativação, modificação genética e expansão ex vivo. A diferenciação é um parâmetro importante que regula a eficácia das células T do CAR. Assim, restringir a diferenciação de células T durante a cultura ex vivo aumenta a capacidade do produto infundido de enxertar, expandir e persistir, fornecendo imunovigilância de longo prazo após transferência adotiva2,7,8,9. As células T consistem em vários subconjuntos distintos, incluindo: células T ingênuas (Tn), memória central (Tcm), memória efeora (Tem), efecionista diferenciada (Tte) e memória de células-tronco (Tscm). As células T diferenciadas effector têm potente capacidade ctolítica; no entanto, eles são de curta duração e enxerto mal10,11,12. Em contraste, as células T com um fenótipo menos diferenciado, incluindo células T ingênuas e Tcm exibem enxerto superior e habilidades proliferativas após transferência de células adotivas13,14,15,16,17, 18. A composição das células T coletadas no produto pré-fabricado pode variar entre os pacientes e se correlaciona com o potencial terapêutico das células T CAR. A proporção de células T com um imunofenótipo ingênuo no produto de áherese inicial está altamente correlacionada com o enxerto e a resposta clínica19.

A duração da cultura é um parâmetro importante que influencia a diferenciação nas células T car preparadas para transferência adotiva. Recentemente desenvolvemos uma abordagem para gerar células T CAR de qualidade superior usando um paradigma de cultura abreviado20. Usando nossa abordagem, mostramos que a cultura limitada dá origem a células T CAR com função efetiva superior e persistência após transferência adotiva em modelos de xenoenxerto de leucemia. Aqui, apresentamos as abordagens para gerar de forma confiável as células CART19 (células T autólogas projetadas para expressar scFv anti-CD19 anexadas ao CD3 e os domínios de sinalização 4-1BB) e incluímos uma descrição detalhada dos ensaios que fornecem informações sobre a bioatividade e eficácia do CAR T antes da transferência adotada.

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Protocolo

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia.

1. Ativação de células T, transdução e expansão

  1. Ativar células T humanas primárias frescas ou criopreservadas misturando-se com contas magnéticas anti CD3/CD28 (por exemplo, dynabeads) a uma proporção de 3 contas por célula T em pratos de cultura celular de 6 poços. Células T culturais no X-VIVO 15 médias complementadas com 5% de soro ab humano normal, 2 mM L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/mL). Mantenha as células T em uma concentração de 106 células T/mL durante a expansão. Células T cultura a 37 °C, 20% O2,e 95% de umidade com 5% de CO2.
  2. Após a estimulação durante a noite, adicione o supernatant lentiviral às pilhas de T ativadas. Calcule o volume de supernatant necessário para conseguir um multiplicity da infecção (MOI) de 3-5.
    Nota: O plasmid do lentivirus do CAR cd19-BBérc consiste em uma dobradinha CD8, em domínio costimulatory de 4-1BB, e no domínio de sinalização21do CD3º. O supernatant lentiviral cd19-BBfoi gerado como descrito anteriormente21.
  3. No dia 3, recolher um alibado representativo de células para criopreservação. Antes da criopreservação, retire as contas magnéticas por pipetting suave e separação magnética. Prepare o meio de congelamento contendo soro soro para o soro vermelho-fosfato (PBS) com sulfoxida de dimetil de 0,5% (DMSO) e guarde em 4 °C até o uso.
    1. Células T centrífugas a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatant e adicione 5 mL de PBS. Células centrífugas a 300 x g por 5 min e descartam o PBS.
    2. Resuspenda a pelota da pilha em 1 mL do meio frio da criopreservação. Congele as células T em um recipiente gelado e guarde a -80 °C por 48 h. Transfira as células congeladas para nitrogênio líquido.
  4. Lave o resto das células T uma vez em 5 mL de PBS para eliminar vetor residual. Centrífuga a 300 x g por 5 min. Decant o PBS e resuspender a pelota celular no meio de cultura de células T em uma concentração de 0,5 x 106 células/mL.
  5. Divida as células T em duas culturas, designadas para o dia 5 e o dia 9. Contagem de células T por citometria de fluxo usando contas de contagem(Mesa de Materiais)e anticorpos monoclonais para CD4 e CD8 humanos, bem como um dinamismo de viabilidade(Tabela de Materiais).
    1. Para medir a concentração de células T, prepare uma mistura mestra contendo 500 μL de PBS, 5 μL de contas de contagem, 10 μL de 7-Amino-actinomicina solução de viabilidade celular D, 4 μL de CD4-FITC e 4 μL de CD8-APC. Adicione 40 μL de células T à mistura mestra e meça a concentração celular por citometria de fluxo com base no número de células T vivas/contagem de contas. Refeed para manter as culturas em uma concentração de 0.5 x 106 pilhas/mL cada outro dia.
  6. No dia 5, conte e criopreserve culturas do dia 5, conforme descrito nos passos 1,3 e 1,5.
  7. No dia 7, lave 0,5 x 106 células T na PBS e resuspenda em 100 μL de tampão de triagem celular ativada por fluorescência (FACS). Detectar a expressão da proteína de superfície DO CAR imunostaining com um idiotipo anti-CAR19 fluorescente-conjugado pela citometria do fluxo.
  8. No dia 9, contar dia 9 culturas e criopreservação, como descrito no passo 1.3.

2. Avaliação phenotípica da diferenciação de células T

  1. Prepare uma mistura mestra contendo anticorpos pré-titados para anti-CD3-BV605 (clone OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19-PB (clone HIB19), anti-CD4-BV510 (clone OKT4), anti-CD8-H7APC (clone SK1), anti-CCR7-FITC (clone 150503), anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) e anti-CAR19-APC.
  2. Prepare os controles individuais de fluorescência menos um (FMO) para controles anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 e anti-CD95-PerCP-Cy5.5 para distinguir células positivamente manchadas de fundo.
  3. Prepare a solução de coloração de células mortas diluindo reagente de estoque vivo/morto(Tabela de Materiais)1:10.000 na PBS.
  4. Descongele as células T do dia 3, dia 5 e dia 9 que foram previamente criopreservadas. Centrífuga 1 x 106 células T de cada grupo a 300 x g por 3 min. Descarte o supernatant. Lave as células uma vez com PBS. Centrífuga a 300 x g por 3 min e descartar o PBS.
  5. Misture as células T com a solução de coloração morta para 15 min à temperatura ambiente (RT), protegido da luz.
  6. Adicione 1 mL de buffer FACS para saciar o tinudura de coloração de células mortas. Centrífuga a 300 x g por 3 min, descartar o supernatant e resuspender a pelota celular em 100 μL de tampão FACS contendo o coquetel de anticorpos descrito na etapa 2.1 e 2.2. Incubar por 1 h a 4 °C.
  7. Adicione 1 mL de buffer FACS e centrífuga a 300 x g por 3 min para lavar anticorpo sem limites. Repita três vezes com tampão FACS.
  8. Resuspenda as células em paraformaldeído de 1% (PFA) e armazena a 4°C.
  9. À medida que a expressão cd45ro diminui após a fixação, analise as amostras por citometria de fluxo após a imunocoloração. Para avaliar a diferenciação, portão na seguinte ordem: singlets (FSC-H vs FSC-A), células CD3+ T ao vivo (Dump [violeta morto-vivo, CD14-PB e CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). Em CD4+ e Subconjuntos CD8+, portão no CD45RO-PE vs CCR7-FITC para definir células T ingênuas (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) e Tte (CD45RO-CCR7-). Para identificar Tscm, portão em células CD27+ T na população de células T ingênuas. Neste compartimento, Tscm são CD95+ e Tn são CD95-.

3. Análise funcional in vitro

  1. Proliferação de células T car e secreção de citocina
    1. Verifique a expressão do CAR, bem como a viabilidade celular, conforme descrito nos passos 1,5 e 1,7, por citometria de fluxo.
    2. Lave 5 x 106 células T de cada grupo (dia 3, dia 5 e dia 9) com PBS e resuspenda em uma solução de 1 μM de carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) na PBS por 3,5 min na RT.
    3. Adicione imediatamente 10 mL de PBS que contêm o soro bovino fetal de 10% (FBS) para saciar a reação.
    4. Centrífuga a solução a 300 x g para 3 min. Descarte o supernatant e repita este passo de lavagem três vezes. Conte as células na conclusão da coloração CFSE usando um contador Coulter(Tabela de Materiais).
    5. As células manchadas de CFSE (não estimuladas), resuspendem em 1% pfa e armazenam a 4 °C para análise por citometria de fluxo.
    6. Incubar o número desejado de células T CAR manchadas de CFSE com k562-CD19 irradiado (alvo), bem como células tipo K562-selvagem (controle) em uma proporção de 1:1 para 120 h em condições de cultura livre de citocina média e cultura, conforme descrito na etapa 1.1.
    7. Após 24 h, centrífuga o vaso de cultura a 300 x g por 5 min. Coletar 120 μL de supernatant celular. Avalie a produção dependente da ativação de IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF e outras citocinas inflamatórias (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) por análises Luminex de acordo com as recomendações do fabricante.
    8. Substitua o volume de supernatant que foi coletado na etapa 3.1.7 com um volume equivalente (120 μL) do meio fresco.
    9. No dia 3 (ou seja, após 96 h), conte e re-alimente a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL usando citometria de fluxo à base de contas como anteriormente na etapa 1.5.
    10. No dia 5, conte as células CD3+ vivas e calcule a mudança de dobra das células T vivas em relação à contagem de células T vivas no dia 0.
    11. Realize uma análise abrangente da diluição cfse na divisão de células T CAR usando o software FlowJo para destacar rodadas sucessivas de divisão celular.
      NOTA: Os ensaios de proliferação são bem descritos no manual flowjo.
  2. Ensaio de citotoxicidade
    Nota: A capacidade das células CART19 de matar células-alvo expressando CD19 é avaliada usando um ensaio de liberação 51Cr.
    1. Rotular as células-alvo, misturando 5 x 105 K562-CD19, células de controle do tipo K562-selvagem, ou células de leucemia NALM6 com 50 μL de Na251CrO4 e 0,5 mL de RPMI complementada com 10% FBS por 90 min na incubadora em 37 °C.
    2. Células centrífugas a 300 x g por 2,5 min. Descarte o supernatant radioativo em caixas de descarte apropriadas e lave as células-alvo em 5 mL da PBS. Repita os passos de lavagem duas vezes.
    3. Resuspender as células-alvo em fenol vermelho-livre médio contendo 5% FBS. Use este meio para o resto do procedimento para reduzir o fundo.
    4. Depois de avaliar a expressão do CAR e a viabilidade celular por citometria de fluxo (conforme descrito na seção 5.1), misture as células T CAR com células-alvo rotuladas em proporções de 10:1, 3:1 e 1:1, em triplicado. Transfira para uma placa inferior U de 96 poços.
    5. Em paralelo, inclua células-alvo isoladamente e células-alvo com sulfato dodócia de sódio de 1% (SDS), para determinar a liberação espontânea (S) e máxima (M) 51Cr, respectivamente.
    6. Células centrífugas a 300 x g para 5 min e incubam por 4 h ou 20 h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.
    7. Após o tempo designado, centrífuga o vaso de cultura em 300 x g para 5 min. Coletar 35 μL de supernatant celular e transferir para uma placa de leitor. Evite bolhas. Deixe a placa secar durante a noite.
    8. Selar a placa com um selo de placa padrão e contar com um contador de cintilação líquida. A abundância de cromo no supernatant fornece um proxy da matança da pilha do alvo. Calcule a porcentagem de lyse específica da seguinte forma: 100 x (contagens por minuto [cpm] liberação experimental - cpm S release)/ (cpm M release - cpm S release).

4. Análise Funcional In Vivo

  1. Obtenha camundongos de 6 a 10 semanas de idade nod-scidγ c-/- (NSG), que não possuem um sistema imunológico adaptativo, e os designe ao grupo de tratamento/controle aleatoriamente.
  2. Injete animais por via via veia da cauda com 1 x 106 células NALM6 em 0,1 mL estéril PBS.
  3. Após 5 a 7 dias, confirme o enxerto tumoral por imagem de bioluminescência (BLI). Injetar 150 mg/kg de D-luciferin para camundongos que foram anestesiados com isoflurano (volume depende da massa corporal).
  4. Medir os valores de bioluminescência usando um sistema de imagem. Quantificar o fluxo total usando o software correspondente, desenhando retângulos de área idêntica em torno de ratos, atingindo da cabeça a 50% do comprimento da cauda. Subtraia o fundo para cada imagem individualmente.
  5. Após o estabelecimento de leucemia, injetar 3 x 106 dia 9 cart19 células, 0,5 x 106 dia 3 células T CAR, ou correspondentes não-transduced (NTD) células T humanas via veia da cauda em um volume de 100 μL de Estéril PBS / Ca2 +.
    Nota: Como a bioatividade das células colhidas em vários intervalos durante o processo cultural é diferente, a concentração escolhida das células do dia 3 é menor do que o dia 9.
  6. Para determinar a progressão da doença, medir os valores de bioluminescência duas vezes por semana, conforme descrito acima na etapa 4.3.
  7. Para determinar o enxerto de células T car, coletar 75 μL sangue através de sangramento retro-orbital em um tubo revestido edta. Transfira 50 μL de sangue para tubos de contagem absoluta.
  8. Manchar o sangue com anticorpos contra CD45, CD4, CD8 e CAR por 30 min em RT. Adicionar 400 μL de 1x FACS solução de leitura para os tubos e vórtice completamente. Após a coloração, analise a expressão do marcador de superfície pela citometria do fluxo.
    Nota: Outros marcadores de superfície podem ser usados para avaliar o status de diferenciação e exaustão das células T no sangue.
  9. Para medir os níveis de citocinas no sangue, o sangue de centrífuga em 1.200 x g por 30 min a 4 °C para separar o soro da camada superior do sangue.
  10. Coletar soro e medir as citocinas com uma placa de leitor designado de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

Usando os métodos descritos acima, estimulamos e expandimos as células T por 3 ou 9 dias(Figura 1A,B). Também analisamos seu perfil de diferenciação, como indicado pela estratégia de gating delineada na Figura1C,medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Mostramos uma mudança progressiva para a diferenciação efetíbula ao longo do tempo durante a cultura ex vivo (Figura ...

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Discussão

Aqui descrevemos abordagens para medir a função e eficácia das células T CAR colhidas em intervalos variados ao longo da cultura ex vivo. Nossos métodos fornecem uma visão abrangente sobre ensaios projetados para avaliar a capacidade proliferativa, bem como a função efetiva in vitro. Descrevemos como medir a atividade das células T car após a estimulação através do CAR e detalhar os modelos de xenoenxerto de leucemia usando células T CAR colhidas no dia 3 vs dia 9 de sua fase de expansão logarítica.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte através do financiamento fornecido pela Novartis Pharmaceuticals através de uma aliança de pesquisa com a Universidade da Pensilvânia (Michael C. Milone), bem como st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti dynabeads CD3/CD28Thermo Fisher40203D
APC Mouse Anti-Human CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BDBiosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X ConcentrateBD Biosciences349202
BD Trucount Absolute Counting TubesBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 AntibodyBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation KitLife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC anti-humano CD197 (CCR7) AnticorpoBD Pharmingen561271RRID: AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4BD Biosciences555346RRID: AB_395751
HEPESGibco15630-080
Soro AB humanoValley BiomedicalHP1022
Human IL-2 IS, grau premiumMiltenyi130-097-744
L-glutaminaGibco28030-081
Contador de cintilação líquida, MicroBeta triluxSondas Moleculares Violetas Fixáveis Perkin Elmer
LIVE/DEADL34964
Contador de relha MultisizerBeckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Anticorpo anti-CD14 humano azulBioLegend325616RRID: AB_830689
Anticorpo anti-CD19 humano azul do PacíficoBioLegend302223
PE anti-humano CD45RO AnticorpoBD Biosciences555493RRID: AB_395884
PE / Cy5 anti-humano CD95 (Fas) AnticorpoBioLegend305610RRID: AB_493652
PE / Cy7 anti-humano CD27Anticorpo Beckman CoulterA54823
Meio sem vermelho de fenolGibco10373-017
Solução SDS UltraPure, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferina - Sal K+Perkin Elmer122799

Referências

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