Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.
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Artigo de método
A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As modificações múltiplas do ADN foram identificadas no genoma mamífero. Deste, 5-methylcytosine e 5-hydroxymethylcytosine-mediam mecanismos epigenéticas foram estudados intensivamente. 5-Hidroximetilcitosina apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do cérebro, desempenha uma função reguladora na expressão gênica, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas. Aqui, nós descrevemos os métodos detalhados que incluem a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN para detectar 5 hydroxymethylcytosine em pilhas cultivadas e em tecidos do cérebro do rato.
Introdução
As modificações epigenéticas, incluindo a modificação do ADN, a modificação do histona e a modificação do RNA, foram mostradas para jogar funções essenciais em processos e em doenças biológicos diversos1,2,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. por um longo tempo, METILAÇÃO de DNA (ou seja, 5-metilcitosina (5-MC)) tem sido visto como um marcador epigenético altamente estável e não pode ser mais modificado no genoma. Recentemente, verificou-se qu....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade de Zhejiang.
1. a cultura de células-tronco neurais adultas e neurônios
- Isole pilhas de haste neural adultas do prosencéfalo de um adulto (8-10 semanas velho) C57/BL6 macho rato como descrito previamente31,32.
- Cultura células tronco neurais adultas em DMEM/F-12 médio contendo 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, e 2 mM L-glutamina em uma incubadora de 5% CO2 em 37 ° c. Induzir a diferenciação de células-tronco neurais adul....
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Resultados
Para revelar a distribuição de 5-hmC no hipocampo de camundongos adultos, realizamos imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais (NeuN) e 5-hmC. No hipocampo, o 5-hmC colocalizada bem com marcador de células neuronais NeuN (Figura 1a-H), sugerindo um enriquecimento de 5-HMC em neurônios.
Para determinar a dinâmica de 5-hmC durante o desenvolvimento neuronal, um dot-blot foi realizado pela primeira vez com amostras de DNA isoladas de.......
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Discussão
Modificações epigenéticas desempenham papéis essenciais durante o desenvolvimento do cérebro, maturação e função. Como um marcador estável para a modificação do ADN, o 5-hmC dinâmico responde à adaptação comportamental, à atividade neuronal, e é correlacionado positivamente com a expressão de gene; assim, está envolvida na função normal do cérebro e da desordem neurológica4. Para explorar sua função em células e tecidos, é necessário detectar a existência de 5-hmC e comparar o nível antes e após o.......
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Divulgações
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O XL foi apoiado na parte pelo programa nacional da chave R & D de China (2017YFE0196600), e pela Fundação Nacional da ciência natural de China (Grant nos. 31771395, 31571518). VEÍCULO especial Q.S.P. foi apoiado pelo programa de pesquisa e desenvolvimento chave nacional da China (2017YFC1001703) e o programa-chave de pesquisa e desenvolvimento da província de Zhejiang (2017C03009). W.X. foi apoiado pela Fundação de ciência natural da província de Zhejiang (LY18H020002) e departamento de tecnologia da ciência da província de Zhejiang (2017C37057).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 cabra anti-rato IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hidroximetilcitosina | Motivo ativo | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 suplemento | Gibco | 12587-010 | |
| Suplemento B27 | Gibco | 12580-010 | |
| Suplemento B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Micrótomo criostato | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 médio | OmegaScientific | DM25 | |
| Fator de crescimento epidérmico | PeproTech | 100-15 | |
| Fator de crescimento de fibroblastos-básico | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-149 | |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Soro de cabra normal | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Membrana de nylon (Hybond™-N+) | Amersham Biosciences | ||
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Ácido | retinóicoSigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Referências
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
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Reimpressões e permissões
