Artigo de método

Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz

DOI:

10.3791/59960

⸱

2 de setembro de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As lesões locais induzidas alvo em genomes (TILLING) são uma estratégia da genética reversa para a seleção da elevado-produção de mutações induzidas. Entretanto, o sistema de TILLING tem menos aplicabilidade para a deteção da inserção/apagamento (Indel) e o TILLING tradicional precisa etapas mais complexas, como a digestão do nuclease do CEL I e a electroforese do gel. Para melhorar a eficiência da produção e da seleção, e para fazer a seleção dos indels e das Substitions de base únicas (SBSs) possíveis, um derretimento High-Resolution novo (HRM)-baseou o sistema de LAVRAMENTO é desenvolvido. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado de HRM-TILLING e mostramos sua aplicação na seleção da mutação. Este método pode analisar as mutações de amplicões do PCR medindo a desnaturação do ADN dobro-encalhado em altas temperaturas. A análise de HRM é executada diretamente borne-PCR sem processamento adicional. Além disso, um método simples, seguro e rápido da extração do ADN (SSF) é integrado com HRM-TILLING para identificar indels e SBSs. Sua simplicidade, robustez e alta taxa de transferência torná-lo potencialmente útil para a mutação de digitalização em arroz e outras culturas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutantes são importantes recursos genéticos para a pesquisa de genômica funcional de plantas e criação de novas variedades. Uma aproximação da genética para diante (isto é. da seleção do mutante ao clonagem do gene ou ao desenvolvimento da variedade) usou-se para ser o método principal e único para o uso de mutações induzidas aproximadamente 20 anos há. O desenvolvimento de um novo método de genética reversa, o TILLING (direcionamento de lesões locais induzidas em genomas) por McCallum et al.1 , abriu uma nova paradigma e desde então tem sido aplicado em um grande número de espécies de animais e plantas2. O TILLING é particularmente útil para as características de reprodução que são tecnicamente difíceis ou dispendiosas de serem determinadas (por exemplo, resistência a doenças, conteúdo mineral).

A lavagens foi inicialmente desenvolvida para as mutações do ponto de triagem induzidas por mutagénicos químicos (por exemplo, EMS1,3). Inclui as seguintes etapas: o estabelecimento de uma população (s) de TILLING; Preparação de DNA e agrupamento de plantas individuais; Amplificação do PCR do fragmento do ADN do alvo; formação de heteroduplexes por desnaturação e recozimento de amplicões e clivagem de PCR por nuclease de cel I; e identificação de indivíduos mutantes e suas lesões moleculares específicas3,4. No entanto, esse método ainda é relativamente complexo, demorado e de baixa taxa de transferência. Para torná-lo mais eficiente e com maior produtividade, muitos métodos de lavo modificados foram desenvolvidos, como o apagamento da lavagem (de-lavagem) (tabela 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

A análise da curva de HRM, que é baseada em mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN, é um método simples, cost-effective, e high-throughput para a seleção da mutação e genotipagem13. A HRM já foi amplamente utilizada na pesquisa vegetal, incluindo o TILLING baseado em HRM (HRM-TILLING) para a triagem das mutações do SBS induzidas pela mutagenese do EMS14. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados de HRM-TILLING para a seleção das mutações (Indel e SBS) induzidas por raios da gama (γ) no arroz.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. os preparativos

  1. Desenvolvimento de populações mutagenizadas com raios γ
    1. Trate aproximadamente 20.000 sementes secadas do arroz (com índice de umidade de CA. 14%) de uma linha de arroz japonica (por exemplo, DS552) com raios gama 137Cs em 100 GY (1 GY/min) em uma instalação de irradiação γ (por exemplo, célula gama).
      Nota: as sementes utilizadas para o tratamento devem ter uma elevada viabilidade (por exemplo, com uma taxa de germinação > 85%). A dose de irradiação para o arroz indica pode ser aumentada para 150 GY.
    2. Semear as sementes irradiadas após a germinação em um leito de mudas e transplante de mudas individualmente para um campo de arroz e crescer na população M1 .
      Nota: a semeadura direta de M1 plantas escassamente poderia igualmente ser aplicada para conservar o custo labor. Impeça o cruzamento de plantas de M1 com outras variedades do arroz usando meios físicos ou biológicos da isolação.
    3. Granel-colheita M2 sementes do m1 plantas, com 1-2 sementes de cada m1 pânico, para formar um m2 população.
      Nota: na prática e para a simplicidade, colher todas as sementes de plantas de M1 e após a mistura inteiramente, uma parcela é amostrada para formar uma população de m2 .
    4. Mergulhe cerca de 5.000 M2 sementes em água para 24 (indica arroz)-36 (arroz japonica) h à temperatura ambiente. Em seguida, deixe as sementes germinar a 37 ° c por 2 dias em papel filtro úmido em placas de Petri.
      Nota: mais sementes de M2 podem ser germinadas para análise para aumentar a probabilidade de identificar mutantes.
    5. Coloc as sementes germinadas aos painéis de semeadura com furos pequenos e cresça-os hydroponically por 3-4 semanas em uma solução da cultura modificada de Yoshida et al.15 em uma estufa com um fotoperíodo de 12 h [° c do dia (30 ± 2) e a noite (24 ± 2) ° c].
  2. Amostragem de tecidos foliares: corte um disco (Φ ~ 2 mm) da folha totalmente estendida de cada semeadura na mesma posição usando um perfurador de furo.
  3. Preparação de soluções de extração de DNA
    1. Tampão A: adicionar 2 mL de NaOH de 5 M e 10 mL de 20% de Tween 20 para fazer o volume final de 50 mL. Prepare recentemente o tampão A antes da extração do ADN.
    2. Tampão B: Adicionar 20 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) e 80 μL de 0,5 M de EDTA para fazer um volume final de 100 mL.
  4. Primers de PCR
    1. Primers para análise de HRM: iniciadores de projeto para amplificação da seqüência de destino usando software (por exemplo, primer Premier5) e sintetizar por uma empresa comercial.
      Nota: porque HRM é menos aplicável à análise de fragmentos longos, e daqui, os amplicões devem ser menos do que 400 BP. fragmentos com muito alto (> 75%) ou muito baixa (< 25%) O conteúdo de GC também não é bom para análise de HRM.
    2. Primers para controle de qualidade: Use os 24 marcadores SSR distribuídos nos 12 cromossomas de arroz de Peng et al.16.

2. extração de DNA

  1. Coloc 4 discos da folha em cada poço de uma placa do PCR 96-well, adicione A solução do amortecedor A (50 mL/well). Congelar a placa num congelador de-80 ° c durante 10 min.
  2. Descongelar a placa à temperatura ambiente e, em seguida, incubar a 95 ° c durante 10 min.
  3. Adicionar 50 μL de tampão B a cada poço e misturar bem por vortexing.
  4. Centrifugar a placa durante 1 min a 1.500 x g. O sobrenadante está pronto para a PCR.

3. amplificação do PCR

  1. Otimização de PCR
    1. Adicione os seguintes reagentes a cada PCR bem: 1 μL de ADN (o sobrenadante no passo 2,4), 5 μL de 2x Master Mix (contendo 2x tampão PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/l 2 '-desoxirribonucleosídeo trifosfatos (dNTPs) e 50 U/ml TAQ DNA polimerase, 0,2 μl cada um de 10 iniciadores μmol/L e faça um volume final de até 10 μL usando água livre de nucleases.
    2. Use um bloco térmico capaz de gradiente para determinar a temperatura de recozimento ideal para cada fragmento alvo usando o seguinte programa de PCR: 5 min a 94 ° c, seguidos por 40 ciclos de 30 s a 94 ° c, 30 s a 52-62 ° c (temperatura de gradiente) e 30 s a 72 ° c , com uma extensão final em 72 ° c por 8 minutos e uma preensão em 16 ° c.
    3. Examine os amplicões em géis do agarose de 1% para a determinação da temperatura óptima do recozimento.
      Nota: uma temperatura óptima de recozimento deve permitir a amplificação específica do fragmento alvo, sem amplificação inespecífica e dimerização da cartilha.
  2. PCR para análise de HRM
    Nota: as placas compatíveis com HRM e o DNA de mudas de M2 extraídos conforme descrito na etapa 2,4 são usados para PCR.
    1. Executar PCRs em um volume final de 10 μL, com 1 μL de DNA (sobrenadante), 5 μL de 2x Master Mix, 0,2 μL cada um dos 10 primers μmol/L e 1 μL de corante de fluorescência 10x. Em cada placa incluem um tipo selvagem (WT) pai amostra e um negativo (sem DNA) controle.
    2. Adicione uma gota de óleo mineral a cada poço para evitar a evaporação.
    3. Selar a placa com película adesiva e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.
    4. Execute o PCR usando a temperatura de recozimento otimizada.
      Nota: em alguns casos, a tintura da fluorescência pode afetar a amplificação do PCR, daqui o corante é adicionado após a conclusão do PCR. Nesses casos, o corante é incorporado em fios de DNA por desnaturação pós-PCR e recozimento.

4. digitalização de HRM e confirmação de mutação

  1. Retire a película adesiva da placa e insira a placa numa máquina HRM.
  2. Selecione nova execução no menu arquivo ou pressione o botão executar na parte superior da tela.
  3. Especifique as temperaturas inicial e final para o derretimento de 55 ° c a 95 ° c.
    Nota: após a primeira execução, o intervalo de temperatura de fusão pode ser determinado para um fragmento específico; daqui, a temperatura do derretimento pode ser ajustada para a análise subseqüente do mesmo fragmento para conservar o tempo.
  4. Selecione amostras para análise de fusão de alta resolução, exclua amostras semelhantes ao controle negativo.
  5. Normalize as curvas de fusão para ter a mesma fluorescência inicial e final. Confirme visualmente se os cursores de temperatura inferior mínimo e inferior máximo estão em uma região das curvas.
  6. Mantenha o nível ∆ F (diferença de fluorescência) na configuração padrão de 0, 5.
  7. Selecione o Common versus Variant da lista de seleção de padrões e escolha a sensibilidade normal .
  8. Use o WT como o controle; as amostras com um valor de ∆ F de ≥ 0, 5 do WT são consideradas para conter a planta do mutante.
  9. Identificação e confirmação de plantas mutantes.
    1. Identifique as quatro plantas, de que cada pool do mutante foi feito.
    2. Extraia o DNA de cada uma dessas plantas usando um método CTAB de acordo com Allen et al.17 com algumas modificações.
      Nota: RNase livre de DNase e NaAc não são usados ao extrair o ADN usando o método de CTAB descrito por Allen et al.17, porque a qualidade do ADN é boa bastante para uma amplificação mais adicional do PCR. Ajuste o DNA para uma concentração final de ~ 25 ng/μL após a quantificação usando um espectrofotômetro.
    3. Amplifique o fragmento alvo usando primers de PCR e programe o mesmo que para a análise de HRM.
    4. Identifique lesões moleculares específicas por sequenciamento de Sanger dos amplicons.
      Nota: uma vez que a conclusão da amplificação do PCR, emite os amplicões a uma companhia para arranjar em seqüência de Sanger. A lesão molecular pode ser identificada comparando-se as sequências entre a planta M2 e o peso.

5. controle de qualidade de mutantes selecionados com marcadores moleculares

  1. Realize a PCR para os 24 marcadores SSR em um volume final de 10 μL com 25 ng de DNA genómico (extraído usando o protocolo CTAB), 5 μL de mistura Master 2x, 0,2 μL de cada um dos primers SSR de 10 μM.
  2. Execute o PCR usando o seguinte programa: 5 min a 94 ° c, seguidos por 30 ciclos de 30 s a 94 ° c, 30 s a 55 ° c e 30 s a 72 ° c, com uma extensão final a 72 ° c por 7 min.
  3. Separe os amplicões em géis de poliacrilamida a 8% e revele polimorfismo de fragmentos amplificados por coloração prateada18.
  4. Compare os haplótipos SSR de variantes selecionadas e o WT.
    Nota: os mutantes induzidos têm frequentemente haplótipos de SSR idênticos a seu WT, se mais de um marcadores SSR são diferentes entre uma variação e o WT, a variação é altamente provável ser um contaminante genético (por exemplo, uma mistura ou uma planta outcruzou) um pouco do que um induzido mutante18.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análise e digitalização de HRM

No total, 1.140 amostras de DNA agrupadas de 4.560 M2 mudas foram produzidas e submetidas à amplificação de PCR. Dois fragmentos com o tamanho de 195 BP e 259 BP foram amplificados para OsLCT1 e SPDT, respectivamente (tabela 2). A maioria das amostras apresentou curvas de fusão não significativamente diferentes do WT (ΔF < 0, 5). Curvas de HRM significativamente diferentes do WT (ΔF > 0, 5) fora...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O TILLING provou ser uma poderosa ferramenta genética reversa para identificar mutações induzidas para a análise funcional do gene e a criação de culturas. Para algumas características que não são facilmente observadas ou determinadas, a TILLING com detecção de mutação baseada em PCR de alta taxa de transferência pode ser um método útil para obter mutantes para diferentes genes. O método HRM-TILLING tem sido utilizado em populações EMS-mutagenizadas de tomate12, trigo11 e v...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo programa-chave nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (no. 2016YFD0102103) e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 31701394).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 vezes; Taq mais PCR Master MixTiangen, ChinaKT201Tampão de PCR, dNTP e polimerase para amplificação de PCR
Placa de 96 poçosBio-rad, AméricaMSP-9651Placa específica para PCR na análise de HRM
Mastercycler nexusEppendorf, AmplificaçãoPCRde 6333000073
LightScannerIdaho Technology, EUALCSN-ASY-0011Para amostragem de fluorescência e processamento
CALL-IT 2.0Idaho Technology, EUAPara análise da mudança de fluorescência
EvaGreenBiotium, EUA31000-TCorante de fluorescência de HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, EUAND2000Para quantificação de DNA
de alemã

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14(2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143(2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43(2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Triagem de Muta esExtra o de DNAOtimiza o de PCRAn lise HRMEletroforese em GelSequenciamento de SangerCultivos de ArrozDetec o de Indel

Artigos relacionados