Artigo de método

Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz

DOI:

10.3791/59960

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2 de setembro de 2019

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1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).

Resumo

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As lesões locais induzidas alvo em genomes (TILLING) são uma estratégia da genética reversa para a seleção da elevado-produção de mutações induzidas. Entretanto, o sistema de TILLING tem menos aplicabilidade para a deteção da inserção/apagamento (Indel) e o TILLING tradicional precisa etapas mais complexas, como a digestão do nuclease do CEL I e a electroforese do gel. Para melhorar a eficiência da produção e da seleção, e para fazer a seleção dos indels e das Substitions de base únicas (SBSs) possíveis, um derretimento High-Resolution novo (HRM)-baseou o sistema de LAVRAMENTO é desenvolvido. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado de HRM-TILLING e mostramos sua aplicação na seleção da mutação. Este método pode analisar as mutações de amplicões do PCR medindo a desnaturação do ADN dobro-encalhado em altas temperaturas. A análise de HRM é executada diretamente borne-PCR sem processamento adicional. Além disso, um método simples, seguro e rápido da extração do ADN (SSF) é integrado com HRM-TILLING para identificar indels e SBSs. Sua simplicidade, robustez e alta taxa de transferência torná-lo potencialmente útil para a mutação de digitalização em arroz e outras culturas.

Introdução

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Mutantes são importantes recursos genéticos para a pesquisa de genômica funcional de plantas e criação de novas variedades. Uma aproximação da genética para diante (isto é. da seleção do mutante ao clonagem do gene ou ao desenvolvimento da variedade) usou-se para ser o método principal e único para o uso de mutações induzidas aproximadamente 20 anos há. O desenvolvimento de um novo método de genética reversa, o TILLING (direcionamento de lesões locais induzidas em genomas) por McCallum et al.1 , abriu uma nova paradigma e desde então tem sido aplicado em um grande número de espécies de animais e plantas2. O TILLING é par....

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Protocolo

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1. os preparativos

  1. Desenvolvimento de populações mutagenizadas com raios γ
    1. Trate aproximadamente 20.000 sementes secadas do arroz (com índice de umidade de CA. 14%) de uma linha de arroz japonica (por exemplo, DS552) com raios gama 137Cs em 100 GY (1 GY/min) em uma instalação de irradiação γ (por exemplo, célula gama).
      Nota: as sementes utilizadas para o tratamento devem ter uma elevada viabilidade (por exemplo, com uma taxa de germinação > 85%). A dose de irradiação para o arroz indica pode ser aumentada para 150 GY.
    2. Semear as sementes irradiadas após a germinação em um leito de mudas e t....

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Resultados

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Análise e digitalização de HRM

No total, 1.140 amostras de DNA agrupadas de 4.560 M2 mudas foram produzidas e submetidas à amplificação de PCR. Dois fragmentos com o tamanho de 195 BP e 259 BP foram amplificados para OsLCT1 e SPDT, respectivamente (tabela 2). A maioria das amostras apresentou curvas de fusão não significativamente diferentes do WT (ΔF < 0, 5). Curvas de HRM significativamente diferentes do WT (ΔF > 0, 5) fora.......

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Discussão

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O TILLING provou ser uma poderosa ferramenta genética reversa para identificar mutações induzidas para a análise funcional do gene e a criação de culturas. Para algumas características que não são facilmente observadas ou determinadas, a TILLING com detecção de mutação baseada em PCR de alta taxa de transferência pode ser um método útil para obter mutantes para diferentes genes. O método HRM-TILLING tem sido utilizado em populações EMS-mutagenizadas de tomate12, trigo11 e v.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo programa-chave nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (no. 2016YFD0102103) e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 31701394).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 vezes; Taq mais PCR Master MixTiangen, ChinaKT201Tampão de PCR, dNTP e polimerase para amplificação de PCR
Placa de 96 poçosBio-rad, AméricaMSP-9651Placa específica para PCR na análise de HRM
Mastercycler nexusEppendorf, AmplificaçãoPCRde 6333000073
LightScannerIdaho Technology, EUALCSN-ASY-0011Para amostragem de fluorescência e processamento
CALL-IT 2.0Idaho Technology, EUAPara análise da mudança de fluorescência
EvaGreenBiotium, EUA31000-TCorante de fluorescência de HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, EUAND2000Para quantificação de DNA
de alemã

Referências

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  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P.

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Etiquetas

Triagem de Muta esExtra o de DNAOtimiza o de PCRAn lise HRMEletroforese em GelSequenciamento de SangerCultivos de ArrozDetec o de Indel

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