Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Resumo

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Resumo

Um objetivo central da genética moderna é entender como e por que os organismos no selvagem diferem no fenótipo. Até agora, o campo avançou pela maior parte na força de métodos do enlace e da Associação de mapeamento, que traçam a relação entre variações da seqüência do ADN e phenotype através da progêia de recombinação dos acasalamentos entre indivíduos de uma espécie. Essas abordagens, embora poderosas, não são bem adaptadas às diferenças de traço entre espécies reproductivamente isoladas. Aqui nós descrevemos um método novo para a dissecção genoma-larga da variação natural do traço que pode prontamente ser aplicada às espécies incompatíveis. Nossa estratégia, RH-Seq, é uma implementação de todo o genoma do teste de hemizygote recíproco. Nós aproveitamos-lo para identificar os genes responsáveis para o crescimento de alta temperatura impressionante da levedura Saccharomyces cerevisiae em relação à sua espécie irmã S. paradoxus. RH-Seq utiliza a mutagenese do transposon para criar um pool de hemizygotes recíprocos, que são seguidos então através de uma competição de alta temperatura através de arranjar em seqüência da elevado-taxa de transferência. Nosso fluxo de trabalho RH-Seq, conforme estabelecido aqui, fornece uma maneira rigorosa e imparcial de dissecar traços antigos e complexos no clado de levedura em brotamento, com a advertência de que o sequenciamento profundo intensivo em recursos é necessário para garantir a cobertura genômica para o mapeamento genético. À medida que os custos de sequenciamento caem, essa abordagem tem grande promessa para uso futuro em eucariontes.

Introdução

Desde o alvorecer do campo, tem sido um objetivo primordial na genética para entender a base mecanicista da variação entre os indivíduos selvagens. À medida que mapeamos o locus subjacente a uma característica de interesse, os genes emergentes podem ser de uso imediato como alvos para diagnósticos e drogas, e podem esclarecer os princípios da evolução. O padrão da indústria para este fim é testar para uma relação entre o genótipo e o phenotype através de uma população através do enlace ou da Associação¹. Poderosos como essas abordagens são, eles têm uma limitação-chave-eles dependem de grandes painéis de descendência recombinante de cruzamentos....

Protocolo

1. preparação do plasmídeo contendo piggyBac para transformação

1. Raia para fora às únicas colônias a tensão de E. coli que endireita o plasmídeo pJR487 em uma placa do agar da carbenicilina de lb +. Incubar por 1 noite no ° c 37 ou até que as únicas colônias apareçam.
   Nota: uma descrição de como plasmídeo pJR487 foi clonado pode ser encontrado em nosso trabalho anterior³.
2. Inocular 1 L de LB + carbenicilina a 100 μg/mL com uma única colônia de E. coli contendo pJR487 em um balão de vidro de 2 l. Cresça durante a noite em 37 ° c com agitação em 200 rpm até saturado (OD₆₀₀ ≥ 1,0).
3. Purifi....

Resultados

Nós acoplamos s. cerevisiae e s. paradoxus para formar um híbrido estéril, que nós sujeitamos à mutagenese do transposon. Cada clone mutagenized era um hemizygote, um híbrido Diploid em que um alelo de um gene é interrompido (Figura 1a, Figura 2). Nós competimos os hemizygotes um contra o outro pelo crescimento em 39 ° c e, em uma experimentação separada como um controle, em 28 ° c (Figura 1b), e N.......

Discussão

As vantagens do RH-Seq sobre os métodos estatísticos-genéticos precedentes são várias vezes. Em contraste com a análise do enlace e da associação, RH-Seq oferece a definição do mapeamento do único-gene; como tal, provavelmente será de utilidade significativa mesmo em estudos de variação de traço entre indivíduos de uma determinada espécie, bem como diferenças interespecíficas. Também, as tentativas precedentes na análise recíproca genoma-larga do hemizygosity usaram coleções de mutants do apagamento do gene, alguns de qu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-2 kits de plasmídeo Gigaprep	Zymo Research	D4204	O número de kits necessários depende de quão eficientes são suas preparações em cada kit. Este kit vem com 5 colunas individuais de preparação de plasmídeo. Execute 1 L de cultura de E. coli saturada em cada coluna de preparação, pois o uso de mais de 1 L por coluna pode causar entupimento do filtro de preparação, levando a baixo rendimento e DNA de baixa qualidade.
10X Tris-EDTA (TE) tampão (100 mM Tris-HCl e 10 mM EDTA)	Qualquer	N/A	esteriliza através de um 0.22 μ m antes de usar.
1M LiOAc	Qualquer	N/A	esteriliza através de um 0,22 μ m antes de usar.
300 mg/mL de Geneticina (G418)	Gibco	11811023
52% polietilenoglicol (PEG) 3350	Sigma	1546547	Dissolver em água e esterilizar por filtro através de um 0,22 μ m antes de usar. 1X mistura de trafo: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer
Caldo líquido LB autoclavado	BD Difco	244620	Faça caldo líquido LB usando seu pó de qualquer marca e água milliQ. Autoclave-o antes de usar.
Estoque de carbenicilina em água (100 mg/mL)	Qualquer	N/A	esteriliza através de um 0,22 μ m antes de usar.
Placas de ágar sintéticas completas (24,1 cm x 24,1 cm) com ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) [0,2% de mistura de aminoácidos drop-out sem uracila ou base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005% de uracila, 2% de D-glicose, 0,67% de YNB sem aminoácidos, 0,075% de 5-FOA]	5-FOA: Zymo Research, Mistura drop-out: US Biological, Uracil: Sigma, D-glicose: Sigm), YNB: Difco	5-FOA: F9001-5, Mistura drop-out: D9535, Uracila: U0750, D-glicose: G8270, YNB: DF0919
DMSO	Qualquer	de N/A
E. coli portadora de pJR487 (plasmídeo contendo CEN-/ARS+ piggyBac)	N/A	/A	Solicitação do laboratório Brem.
Cepa de levedura híbrida JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)	N/A	N/A	Solicitação do laboratório Brem.
Illumina Hiseq 2500			usado para SE-150 lê
Grandes incubadoras de agitação com configurações de temperatura variável	Qualquer	N/A
LB + placas de ágar carbenicilina (100 μ g/mL)	Ágar: BD Difco	Ágar: 214010	Faça placas de ágar LB normalmente e adicione carbenicilina a 100 μ g/mL antes da secagem.
Espectrofotômetro	Nanodrop Thermo Scientific	ND-2000
Qubit Fluorímetro	Thermo Scientific	Q33240
DNA de esperma de salmão	Invitrogen	15632011
Banho-maria a 39° C	Qualquer	N/A
Kit de preparação de gDNA fúngico de levedura	Zymo Research	D6005
Meio líquido de peptona de levedura dextrose (YPD)	BD Difco	Peptona: 211677, Extrato de levedura: 212750	Adicione D-glicose esterilizada por filtro a 2% após a autoclavagem.
Placas de ágar YPD + G418 (300 μ g/mL)	Ágar: BD Difco	Ágar: 214010	Faça placas de ágar YPD normalmente e adicione G418 a 300 μ g/mL antes da secagem.
Placas de ágar YPD	Ágar: BD Difco	Ágar: 214010

filtro filtro filtro cepa N