Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.
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Artigo de método
Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A definição dos mecanismos celulares subjacentes à doença é essencial para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Uma estratégia freqüentemente usada para desvendar esses mecanismos é introduzir mutações nos genes candidatos e descrever qualitativamente as alterações na morfologia dos tecidos e organelas celulares. Entretanto, as descrições qualitativas não podem capturar diferenças fenotípicas sutis, podem deturpar variações fenotípicas em indivíduos de uma população, e são freqüentemente avaliadas subjetivamente. Aqui, abordagens quantitativas são descritas para estudar a morfologia dos tecidos e organelas no nematódeo Caenorhabditis elegans usando microscopia confocal de varredura a laser combinada com software de processamento de bioimagem disponível comercialmente. Uma análise quantitativa de fenótipos que afetam a integridade da sinapse (tamanho e níveis de fluorescência integrados), desenvolvimento muscular (tamanho da célula muscular e comprimento do filamento da miosina) e morfologia mitocondrial (circularidade e tamanho) foi realizada para entender os efeitos das mutações genéticas nestas estruturas celulares. Essas abordagens quantitativas não se limitam às aplicações aqui descritas, pois poderiam prontamente ser utilizadas para avaliar quantitativamente a morfologia de outros tecidos e organelas no nematoide, bem como em outros organismos modelo.
Introdução
O nematódeo Caenorhabditis elegans (C. elegans) é cada vez mais utilizado como um sistema modelo para desvendar os processos biológicos e moleculares envolvidos na doença humana. Um nematódeo adulto tem um comprimento de corpo de pouco mais de 1 mm, e pode produzir uma grande ninhada de até 300 ovos1. Após a eclosão, C. elegans só exigem 3-4 dias para atingir a idade adulta, e viver por cerca de 2 a 3 semanas2. Devido à sua facilidade de cultivo, C. elegans é atualmente um dos modelos animais mais procurados in vivo para a realização de triagem de drogas rentável e rápida para identifi....
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Protocolo
1. crescimento e manutenção de cepas de C. elegans
- Sementes de meio de crescimento de nematódeos (NGM, ver tabela de materiais) placas de agar com 300 μl da estirpe de E. coli de crescimento lento OP50 em um armário de fluxo laminar.
- Deixe as placas de agar NGM no gabinete de fluxo laminar para secar.
Nota: na ausência de armário do fluxo laminar, as placas podem ser deixadas para secar no banco mas são mais propensas à contaminação. - Transfira pelo menos 20 animais para cada uma das duas placas de agar NGM OP50-semeadas para ter estoques de trabalho. Há duas maneiras principais de transferir animais.<....
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Resultados
C. elegans é um organismo modelo ideal para estudar a morfologia de diferentes tecidos e organelas devido à sua simplicidade, linhagem celular conhecida, transparência e ferramentas disponíveis. Aqui, nós fornecemos abordagens quantitativas para o estudo de organelas (por exemplo, mitocôndria) e tecidos, incluindo sinapses e músculos usando imagens de fluorescência ao vivo e software de processamento de bio imagem livre.
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Discussão
As variações morfológicas foram avaliadas freqüentemente através da contagem manual de diferenças visíveis ou de usar limiares arbitrários para determinar defeitos em comparação a um phenotype do selvagem-tipo. Mais recentemente, entretanto, os métodos quantitativos foram usados para estudos comparativos da morfologia para medir exatamente e descrever mudanças em um nível celular e subcellular em uma forma imparcial. A capacidade de identificar diferenças sutis e biologicamente relevantes entre os fenótipos é um meio pod.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório de Neumann por discussões e entradas valiosas. Algumas cepas foram fornecidas pela CGC, que é financiada pelo NIH Office de programas de infra-estrutura de pesquisa (P40 OD010440). Os autores agradecem à WormBase por sua riqueza de informações sobre C. elegans, e reconhecem a Monash micro Imaging, a Monash University, para o fornecimento de instrumentação, treinamento e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa da CMTAA (2015 e 2018), e o projeto NHMRC concede 1101974 e 1099690 concedidos à B.N.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar-ágar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Microscópio confocal | Leica | TCS SP8 | Plataforma invertida |
| Microscópio de fluorescência | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Lamínulas de vidro #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass lamínulas #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Fabricado pela SCHOTT |
| Lâminas de vidro | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Triptona (Peptona de caseína) | Merck | 107213 | Ingredientes para Caldo de Lisogenia (LB) Extrato de |
| Levedura Médio | Merck | 103753 | Ingredientes para Caldo de Lisogenia (LB) médio |
| Cloreto de sódio | Merck | 106404 | Ingredientes para Caldo de Lisogenia (LB) médio |
| Peptona (Peptona de carne) | Merck | 107214 | Ingredientes para Meio de Crescimento de Nematóides (NGM) |
| ágar Ágar | Sigma | A1296 | Ingredientes para Meio de Crescimento de Nematóides (NGM) ágar |
| Cloreto | de sódioMerck | 106404 | Ingredientes para Meio de Crescimento de Nematóides (NGM) ágar |
| Colesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredientes para Meios de Crescimento de Nematóides (NGM) ágar |
| Cloreto de cálcio | Merck | 102382 | Ingredientes para Meios de Crescimento de Nematóides (NGM) ágar |
| Sulfato de magnésio | Merck | 105886 | Ingredientes para Meios de Crescimento de Nematóides (NGM) ágar |
| Fosfato dipotássico | Ingredientes 105101 da Merck | para o ágar Meio de crescimento de nematóides (NGM) | |
| Di-hidrogenofosfato de potássio | 104873 | Merck | para o ágar Meios de crescimento de nematóides (NGM) |
| Fosfato dissódico | Merck | 106586 | Ingredientes para tampão M9 |
| Cloreto de sódio | Merck | 106404 | Ingredientes para tampão M9 |
| Di-hidrogenofosfato | de potássioMerck | 104873 | Ingredientes para tampão M9 |
| Sulfato de magnésio | Merck | 105886 | Ingredientes para tampão M9 |
| Pipeta Pasteur | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Placas de Petri | Corning | CLS430589-500EA | |
| Fio de platina | Sigma | 267201-2G | |
| Espátula | Met-app | 2616 | |
| Cloridrato de tetramisol | Sigma | L9756-5G |
Referências
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M.
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Reimpressões e permissões
