As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.
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Artigo de método
Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durotaxis é o processo pelo qual as células sentem e respondem a gradientes de tensão. A fim de estudar este processo in vitro, a rigidez do substrato subjacente a uma célula deve ser manipulada. Quando os hidrogéis com rigidez graduada e os ensaios a longo prazo da migração provaram útil em estudos do durotaxis, as respostas imediatas, agudas às mudanças locais na tensão da carcaça permitem o estudo focalizado de movimentos individuais da pilha e de eventos de sinalização subcellular. Para testar repetivelmente a capacidade das células de sentir e responder à rigidez subjacente do substrato, um método modificado para aplicação de gradientes agudos de tensão aumentada para células individuais cultivadas em hidrogéis deformáveis é usado, o que permite o tempo real manipulação da força e direção dos gradientes de rigidez transmitidos sobre as células em questão. Adicionalmente, ajustando os detalhes e os parâmetros do ensaio, tais como a forma e as dimensões da micropipeta ou a posição relativa, a colocação, e a direção do gradiente aplicado, o ensaio pode ser otimizado para o estudo de qualquer tipo e sistema de células sensíveis. Esses parâmetros podem ser alterados para alterar de forma confiável o estímulo aplicado e ampliar a funcionalidade e a versatilidade do ensaio. Este método permite a examinação do movimento durotactic a longo prazo assim como umas mudanças mais imediatas na sinalização celular e na dinâmica morfológica em resposta à rigidez de mudança.
Introdução
Ao longo das últimas décadas, a importância das propriedades mecânicas do ambiente de uma célula tem aumentado o reconhecimento na biologia celular. Diferentes tecidos e matrizes extracelulares têm diferentes rigidez relativa e, à medida que as células migram por todo o corpo, elas navegam nessas mudanças, utilizando essas propriedades mecânicas para orientá-las1,2,3 , 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. Cells use a rigidez de um determinado tec....
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Protocolo
1. fabricação de hidrogéis deformable de polyacrylamide com as microesferas fluorescentes encaixadas
Nota: As direções descrevem a polimerização de um hidrogel de 25 kPa com 22 μm de diâmetro e aproximadamente 66 μm de espessura. Cada um ou todos estes parâmetros podem ser modificados e direções para fazê-lo podem ser encontrados na tabela 1 e nas notas17.
- Ativação de pratos de fundo de vidro ou coberturas
- Prepare a solução de trabalho do silano do ligamento para a ativação de um prato do vidro-fundo da imagem latente ou de um lamela que caiba em ....
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Resultados
Ao preparar micropipetas (Figura 1) e normalizando a geração de força das trações (Figura 2 e Figura 3), conforme descrito acima, foram identificadas condições durotáticas ideais para múltiplas linhagens celulares. Usando essa técnica, conforme descrito na Figura 4, ambas as células de câncer de ovário de SKOV-317 e Ref52 de ratos embrionários (Figura 5
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Discussão
Demonstrado aqui é um ensaio de durotaxis repetível, de célula única que permite a avaliação da capacidade de uma célula de alterar seu comportamento de migração em resposta a pistas mecânicas agudas. Esta técnica pode igualmente ser usada em combinação com a microscopia de fluorescência e as proteínas ou os biossensors apropriados da fusão para examinar a sinalização subcellular e os eventos cytoesqueléticos dentro dos segundos da estimulação mecânica ou sobre um temporal mais longo durante movimento durotáctico. Compre.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acrilamida 40 % | EC-810 | da National Diagnostic | |
| Fisher | BP179-25 | ||
| BD20A Gerador de alta freqüência | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Ligação de Vara Corona Portátil |
| Silane (y-metacriloxipropiltrimetoxissilano) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrilamida 2% | Capilares de | EC-820 | |
| 1B100-4 | |||
| Branson 2510 da | Bransonic | 40 quilohertz | |
| Manipulador grosseiro | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM sem vermelho do fenol | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Fator de Crescimento Epidérmico | |||
| Etanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Soro Fetal Bovino (Qualificado One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| EMD Millipore | FC010 | ||
| Fluosferas Carboxilato 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μ g DNA / 6 μ L fugene 6 por prato de 35 mm |
| Ácido Acético Glacial | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Prato de Fundo de Vidro | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Concentrado de limpeza especial | Sigma Aldrich | Z805939 | Usado a 2% em ddH2O para limpeza de lamínulas |
| HEPES em pó | Sigma Aldrich | H3375 | Faça tampão HEPES de 50mM, pH 8,5 |
| Intelli-Ray 400 Holofote UV Fechado | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulador | Narshige | MHW3 | |
| Óleo Mineral | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 28,6 mM Na2HPO4, 1,6 mM KH2PO4, pH 7,4 | ||
| Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB)Sigma | Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Linha celular de fibroblastos embrionários de ratos; Cultura em DMEM + 10% de tampão | ||
| Ringer | 134 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 2,4 mM de CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM de D-Glicose, pH 7,4 | ||
| SKOV-3 | Cultura de Tipo Americano | em DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Limpeza de Plasma de Mesa | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
Referências
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al.
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Reimpressões e permissões
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