É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.
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Artigo de método
Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A administração das vias aéreas de lipopolissacárido (LPS) é uma maneira comum de estudar a inflamação pulmonar e a lesão pulmonar aguda (ALI) em modelos animais pequenos. Várias aproximações foram descritas, tais como a inalação de LPs aerosolized assim como a instilação nasal ou intratraqueal. O protocolo apresentado descreve um procedimento passo a passo detalhado para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal direta dos LPs e executa a análise de FACS das amostras de sangue, do líquido broncoalveolar do lavagem (BAL), e do tecido do pulmão. Após sedação intraperitoneal, a traquéia é exposta e a LPS é administrada através de cateter venoso de 22 G. Uma reação inflamatória robusta e reprodutível com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias, e ruptura da barreira alveolo-capilar é induzida dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS usada. A coleta de amostras de sangue, o fluido de LBA e a colheita pulmonar, bem como o processamento para a análise de FACS, são descritos detalhadamente no protocolo. Embora o uso do LPS estéril não seja adequado para estudar intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, a abordagem descrita oferece uma invasividade mínima, manuseio simples e boa reprodutibilidade para responder a questões imunológicas mecanísticas. Além disso, a titulação da dose assim como o uso de preparações alternativas do LPS ou de tensões do rato permitem a modulação dos efeitos clínicos, que podem apresentar graus diferentes de severidade de ALI ou início contra o início atrasado de sintomas da doença.
Introdução
Modelos experimentais de animais são indispensáveis na pesquisa imunológica básica. A administração de bactérias inteiras ou componentes microbianos tem sido freqüentemente usada em pequenos modelos animais para induzir inflamação local ou sistêmica1. Lipopolissacarídeo (LPS, ou endotoxina bacteriana) é um componente da parede celular e antígeno de superfície de bactérias Gram-negativas (por exemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., ou Legionella spp.). A molécula termotérmica e grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste em uma fração lipídica (lipídios a), região central (oligossacarídeos), e um polissacarídeos o (ou o antígeno). O lipídio a, com suas correntes de ácidos graxos hidrofóbicos, Ancora a molécula em uma membrana bacteriana e Medeia (após a degradação das bactérias) a atividade imunológica e a toxicidade dos LPs. Após ligação à proteína de ligação LPS (LBP), os complexos LPS: LBP ligam o complexo receptor CD14/TLR4/MD2 localizado na superfície de muitos tipos de células, induzindo uma forte reação pró-inflamatória com translocação nuclear de NF-κB e subsequente upregulação da expressão de citocina2.
A lesão pulmonar aguda (ALI) é definida como insuficiência respiratória hipoxêmica aguda com edema pulmonar bilateral na ausência de insuficiência cardíaca3. A administração das vias aéreas de LPs é uma forma comum de induzir inflamação pulmonar e ali4,5,6,7. Embora a substância estéril não seja adequada para o estudo de intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, as questões imunológicas mecanísticas podem ser respondidas com precisão adequada. A instilação de LPS na traquéia induz uma reação inflamatória robusta com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias e ruptura da barreira alveolócapilar dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS3, 6,7.
O protocolo apresentado descreve um procedimento detalhado da etapa-por-etapa para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal dos LPs. O modelo foi validado avaliando-se a expressão de citocinas, invasão de granulócitos neutrofínicos e vazamento de albumina intralalveolar, conforme descrito anteriormente8.
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Protocolo
Este protocolo animal foi aprovado pelo comitê local para o cuidado animal (LANUV, Recklinghausen, Germany; protocolo no. 84-02.04.2015) e foi executado de acordo com as directrizes nacionais dos institutos de saúde para o uso de animais vivos (publicação de NIH N º 85-23, revisado em 1996).
1. indução de ALI
- Use adultos C57BL/6 camundongos em idades de cerca de 10-12 semanas. Abrigar os animais em gaiolas individualmente ventiladas com acesso gratuito à água e ração de roedores padrão. No entanto, é possível realizar essa abordagem em animais mais jovens e com outras cepas de camundongos.
- Conservar LPS (Escherichia coli O111: B4) em alíquotas em concentrações de 5 mg/mL a-20 ° c. Para a instilação intratraqueal, diluir LPS em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a uma concentração final de 2.000 μg/mL.
- Pesar o mouse. Injete cetamina [120 mg/kg de peso corporal do rato (BW)] e xilazina (16 mg/kg BW) intraperitonealmente (um terço inferior do abdome, paramediano) e aguarde até o início da anestesia.
- Verifique a profundidade da anestesia induzindo um estímulo tátil. Em caso de anestesia insuficiente, repita a injeção com cetamina (30 mg/kg BW) e xilazina (4 mg/kg BW).
- Coloque o mouse em posição prona em uma tabela de temperatura controlada para manter uma temperatura corporal de 37 ° c.
- Aplique o lubrificante oftálmica estéril para impedir o desseccation das córneas a anestesia.
- Levante os incisivos da cabeça e do gancho em uma barra horizontal posicionada aproximadamente 5 cm acima da tabela quando as patas dianteiras permanecerem no contato próximo com a tabela. Super-estender o pescoço em um ângulo de 90 ° em relação à tabela (Figura 1). Segure a língua com fórceps para endireitar a garganta para condições de intubação mais fácil.
- Corte um cateter venoso de calibre 22 (G) a um comprimento de 20 mm. Insira suavemente o cateter na direção vertical ao longo da raiz da língua. Coloque uma fonte de luz fria na pele acima da laringe para ajudar a visualizar as cordas vocais e apontar para a traquéia. Se ocorrer resistência da laringe, retrair o cateter alguns milímetros antes de avançar novamente.
- Insira o cateter aproximadamente 10 mm na traqueia. Assegure-se de que a inserção não seja demasiado profunda porque isto conduzirá à instilação unilateral do líquido no brônquio principal direito ou esquerdo.
- Injetar LPS (5 μg/g BW) diluído em PBS utilizando uma pipeta [o volume injetado depende do peso corporal do rato (por exemplo, 20 g de peso corporal → utilizar 50 μL de solução LPS)].
Nota: o rato responderá tipicamente com tossir ou ofegando à instilação apropriada do líquido na traqueia. - Conecte uma seringa e adicione um bolus de 50 mL de ar para garantir que o volume líquido completo é distribuído nos pulmões. Retire lentamente o cateter.
- Mantenha o corpo superior do rato numa posição vertical durante 30 s para evitar fugas do fluido da traquéia.
- Em animais operados por Sham, injete 50 μL de PBS estéril intratraqueal em vez de LPs.
- Injete o cloridrato de buprenorfina 0, 8 mg/kg BW por via subcutânea na pele frouxa sobre a garganta imediatamente depois da indução de ali e cada 12 h depois disso, durante o primeiro 48 h.
- Mantenha uma temperatura de corpo de 37 ° c até que a consciência cheia esteja recuperada mantendo o rato na almofada de aquecimento.
- Transfira o rato para uma gaiola ventilada individualmente com acesso gratuito à comida e água. Monitore o mouse regularmente. Diminuir a temperatura corporal e a depressão respiratória indica a indução adequada de ALI.
2. amostragem de sangue, lavagem broncoalveolar, colheita de órgãos
Nota: o tempo de eutanização depende da questão científica abordada. Normalmente, é realizada 12-72 h após a instilação de LPs3,4,9,10. A severidade da ALI pode ser determinada clinicamente pela observação regular da temperatura corporal e dos sintomas de desconforto respiratório11.
- Induzir a anestesia, colocando o mouse em uma câmara inundada com isoflurano. Use 3 vol% de isoflurano com um fluxo de oxigênio de 1 L/min. assegure a narcose profunda induzindo um estímulo tátil. Em caso de insuficiente profundidade de anestesia, aumente o isoflurano até 5 vol%.
- Sacrifique o rato em anestesia profunda por luxação atlanto-occipital.
- Fixar o mouse com fita em uma mesa de operação e logo desinfectar a pele sobre o abdômen com 70% etanol. Abra a cavidade abdominal com cuidado na linha mediana com tesouras e tweezers. Retire partes do intestino para alcançar o acesso ao direito da veia cava inferior (IVC) à coluna vertebral e à aorta abdominal.
- Localize as veias renais e insira uma cânula de 23 G dobrada conectada a uma seringa de 1 mL no IVC diretamente abaixo da confluência das veias. Aspirar 250 μL de sangue e transferir para um tubo de 1,5 mL preenchido com 20 μL de 0,5 M de ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) solução. Agitar suavemente para facilitar a mistura de EDTA e colocar o tubo no gelo.
- Para lavagem broncoalveolar (LBA), prepare três seringas de 1 mL com 0,5 mL de PBS estéril e 0,1 mL de ar cada. Em breve desinfectar a pele da garganta com etanol 70% e expor cuidadosamente a traquéia com tesouras e pinças. Mobilizar a traquéia e enrole em torno de uma sutura.
- Executar BAL: perfure a traqueia utilizando Microtesouras e insira um cateter venoso de 22 G cortado a um comprimento de 20 mm. fixar o cateter com a sutura e instilar 0,5 mL de PBS estéril e 0,1 mL de ar. Aspirar o fluido após 60 s. Repita o procedimento com as duas seringas adicionais e colete todo o aspirado em um tubo de 15 mL no gelo.
- Abra cuidadosamente o tórax com tesouras e pinças para colher os pulmões. Corte o diafragma ao longo da margem costal e corte através das costelas com duas incisões laterais. Evite perfurar cuidadosamente os pulmões. Levante o esterno cranialmente e fixe-o ou retire-o.
- Prepare 2 10 seringas mL com PBS 37 ° c quente (sem cálcio e magnésio). Faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo. Perfure o ventrículo direito com uma cânula de 26 G e lave a circulação pulmonar com o PBS pré-aquecido. Esteja ciente dos pulmões que giram pálido durante o procedimento.
- Retire o lobo direito dos pulmões e corte-o em duas metades. Encaixe-congele-os no nitrogênio líquido, seguido pelo armazenamento a longo prazo em-80 ° c para uma análise mais adicional da expressão genética e da proteína.
- Remova o pulmão esquerdo inteiro e Homogeneize-o em uma placa do poço 48 picando o tecido com Scissor e tweezer. Incubar o tecido em 2 ml de tampão de digestão [RPMI 1640 com 10% de soro de bezerro fetal (FCS) e 0,1% Nan3, colagenase I (1 mg/ml) e DNase II (7 mg/ml)] a 37 ° c por 60 min. realize uma homogeneização adicional por pipetagem cuidadosa das partes do tecido pulmonar para baixo.
3. preparação do tecido para a análise de FACS
- Prepare o tampão novo de FACS (tabela 1): Use sempre o PBS cálcio-e magnésio-livre para reduzir a adesão cátion-dependente da pilha-à-pilha e para impedir aglutina. Suplemento com FCS (1%) para proteger as células da apoptose, prevenir a coloração não específica e impedir que as células aderem aos tubos FACS. Inclua o EDTA (0,5 milímetros) para impedir a aderência da pilha-à-pilha cátion ao trabalhar com as pilhas pegajosas e aderentes como macrófagos. Adicionar azida sódica (0,1%), pois previne a contaminação bacteriana e o fotobranqueamento de fluorocromos e bloqueia o derramamento de anticorpos.
- Transfira as amostras de sangue (passo 2,4) para 5 mL de tubos FACS e misture suavemente o sangue com 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Põr os tubos no gelo e termine a reação após 2 minutos adicionando 2 mL do PBS Ice-Cold. Centrifugue as amostras durante 5 min a 400 x g e elimine o sobrenadante. Resuspend a pelota da pilha com 60 μL do tampão e do processo de FACS para a mancha subseqüente de FACS de acordo com protocolos previamente descritos12.
Nota: o sincronismo da eutanização do rato influencia a contagem da leucócito como parte da inflamação sistemática. Portanto, recomenda-se ajustar o número da célula para 1 x 106 células/60 μl nesta etapa para obter os melhores resultados de coloração para análise de citometria de fluxo. - Centrifugue o líquido do BAL (etapa 2,6) por 5 minutos em 400 x g. Aspirar o sobrenadante e congelá-lo em nitrogênio líquido, seguido de armazenamento de longo prazo em-80 ° c para análise de proteínas adicionais. Ressuscita a pelota da pilha do BAL com 2 mL do amortecedor frio de FACS, a seguir transfira a suspensão em um tubo de 5 mL FACS usando um filtro da malha de 100 μm para conter os cabelos.
- Novamente, centrifugue a amostra por 5 min a 400 x g. Ressuspender a pelota com 60 μL de tampão de FACS e processar para a mancha subseqüente de FACS de acordo com os protocolos previamente descritos12.
Nota: o tempo de eutanização do rato influencia a contagem leucocitária no LBA como parte da inflamação. Portanto, recomenda-se ajustar o número da célula para 1 x 106 células/60 μl nesta etapa para obter os melhores resultados de coloração para análise de citometria de fluxo. - Transfira o tecido do pulmão esquerdo digerido (passo 2,10) para um tubo FACS de 5 mL utilizando um filtro de malha de 100 μL para extrair aglomerados e encerrar o processo de digestão adicionando 2 mL de tampão FACS gelado. Centrifugue a amostra por 5 min a 400 x g. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota com 60 μL de tampão de FACS e processe para posterior coloração de FACS de acordo com os protocolos previamente descritos12.
Nota: o tempo de eutanização do rato influencia a contagem leucocitária no tecido pulmonar como parte da inflamação. Portanto, recomenda-se ajustar o número da célula para 1 x 106 células/60 μl para obter os melhores resultados de coloração para a análise de citometria de fluxo. - Para a análise de FACS, incubar células com anticorpo CD16/CD32 a 4 ° c por 15 min para bloquear a ligação não específica da imunoglobulina aos receptores FC. Adicionar 20 μL de solução de bloqueio a 1 x 106 células em 60 μl num tubo de 5 ml.
- Enquanto isso, prepare uma mistura mestra com tampão e anticorpos FACS conforme descrito na tabela 2.
- Após o bloqueio, não lave as células. Adicionar 20 μL de mistura mestre de anticorpos por amostra para obter um volume final de 100 μL. Incubar as amostras durante 20 min no escuro a 4 ° c.
- Lave cada amostra com 1 mL de tampão FACS e centrifugue durante 5 min a 400 x g. Descarte o sobrenadante e ressuscitem o pellet com tampão FACS para a concentração celular apropriada para medições de FACS.
Nota: um número de célula de 1 x 106 células/500 μl é sugerido para alcançar os melhores resultados de fenotipagem imunológica na análise FACS com este protocolo. No entanto, recomenda-se que os anticorpos têm de ser titulados individualmente. - Se necessário, adicione a mancha viva/inoperante antes da mancha da superfície usando os jogos comercialmente disponíveis específicos8.
- Finalmente, adicione números fixos de grânulos de calibração fluorocromo-acoplados comercialmente disponíveis (3 x 105 grânulos em 20 μl do tampão de FACS) a cada amostra para determinar números de pilha absolutos12. A estratégia de gating para sangue, LBA e células teciduais é mostrada na Figura 2.
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Resultados
A aproximação descrita para induzir o ali nos ratos foi validada avaliando a expressão do citocinas, a infiltração do granululocyte do neutrófilo, e o rompimento alveolo-capilar da barreira 24 h e 72 h após a instilação dos LPs. Os animais injetados em PBS serviram de controle. A administração de LPS intratraqueal induziu uma resposta pró-inflamatória pulmonar robusta. A expressão de TNF-α no tecido pulmonar foi significativamente upregulada, atingindo um aumento sustentado e maior que 50 vezes comparado aos animais cont...
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Discussão
A invasividade mínima, a manipulação simples e a boa reprodutibilidade são características-chave da abordagem apresentada para induzir a ALI em um pequeno modelo de roedores. O uso de LPS em vez de bactérias inteiras em modelos animais tem vantagens. É um composto estável e puro e pode ser armazenado em forma liofilizada até o uso. É um potente estimulante para respostas imunes inatas através da via TLR4, e sua atividade biológica pode ser prontamente quantificada, facilitando a titulação da severidade da doença com boa ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer a Jan Kleiner e Susanne Schulz por prestarem apoio técnico. Os autores reconhecem o apoio excelente da facilidade do núcleo da citometria do fluxo na faculdade médica da Universidade de Bona. Os autores não receberam nenhum financiamento de qualquer organização externa. Uma parte dos dados fornecidos na seção de resultados e descrita na Figura 3 já foi mostrada em uma publicação anterior8.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringas de 1 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 300013 | |
| seringas de 10 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Hidrocloro de buprenorfina | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 camundongos, fêmea, 10 - 12 semanas de idade | Charles River, Wilmongton, MA, EUA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µ m) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA | 340487 | |
| Cânula 23 calibre 1''BD | , Franklin Lakes, NJ, EUA | 300800 | |
| Cânula 26 calibre 1/2''BD | , Franklin Lakes, NJ, EUA | 303800 | |
| Filtro de células 70 µ m | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA | 352350 | |
| Colagenase Tipo I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | 1148089 | |
| Desoxirribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | D8764 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS), estéril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | D8662 | |
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS), sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, estéril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | D8537 | |
| Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | E7889 | |
| Tubos FACS, 5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | 551579 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | Fórceps F2442 | |
| Fine | Science Tools, Heidelberg, Alemanha | 11049-10 | |
| Isoflurano | Baxter, Unterschleiß heim, Alemanha | ||
| Cloridrato de cetamina | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemanha | ||
| Lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purificado Rato Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, EUA | 553141 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, com L-glutamina e bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha | 14060-09 | |
| Azida de sódio (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | Tesoura de mola S2002 | |
| Fine | Science Tools, Heidelberg, Alemanha | 15018-10 | |
| Pinça de tecido | Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha | 11021-12 | |
| Tubos | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 30125150 | |
| Cateter venoso, calibre 22 | B.Braun, Melsungen, Alemanha | 4268091B | |
| Xilazina cloridrato | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemanha |
Referências
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Reimpressões e permissões
