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Artigo de método

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

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DOI:

10.3791/60002

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22 de julho de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

Neste artigo

Resumo

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Resumo

As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.

Introdução

O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões1, 2. º , 3. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização4. Os métodos de compensação óptica superam esses problemas equilibrando o índice de refração ao longo de uma amostra para tornar o tecido translúcido para imagens 3-D5,6,7.

Vários métodos de compensação óptica foram desenvolvidos, que se enquadram em duas categorias principais: métodos à base de solvente e aquosa. Métodos de base aquosa podem ser divididos emimersão simples8,9, hiperhidratação10,11e hidrogel incorporando12,13. Os métodos à base de solvente desidratam o tecido, removem os lipídios e normalizam o índice de refração para um valor em torno de 1,55. As limitações da maioria dos métodos baseados em solventes são a têmpera de fluorescência endógena de proteínas de repórter comumente usadas, como GFP, toxicidade por solventes, capacidade de dissolver colas usadas em algumas câmaras de imagem ou lentes objetivas, e encolhimento de tecido durante desidratação14,15,16,17,18,19,20,21. Entretanto, os métodos solvente-baseados são simples, tempo-eficientes, e podem trabalhar em um número de tipos diferentes do tecido.

Os métodos de base aquosa dependem da imersão do tecido em soluções aquosas que possuem índices de refração na faixa de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Estes métodos foram desenvolvidos para preservar a emissão de proteínas de repórter fluorescente endógena e prevenir o encolhimento induzido por desidratação, mas as limitações da maioria dos métodos de compensação à base de aquosa incluem uma duração mais longa do protocolo, expansão tecidual e modificação protéica (ou seja, desnaturação parcial de proteínas por ureia em protocolos hiperhidratantes como SCALea2)7,11,23,25. SCALeS abordou a expansão tecidual através da combinação de ureia com sorbitol, que contrapesos por desidratação a expansão tecidual induzida por ureia, e preservou a ultraestrutura tecidual avaliada pela microscopia eletrônica10. O encolhimento ou a expansão tecidual afetam os tamanhos absolutos das estruturas, as distâncias entre objetos ou a densidade celular por volume; assim, a mensuração das alterações de tamanho na compensação do tecido pode ajudar a interpretar os resultados obtidos7,26.

Em geral, um protocolo para compensação óptica consiste em várias etapas, incluindo pré-tratamento, permeabilização, imunolabeling (se necessário), correspondência de índice de refração e imagem com microscopia de luz avançada (por exemplo, dois fótons, confocal ou microscopia de fluorescência da luz-folha). A maioria das abordagens de compensação foram desenvolvidas para visualizar o tecido neuronal, e estudos emergentes validou sua aplicação em outros órgãos5. Esta ferramenta abrangente tem sido demonstrada anteriormente para permitir a análise confiável e eficiente de estruturas renais, incluindo glomérulos27,28, imune infiltrados28, vasculatura28, e segmentos túbulo 29, e é uma aproximação ideal para melhorar a compreensão da remodelação da função glomerular e do túbulo na saúde e na doença.

Resumido aqui é um método baseado em solvente que combina imunocoloração de túbulos renais; clareira óptica com produtos químicos de etilo (ECi), não tóxico e pronto a utilizar; e a imagem latente da microscopia confocal que permite a visualização e a quantificação completas do túbulo. Este método é simples, combina o antígeno-recuperação de fatias do rim com mancha de anticorpos comerciais, e não exige o equipamento especializado, que o faz acessível à maioria de laboratórios.

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Protocolo

Nota: Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, EUA, e autoridades locais relevantes em Aachen, Alemanha.

1. perfusão aórtica abdominal retrógrada e fixação de rins de rato

  1. Prepare soluções no mesmo dia ou noite antes e armazene em uma geladeira durante a noite. Aqueça as soluções à temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  2. Fazer um novo lote de 3% paraformaldeído (PFA) em 1x fosfato-tampão salina (PBS). Cerca de 50-100 mL de PFA é necessário por mouse.
    1. Para fazer 1 L de 3% de PFA: pesar 30 g de PFA e adicionar 800 mL de água destilada na capa de fumos. Mexa e aqueça a 50-60 ° c. Não aqueça acima de 70 ° c.
      Cuidado: o PFA é tóxico. Prepare o PFA na capa de fumos.
    2. Adicione lentamente várias gotas de NaOH 2N. Aguarde alguns minutos até PFA entra na solução ou adicionar mais algumas gotas. Alguns pedaços pequenos não se dissolverão.
    3. Retire a solução do calor. Adicionar 50 mL de PBS 20x. Chill no gelo para RT.
    4. Ajuste o pH a 7.3-7.4 com HCl. adicionar água destilada a 1 L.
    5. Remova todas as partículas não dissolvidas filtrando 1X PBS e 3% PFA com filtro de 0,22 μm.
  3. Adicionar 1.000 unidades de heparina a 1 L de 1X PBS. Transferência 1X PBS contendo heparina e 3% PFA em 1X PBS em separado 50 mL seringas de plástico.
    Nota: Se disponível, a bomba pressão-controlada ajustou-se em 80-100 mmHg ou a pressão hidrostática (método do gotejamento, a altura das soluções da perfusão: 160-200 cm acima do animal) pode ser usado para a perfusão do rim.
  4. Conecte o PBS, PFA e uma agulha de borboleta de 21 G Blunted a uma torneira de três vias. Certifique-se de que não há bolhas de ar em todo o sistema.
  5. Rotule um tubo cônico de 15 mL e dispense 10 mL de PFA nele.
  6. Profundamente anestesiam um macho ou fêmea C57BL/6 mouse 12-24 semanas de idade usando 120 mg/kg de peso corporal cetamina e 16 mg/kg de peso corporal xilazina. O animal deve ser verificado para a ausência completa de responsividade por beliscar os reflexos antes de prosseguir para a cirurgia (por exemplo, reflexo de pinça do dedo do pé).
  7. Uma vez que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo em suas costas o microscópio de dissecação. Abra cirùrgica o abdômen com uma incisão abdominal do midline usando uma tesoura de funcionamento e exponha a aorta abdominal.
  8. Aperte a aorta abdominal direita acima da ramificação para a artéria ilíaca com um hemostato curvo. Em seguida, aperte a aorta abdominal logo abaixo das artérias renais com um micro serrefine. Faça uma pequena incisão (1 mm) na aorta abdominal entre as duas braçadeiras com tesouras de Vannas. Insira a agulha borboleta na incisão lentamente e tenha cuidado para não rasgar a aorta abdominal aberta.
  9. Ligate a artéria renal direita com uma sutura de seda 5-0 e remova o rim direito para a outra análise se somente um rim é necessário para a perfusão e a fixação.
  10. Retire o micro serrefine, transecto a veia portal com as tesouras dos Vannas, e perfuse imediatamente com 50 mL de PBS que contem a heparina, a seguir interruptor e perfuse com 50 mL de PFA de 3%.
    Nota: A pressão elevada da perfusão através da aorta abdominal é exigida para abrir túbulos renais para a melhor difusão do anticorpo através do tecido. A perfusão através do coração não pode abrir túbulos renais.
  11. Colete o rim perfundidos com cuidado e evite perfurar ou espremer o tecido.
  12. Retire a cápsula e corte o rim em fatias coronais de 1 mm de espessura. Use uma matriz de segmentaçãode dados (tabela de materiais) para padronizar a espessura da fatia.
    Nota: Alternativamente, considere usar um vibratome.
  13. Mergulhe as fatias renais com a PFA preparada no tubo cônico de 15 mL rotulado.
  14. Dispense 10 mL de PFA para outro tubo cônico de 15 mL rotulado. Lave o torneira de três vias e a agulha de borboleta com PBS antes de passar para o próximo mouse.
  15. Realize a pós-fixação durante a noite em RT protegida da luz.

2. preparação do tecido e imunocoloração

  1. Após a pós-fixação, lave a fatia de rim duas vezes com 1x tampãode lavagem (tabela de materiais) para 1 h em um rocker horizontal em RT.
  2. Realize a recuperação do antígeno. Aqueça acima 300 mL da solução de desmascaramento do antígeno 1x (Tcapaz dos materiais) em um copo de 500 mL a 92-98 ° c. Coloque a fatia na gaveta de incorporação permeável ao amortecedor aquecido com agitação para 1 h em 92-98 ° c. Retire o copo do fogo e deixe esfriar a RT.
    Nota: Alguns vendedores testam seus anticorpos para a aplicação immunohistochemistry e incluirão um método sugerido da recuperação do antígeno na folha de dados. Portanto, alguns resumos podem exigir um buffer mais básico (por exemplo, pH 9).
  3. Transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e rock durante a noite no RT. Lave as fatias 2x com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco para 1 h no dia seguinte.
  4. Diluir o anticorpo primário em 500 μL de diluente de anticorpo normal (tabela de materiais). Comece com uma concentração de 1:50-1:100. Balanç delicadamente a fatia do rim no anticorpo preliminar diluído para 4 d em 37 ° c.
    Nota: Desde que cada anticorpo tem propriedades originais, a temperatura durante a incubação do anticorpo e as diluições do anticorpo precisam de ser aperfeiçoadas para pontas de prova individuais. Para controles secundários do anticorpo-somente, incubar o tecido do rim no diluente sem anticorpo preliminar. Em vez de diluente de anticorpo comercial, 1X PBS com 0,1% Triton X-100 e 0, 1% de azida sódica pode ser usado.
  5. Lave a fatia de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.
  6. Diluir os anticorpos secundários (por exemplo, 1:100 para os anticorpos secundários de Alexa fluor) em 500 μL de diluente de anticorpo normal. Incubar as fatias renais em anticorpo secundário diluído durante 4 dias a 37 ° c. A partir deste passo em diante, proteja as fatias de rim da luz.
  7. Lave as fatias de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.

3. esclarecimento do tecido

  1. Transfira a fatia de rim para 5 mL de etanol de alto grau 100% (tabela de materiais) para 2 h em RT com balanço suave (com uma mudança para o etanol fresco após 1 h). Esta etapa é para a desidratação do tecido.
    Nota: O etanol de alto grau é necessário para alcançar uma alta translucidez tecidual na próxima etapa. O metanol ou o tetrahidrofurano são reagentes alternativos da desidratação com potencial elevado do delipidation.
  2. Mergulhe a fatia de rim em 2 mL de ECi (tabela de materiais) com balanço suave em RT (com uma mudança para ECI fresca após 2 h) durante a noite.
    Nota: O ponto de congelação/fusão de ECi é de 6-8 ° c. Portanto, não armazene amostras na geladeira. Conduza a imersão em um exaustor corretamente ventilado e evite o contato direto com a roupa e a pele (o ECi é um composto não-tóxico do alimento e da administração de droga-aprovado mas tem um odor forte). Use tubos Eppendorf regulares ou vasos de vidro (sem vasos de poliestireno).
  3. O translucidez do tecido pode ser conseguido após a imersão do ECI e quando as fatias do rim estão prontas para a imagem latente.

4. ConfocalImaging e análise de imagem

Nota: Para a imagem latente, outras técnicas da microscopia podem ser usadas contanto que a solução de harmonização do índice refração for compatível com a lente objetiva. Este protocolo usa um microscópio confocal invertido.

  1. Adicionar 600-1000 μL de ECi no prato inferior de vidro (tabela de materiais).
    Nota: Evite o uso de pratos de cultura de células regulares, porque ECi é um solvente orgânico que irá dissolver os pratos de plástico. Da mesma forma, ECi pode atacar peças plásticas/anéis de isolamento em lentes objetivas. Refira os relatórios apropriados para uma vista geral de pratos compatíveis da imagem latente30 e câmaras 3-D impressas auto-feitas28.
  2. Transfira a fatia translúcida do rim no prato. Coloque uma lamínula redonda na fatia do rim para aplicar a pressão de luz em direção ao fundo de vidro. Selar o prato com película de parafina (tabela de materiais) para evitar fugas de IPI.
    Nota: Órgãos inteiros ou várias fatias de tecido de espessura milímetro podem requerer uma borda (cimento dentário ou elastômero de silicone; ver tabela de materiais) ao redor do tecido para fazer um pool de IPI para a amostra.
  3. Coloc o prato na plataforma da imagem latente do microscópio.
  4. Pegue vários z-Stacks e realizar costura. Comece com um tamanho z-Step de 5 μm.
    Nota: Considere usar a distância de trabalho longa (> 5 milímetros) e os objetivos numéricos elevados da abertura (> 0.9) para a imagem latente de fatias ou de órgãos muito grossos do tecido. Após a imagem, transfira o tecido de volta para o etanol e armazene em tampão de lavagem ou PBS com 0, 2% de azida sódica.
  5. Analise a imagem usando renderização 3-D com software (tabela de materiais).

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Resultados

Os rins são órgãos complexos compostos por 43 diferentes tipos de células31. A maioria dessas células formam grandes estruturas multicelulares, como glomérulos e túbulos, e sua função é altamente dependente de interações entre si. As técnicas histológicas clássicas de 2-D capturam parcialmente estas grandes estruturas e podem faltar mudanças focais dentro das estruturas intactas31. Assim, a análise 3-D usando técnicas de compensação óptica ajuda a entender como elas funcion...

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Discussão

Técnicas de compensação óptica receberam ampla atenção para visualização 3-D e quantificação de microanatomia em vários órgãos. Aqui, o método solvente-baseado do esclarecimento (ECI) foi combinado com o Immunolabeling para a imagem latente 3-D de túbulos inteiros em fatias do rim. Este método é simples, barato e rápido. No entanto, outras questões de pesquisa podem ser melhor respondidas com outros protocolos de compensação5. Também é importante ter em mente que os métodos baseados em solvente ca...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O T. S. é apoiado por concessões da Fundação de pesquisa alemão de DFG (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), e a faculdade médica do RWTH AIX-lo-Chapelle (programa do Returner de RWTH). V. G. P. é apoiado por bolsas de pesquisa da Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, da Fundação Alexander von Humboldt, e do Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica da Austrália. D. H. E é apoiado por Fondation LeDucq. R. K. é apoiado por subvenções do DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), o estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e o Centro Interdisciplinar de pesquisa clínica na Universidade RWTH Aachen (O3-11).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m filtroFisher Scientific09-761-112
Tubo cônico de 15 mLFisher Scientific339650
Agulha borboleta de 21 GBraunVenofix
Torneira de 3 viasFisher ScientificK420163-4503
Software de análise 3DBitplane AGIMARIS
Software de análise 3DCellprofilersoftware livre de código aberto
5-0 sutura de sedaFine Science Tools18020-50
Seringas de plástico de 50 mLFisher Scientific14-817-57
Anticorpo monoclonal Anti-BrdURoche11296736001
Diluente de anticorposDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Solução de recuperação de antígeno à base de citratoVector LaboratoriesH-3300
Hemostático curvoFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Microscópio de dissecaçãoMoticDSK-500
de incorporaçãoCarl RothE478.1
EtanolMerck
Cinamato de etilaSigma-Aldrich112372
Filme flexível / Parafilm MSigma-AldrichP7793
Cabra anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Cobaia anti-NKCC2N / AN / ADOI: 10.1681 / ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
HeparinaSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Horizontal rockerLabnetS2035-E
Placa de imagemIbidi81218
CetaminaMWI Saúde Animal501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Tesoura de operaçãoMerit97-272
ParaformaldeídoThermo Fischer ScientificO4042-500
Coelho anti-foshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Elastômero de siliconeWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
Azida desódioSigma-AldrichS2002
Cortador de tecidosZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Tesoura VannasFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)
100983

Referências

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