Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Turgay Saritas; Victor  G. Puelles; Xiao-Tong Su; David  H. Ellison; Rafael Kramann

doi:10.3791/60002

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Artigo de método

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

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DOI:

10.3791/60002

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22 de julho de 2019

Turgay Saritas¹ , Victor G. Puelles¹^,²^,³ , Xiao-Tong Su⁴ , David H. Ellison⁴^,⁵^,⁶ , Rafael Kramann¹^,⁷

¹Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, ²III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, ³Department of Nephrology, Monash Health, ⁴Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, ⁵Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, ⁶Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, ⁷Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

Neste artigo

Resumo

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Resumo

As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.

Introdução

O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões¹^, ^{2. º} ^, ³. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização