Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Resumo

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Resumo

Os sistemas funcionais de vigilância da raiva são cruciais para fornecer dados confiáveis e aumentar o compromisso político necessário para o controle de doenças. Até o momento, animais suspeitos de raiva positivo devem ser submetidos a uma confirmação pós-morte usando métodos de laboratório clássicos ou moleculares. No entanto, a maioria das áreas endêmicas está em países de baixa e média renda, onde o diagnóstico de raiva animal é restrito a laboratórios veterinários centrais. A baixa disponibilidade de infraestrutura de vigilância leva a subnotificações de doenças graves de áreas remotas. Vários protocolos diagnósticos que exigem baixa experiência técnica foram desenvolvidos recentemente, proporcionando oportunidade de estabelecer o diagnóstico de raiva em laboratórios descentralizados. Apresentamos aqui um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte de campo da raiva animal usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Completamos o protocolo descrevendo um novo uso do dispositivo para análise molecular e genotipagem viral. RIDT detecta facilmente vírus da raiva e outros lyssavírus em amostras cerebrais. O princípio desses testes é simples: o material cerebral é aplicado em uma tira de teste onde anticorpos conjugados de ouro se ligam especificamente aos antígenos da raiva. Os complexos de anticorpos de antígeno se ligam ainda mais a anticorpos fixos na linha de teste, resultando em uma linha roxa claramente visível. O vírus é inativado na tira de teste, mas o RNA viral pode ser posteriormente extraído. Isso permite que a tira de teste, em vez da amostra cerebral infecciosa, seja enviada com segurança e facilidade para um laboratório equipado para confirmação e digitação molecular. Com base em uma modificação do protocolo do fabricante, encontramos maior sensibilidade ao teste, atingindo 98% em comparação com o método de referência padrão ouro, o teste de anticorpos de imunofluorescência direta. As vantagens do teste são inúmeras: rápida, fácil de usar, baixo custo e sem necessidade de infraestrutura laboratorial, como microscopia ou conformidade em cadeia fria. Os RIDTs representam uma alternativa útil para áreas onde os métodos de diagnóstico de referência não estão disponíveis.

Introdução

A raiva canina é a principal causa da raiva humana, responsável globalmente por aproximadamente 59.000 mortes humanas por ano, quase todas ocorrendo em países de baixa e média renda (LMICs) na Ásia e África¹. O principal agente etiológico é um vírus da raiva clássica associado ao canino neurotrópico (RABV, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus, espécie lyssavirus antirraiva). No entanto, outros lyssavírus relacionados à raiva, em sua maioria circulando em espécies de morcegos, também causam a doença^2,3. Nas regiões afetadas, a vigilância e o controle de doenças são frequentemente dificultados pelo baixo compromisso político, provavelmente devido à falta de dados confiáveis^4,,5,6. Uma das razões para a subnotificação da doença é a ausência de diagnóstico laboratorial, devido, em parte, ao acesso limitado a laboratórios equipados e equipe treinada, bem como as dificuldades de envio dos espécimes. O diagnóstico laboratorial é necessário para confirmar os casos de raiva e, além disso, permite a caracterização genética das cepas envolvidas, fornecendo insights sobre a transmissão do vírus no nível regional^4,,5,7.

Os padrões atuais de ouro para o diagnóstico de raiva pós-morte, aprovados tanto pela Organização Mundial da Saúde (OMS) quanto pela Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE), são o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFAT), o teste de imunohistoquímica rápida direta (DRIT) e métodos moleculares (por exemplo, reação em cadeia de transcriptação reversa (RT-PCR))^4,8. No entanto, a aplicação adequada em LMICs permanece limitada devido a instalações laboratoriais inadequadas com fornecimento de energia inconsistente, transporte amostral não legal e falta de um sistema de gestão da qualidade. Como o diagnóstico de raiva animal é normalmente realizado apenas em laboratórios veterinários centrais em LMICs, os dados de vigilância existentes refletem principalmente a situação da raiva em áreas urbanas.

Alternativas diagnósticas de baixa tecnologia recentemente desenvolvidas oferecem oportunidades para estabelecer o diagnóstico da raiva em áreas remotas e laboratórios de raiva descentralizados^4,,8,9. O teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT) é um teste de fluxo lateral baseado na imunocromatografia utilizando anticorpos detectores conjugados de ouro e é uma ferramenta de diagnóstico antirrábica muito promissora^{10,,11,,12,13}. O princípio é simples: após a diluição, o material cerebral é misturado no tampão fornecido, e algumas gotas são aplicadas na tira de teste onde anticorpos monoclonais conjugados de ouro se ligam especificamente aos antígenos da raiva, principalmente as nucleoproteínas(Figura 1). Os complexos de anticorpos de antígeno passam então por migração lateral de fluxo, vinculando-se na linha de teste (linha T) a anticorpos fixos contra antígenos da raiva, resultando em uma linha roxa claramente visível. Os anticorpos conjugados de ouro restantes não ligados aos antígenos da raiva continuam migrando e se fixando na membrana através de anticorpos de alvo adicionais, resultando em uma linha de controle roxo claramente visível (linha C).

O método de um passo e baixo custo é rápido, extremamente fácil e não requer equipamentos caros ou condições especiais de armazenamento. Com a modificação do protocolo do fabricante para eliminar a etapa de diluição, quase todos os equipamentos e reagentes necessários para realizar o teste estão incluídos no kit¹⁴. O resultado é lido após 5-10 minutos sem um microscópio. Esta é uma grande vantagem sobre o teste DFAT, que requer um microscópio de fluorescência e conjugado de imunofluorescência, juntamente com transporte refrigerado e armazenamento de amostras. Mesmo o teste DRIT, que pode ser realizado usando um microscópio leve, requer uma cadeia de frio contínua para armazenar os anticorpos antirraiva, que também ainda não estão disponíveis comercialmente. Em comparação com o DRIT, o RIDT não requer produtos químicos tóxicos, uma vantagem particular em países onde o descarte de resíduos é mal regulado. O teste rápido é menos demorado com interpretação muito mais fácil em comparação com os testes padrão-ouro DFAT e DRIT. Isso permite testes no local por pessoal com conhecimento técnico limitado.

Com base nessas propriedades de teste, torna-se viável o diagnóstico imediato de animais suspeitos em áreas remotas, facilitando a implementação de profilaxia pós-exposição (PEP) para pessoas expostas o mais rápido possível. Além disso, o transporte à distância de amostras de raiva não é necessário, resultando em melhor qualidade amostral no momento do teste. No entanto, os resultados obtidos com os testes RIDT devem ser confirmados atualmente por meio de um teste de diagnóstico de referência, como DFAT ou DRIT.

Foram avaliadas técnicas de RIDT para detecção de RABV e outros lyssavírus. Um dos primeiros estudos foi conduzido por pesquisadores coreanos em 2007¹⁰. Em comparação com o método DFAT, em 51 amostras de animais e 4 isolados de RABV, o RIDT apresentou sensibilidade e especificidade de 91,7% e 100%, respectivamente. Esses resultados foram posteriormente confirmados com 110 amostras cerebrais animais da Coreia, com sensibilidade e especificidade, em comparação com a DFAT, de 95% e 98,9%,^{respectivamente 15}. Mais recentemente, outros estudos avaliaram o desempenho deste RIDT usando isolados de vírus e/ou amostras cerebrais infectadas de vários animais com diferentes origens geográficas. Um painel de 21 amostras, incluindo rabv africano e outros lyssavírus africanos (vírus Duvenhage (DUVV), vírus morcego de Lagos (LBV) e vírus Mokola (MOKV)), foram detectados com sucesso, com sensibilidade de 100% em comparação com o DFAT¹⁶. Sensibilidade alta similar (96,5%) e especificidade (100%) os valores foram obtidos a partir de um painel de 115 amostras cerebrais da Etiópia¹⁷. Outro estudo avaliou isolados europeus de RABV, dois outros lyssavírus europeus (europeus bat lyssavirus tipo 1 (EBLV-1) e tipo 2 (EBLV-2)) e o lyssavírus de morcego australiano (ABLV)¹⁸. Com base na análise de 172 amostras cerebrais animais, o kit RIDT teve 88,3% de sensibilidade e 100% de especificidade em relação ao DFAT, e os três lyssavírus relacionados à raiva foram detectados com sucesso. Neste estudo, alguns dos resultados falsos negativos vieram de amostras cerebrais armazenadas no tampão de glicerol, sugerindo que a remoção inadequada do glicerol influenciou o fluxo capilar ou a ligação de anticorpos. Uma análise recente de 43 amostras clínicas de morcegos australianos confirmou resultados anteriores de testes, com total concordância com DFAT¹⁹. Dois estudos foram realizados na Índia utilizando o RIDT em um número limitado de amostras clínicas (11 e 34 amostras). Em relação ao DFAT, a sensibilidade ficou entre 85,7% e 91,7% e a especificidade foi de 100%^20,21. Outra avaliação deste kit utilizando 80 amostras cerebrais animais da África, Europa e Oriente Médio obteve total concordância com a DFAT para especificidade (100%) mas maior sensibilidade (96,9%) em comparação com os estudos anteriores²². Em recente comparação inter-laboratorial deste RIDT realizado em 22 laboratórios diferentes utilizando um painel de 10 amostras, a concordância global foi de 99,5%²³.

Apenas um estudo multicêntrico recente mostrou desempenho total de RIDT insatisfatório²⁴. Amostras de três diferentes conjuntos de dados foram testadas e forneceram sensibilidade variável e valores de especificidade em comparação com a DFAT. Por exemplo, sensibilidade e especificidade obtidas com o primeiro painel (n=51) e o segundo painel (n=31) de amostras de animais infectados experimentais, todas testadas em laboratório A, deram sensibilidade de 16% e 43%, respectivamente, enquanto a especificidade foi de 100% para ambos. Por outro lado, os resultados do terceiro painel (n=30) de amostras clínicas de campo analisadas pelo laboratório B proporcionaram uma concordância completa com os resultados da DFAT, que foi quase completamente confirmada pelo laboratório A (85% de sensibilidade e 100% de especificidade). A variação em lote a lote foi sugerida como uma possível explicação para a sensibilidade relativamente baixa flutuante com ridt²⁴.

Ao mesmo tempo, outro estudo realizou um processo de validação semelhante do ridt descrito acima, com uma modificação do protocolo recomendado pelo fabricante¹⁴. A etapa de pré-diluição (1:10) na PBS foi omitida durante a preparação do material cerebral. Com base neste protocolo modificado mais simples, os autores obtiveram sensibilidade e especificidade de 95,3% e 93,3%, respectivamente, em comparação com o DFAT por meio de testes, em condições laboratoriais, um conjunto de dados de 73 amostras cerebrais animais, infectadas de forma natural ou experimental com várias cepas de RABV. O estudo apresentou a primeira avaliação deste RIDT em um ambiente de campo (Chade, África). Em 48 amostras clínicas do cérebro, sensibilidade e especificidade foram de 94,4% e 100%, respectivamente. As discrepâncias entre DFAT e RIDT foram decorrentes de resultados falsos positivos com DFAT, determinados após confirmação com RT-PCR. Quando esses resultados foram excluídos, houve total concordância, e demonstrou que o RIDT era mais confiável que o DFAT nessas condições de campo¹⁴. Não foi observada variação em lote a lote utilizando-se o protocolo modificado. Quando o protocolo modificado foi aplicado a um pequeno número de amostras divergentes DFAT/RIDT (n=8) no estudo de Eggerbauer et al.²⁴, todos foram encontrados concordantes (100% de sensibilidade).

Outra grande vantagem do RIDT é o uso secundário para detectar RNA viral fixado na tira usando técnicas moleculares (como RT-PCR) e genotipagem subsequente^14,24. Após uma etapa de extração, Léchenne et al.¹⁴ demonstraram RNA viral fixado na membrana do dispositivo Anigen usando RT-PCR com sensibilidade de 86,3% em um painel de 51 amostras (incluindo 18 amostras testadas e enviadas do Chade à temperatura ambiente). A genotipagem subsequente foi possível em 93% das 14 amostras testadas. Foram utilizados sequenciamento sanger de amplicons PCR de pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Além dos isolados do RABV, o teste detectou outras quatro espécies de lyssavirus, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 e Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), durante um teste intersetório internacional totalmente concordante¹⁴. A sensibilidade da detecção viral de RNA foi ainda maior (100%) no estudo de Eggerbauer et al., com base no exame de amostras laboratoriais²⁴. Este último estudo também demonstrou que o buffer usado no kit RIDT inativado vírus. Assim, os dispositivos podem ser enviados facilmente, à temperatura ambiente sem precauções específicas de biossegurança para laboratórios de referência, para confirmação molecular e genotipagem.

Com base nas avaliações anteriores, as ferramentas RIDT oferecem inúmeras vantagens para uso em configurações de campo, especialmente quando as técnicas de diagnóstico de referência não estão disponíveis. No entanto, este teste também tem algumas limitações, em particular, baixa sensibilidade da detecção de antígeno^14,24. O teste é aplicável para amostras contendo altas quantidades de antígenos virais, como amostras cerebrais. No entanto, não é apropriado para outras amostras, como saliva ou outros fluidos corporais. Outra desvantagem é o custo do dispositivo (cerca de 5-10 Euros na Europa), que é menos caro em comparação com o custo de execução de DFAT, RT-PCR ou DRIT, mas que ainda permanece alto para LMICs. No entanto, o desenvolvimento futuro e a validação de RIDTs semelhantes de outras empresas podem levar a uma queda de preços. Um estudo relatou variações em lote. Embora não relatados por outros, controles rigorosos de qualidade devem, no entanto, ser realizados ao testar um novo lote, como para qualquer reagente utilizado em um ambiente de gestão da qualidade. O uso do protocolo modificado não foi alterado ao utilizar diferentes lotes¹⁴. Todos, exceto um estudo, demonstraram que a sensibilidade do RDIT foi elevada em relação ao DFAT (em torno de 90%-95%). Como a raiva é sempre fatal, ainda é fortemente recomendado confirmar quaisquer resultados negativos com RDIT usando um teste de diagnóstico de referência como DFAT, DRIT ou RT-PCR¹⁴.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte de campo da raiva animal com base em um exemplo de RIDT comercializado, desde a coleta de amostras cerebrais até a aplicação de um protocolo modificado em comparação com as recomendações do fabricante (que foram previamente validadas¹⁴) e análise molecular subsequente. Este protocolo foi aplicado e validado muitas vezes sob condições de campo na África Ocidental e Central, onde o RIDT era usado rotineiramente para o diagnóstico de raiva ao lado do teste DFAT. Além disso, demonstramos uma segunda aplicação para o dispositivo, em configurações laboratoriais, para extração e detecção usando RT-PCR de RNA viral fixado no dispositivo.

Protocolo

1. Coleta de amostras através do foramen magnum (rota occipital)²⁵

NOTA: Esta técnica pode ser implementada em condições laboratoriais ou em ambientes de campo. As amostras devem ser processadas o mais rápido possível após a morte do animal suspeito ou mantidas em temperatura fria (refrigerada ou congelada, se possível) para evitar a decomposição que possa afetar os resultados. Semelhante a outras técnicas de referência baseadas na detecção de antígenos lyssavírus, como DFAT e DRIT, amostras decompostas não devem ser testadas porque podem afetar o resultado (risco de resultado falso negativo).

ATENÇÃO: Todas as amostras devem ser consideradas potencialmente infecciosas. As normas e procedimentos de segurança devem ser rigorosamente seguidos, mesmo nos ajustes de campo⁴. Em particular, use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo máscara, óculos, luvas e um jaleco. Use desinfetante adequado para descontaminaçãos materiais e amostrais (por exemplo, hipoclorito de sódio com diluições recomendadas do fabricante, 70% de álcool - etanol ou isopropanol, solução de sabão de 1%). Todas as amostras de manuseio de pessoal devem ser vacinadas contra raiva.

1. Remova a cabeça do animal com uma faca antes da primeira vértebra cervical (vértebra atlas) para acessar o foramen magnum.
   NOTA: Para minimizar o aerossol infeccioso, evite usar uma serra manual ou uma ferramenta semelhante.
2. Coletar amostra de brainstem (medulla oblongata) utilizando uma pipeta de plástico descartável(Figura 2A),um canudo de beber(Figura 2B),um grampo(Figura 2C) ou um conta-gotas (fornecido com o RIDT)(Figura 2D).
   NOTA: Deve-se prestar atenção especial na coleta da amostra, pois é um passo muito importante para a confiabilidade dos resultados. Além do vídeo associado que mostra de forma simples como coletar a parte do tronco cerebral de interesse, uma etapa de treinamento é altamente recomendada para ter certeza de coletar a seção anatômica correta.
3. Opcionalmente e além do tronco cerebral (medulla oblongata), coletar outras partes do tronco cerebral ou do cérebro (cerebelo, hipocampo, tálamo e córtex) pela mesma rota occipital empurrando e girando a pipeta de plástico ou palha em direção à órbita ocular(Figura 3).
4. Se usar um canudo ou pipeta, esprema-a suavemente para depositar a amostra cerebral (0,5-2 g) em um tubo para análise subsequente e/ou biobanco.
   NOTA: O armazenamento de amostras em glicerol não é recomendado, pois parece afetar o fluxo capilar ou a etapa de ligação de anticorpos do RIDT¹⁸.

2. Execução do protocolo RIDT^{modificado 14}

NOTA: Esta modificação omite uma etapa de diluição (1:10) em PBS, conforme especificado no protocolo do fabricante (todas as versões), e pode ser implementada em configurações laboratoriais ou de campo.

1. Use o cotonete/conta-gotas para coletar o equivalente a meio amendoim ou ervilha (0,1-0,5 g) do material cerebral e coloque-o no tubo de amostra tampão.
   NOTA: Para o protocolo modificado, todos os reagentes/consumíveis estão incluídos no kit (não é necessário PBS ou tubo adicional)(Figura 4). Documente o número do lote do kit e verifique a validade da data de validade.
2. Esmague cuidadosamente o material cerebral diretamente no tubo com o cotonete ou o caixa de dados por cerca de 30 s até que uma suspensão homogênea seja obtida.
   NOTA: A reação do buffer inativa a infectividade do vírus nas condições do protocolo²⁴do fabricante .
3. Usando o conta-gotas, deposite quatro gotas (aproximadamente 100 μL) da suspensão na entrada da amostra no dispositivo de teste.
4. Aguarde a migração completa da amostra (1-5 min) antes de ler o dispositivo de teste. A migração deve começar rapidamente após o depósito da amostra (1-5 min).
5. Em caso de atraso (devido à suspensão de alta viscosidade) ou para acelerar o início da migração, arranhe suavemente a parte inferior do local de depósito do dispositivo com o conta-gotas (1-5 vezes) e eventualmente adicione mais 1-2 gotas. A migração deve começar imediatamente depois disso.
6. Leia o resultado do teste na janela de detecção após 5-10 min, e não mais do que 20 min, após o fim da migração.
7. Interprete o resultado com base na presença ou ausência da linha de controle (linha C) e da linha de teste (linha T) (linhas roxas) na janela de detecção, de acordo com a Figura 5. Considere a amostra positiva quando duas linhas estiverem visíveis(Figura 5A),negativas se apenas a linha C estiver presente(Figura 5B) e inválidas se apenas a linha T estiver presente ou se nenhuma linha estiver visível(Figura 5C).
   NOTA: Os resultados inválidos devem ser repetidos pelo menos uma vez. Outras técnicas devem ser realizadas se os resultados permanecerem inválidos. Os resultados negativos obtidos com ridt precisam ser confirmados posteriormente usando um método de referência padrão ouro, como DFAT, DRIT e métodos moleculares (reação em cadeia de polimerase ou PCR). Embora a sensibilidade deste teste seja alta (veja resultados representativos), não é 100%.
8. Armazene dispositivos usados à temperatura ambiente ou leve à geladeira/congele quando possível, para análise molecular subsequente (ver seção 4). Congele a suspensão restante da amostra a -20 °C/-80 °C no tubo tampão para repetir o teste, se necessário ou para análise molecular subsequente.

3. Extração e detecção de RNA por RT-qPCR do dispositivo RIDT

NOTA: Esta etapa só pode ser implementada em condições laboratoriais com ambiente adaptado e equipamentos adequados para diagnóstico molecular. Pode ser feito logo após o teste RIDT ou retrospectivamente em dispositivos RIDT arquivados, armazenados à temperatura ambiente (15-30 °C), refrigerados ou congelados.

1. Extração de RNA
   NOTA: Para monitorar a etapa de extração, recomenda-se usar um controle interno que pode ser um mRNA endógeno (como ß-actin) ou um controle exógeno (como o RNA sintético eGFP) cravado diretamente na amostra durante os primeiros passos da extração^26,,27.
   1. Abra cuidadosamente o dispositivo e remova o papel do filtro.
   2. Corte a área de depósito da amostra e coloque-a em um tubo contendo 1 mL de Tri-Reagente LS. Incubar em RT por 1 hora com suave agitação manual regular.
   3. Realizar a extração de acordo com as recomendações do fabricante, conforme descrito anteriormente²⁷. Nesta etapa, o controle interno exógeno pode ser adicionado.
   4. Durante o processo, adicione 2 μL de glicogênio para facilitar a precipitação do RNA, de acordo com as recomendações do fabricante.
   5. Ajuste o volume final para ressuspensão de RNA em água sem nuclease, com um volume de 50 μL geralmente utilizado.
      NOTA: Ao final da etapa de centrifugação para separação de fase aquosa e orgânica (após a adição de 200 μL de clorofórmio no Tri-Reagente LS), a peça de membrana do dispositivo estará na parte inferior do tubo e não interferirá na coleta da fase aquosa superior. Alternativamente, outros protocolos fáceis e rápidos podem ser usados, por exemplo, usando reagentes à base de fenol e membranas de sílica²⁸.
2. Detecção por RT-qPCR²⁶
   NOTA: A detecção de RNA viral potencial presente em amostras extraídas pode ser feita usando diferentes técnicas moleculares, como PCR de transcrição reversa, PCR convencional (ponto final) ou PCR em tempo real (qPCR). Vários métodos estão disponíveis, tais como RT-PCR^27,,29 ou RT-qPCR^26,,30 visando o gene nucleoproteína viral ou polimerase. Um exemplo será apresentado abaixo com base em um pan-lyssavirus RT-qPCR combinado duplo visando uma região conservada entre a polimerase viral. Esta técnica RT-qPCR associa dois RT-qPCR diferentes: um baseado na tecnologia de sonda TaqMan (pan-RABV RT-qPCR) e o outro usando a detecção SyBR Green (pan-lyssa RT-qPCR). Além disso, a detecção de um controle interno exógeno (eGFP RNA) diretamente cravado durante o processo de extração é feita por um RT-qPCR baseado em sonda TaqMan específico (eGFP RT-qPCR). A validação cuidadosa no local das técnicas moleculares selecionadas para detecção de RNA viral é importante, em particular, verificar se os primers e os testes para RT-PCR em tempo real são adaptados para detecção das cepas que circulam na região de interesse⁴.
   1. Diluir a amostra de RNA para 1:10 em água livre nuclease. Teste cada amostra de RNA em duplicata, usando uma placa de reação de 96 poços ou outros formatos. Use controles positivos e negativos para cada ensaio e teste pelo menos em duplicata.
   2. Prepare a solução de reação de mix mestre para os três ensaios rt-qPCR diferentes de acordo com a Tabela 1, e com os primers/sondas indicados na Tabela 2.
   3. Adicione 5 μL de amostras de RNA diluídas e 15 μL de mistura mestre a cada um dos três ensaios diferentes. O ensaio pan-RABV RT-qPCR e o ensaio eGFP RT-qPCR podem pedalar na mesma placa.
   4. Execute os diferentes ensaios seguindo as condições de ciclismo térmico indicadas na Tabela 3. Se apenas um ciclofairicamente PCR estiver disponível, comece com o pan-RABV RT-qPCR e mantenha a placa para a pan-lyssa RT-qPCR a 4 °C até o final do pan-RABV RT-qPCR.
   5. Analisar os resultados obtidos com os três ensaios de acordo com a Tabela 4.

4. Genotipagem após extração de RNA do dispositivo RIDT

1. Transcrição reversa RT^27,29
   1. Prepare uma mistura mestre com 6 μL de RNA, 2 μL de primers aleatórios pd(N)6 (200 μg/μL) e 2 μL de água sem nuclease para um volume final de 10 μL.
   2. Incubar a 65 °C por 10 minutos em um bloco de calor e depois armazenar no gelo.
   3. Prepare uma mistura mestre com 6 μL de 5x First-Strand Buffer, 2 μL de 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) de transcriptase reversa Superscript II, 2 μL (80 U) de RNasin, 2 μL de mix dNTP (10 μM) e completa com água sem nuclease para obter um volume final de 20 μL para cada amostra.
   4. Adicione a mistura mestre (20 μL) à amostra (10 μL) (volume final de 30 μL) e incubar a 42 °C por 90 min em um bloco de calor.
   5. Prossiga para a próxima etapa com amplificação PCR ou armazene o cDNA a -20 °C.
2. PCR convencional^27,,29,31
   NOTA: Diferentes técnicas de PCR convencional estão disponíveis para genotipagem. Dois são apresentados, ambos hemi-aninhados PCR, visando uma parte da nucleoproteína ou uma parte da proteína viral do lyssavirus. O protocolo é o mesmo para cada um desses ensaios, exceto para os primers e condições de ciclismo. Controles positivos (RNA positivos) e negativos (cDNA negativo e/ou água sem nuclease) devem ser incluídos em cada série e em cada rodada de PCR.
   1. Prepare-se para cada amostra em um microtubo de 0,2 mL uma solução de reação de mix mestre para a primeira etapa pcr. Esta mistura contém 5 μL de 10x NH4 Reaction Buffer, 2,5 μL de solução MgCl₂ (50 mM), 1 μL de dNTP Mix (10 μM), 1 μL de cada primer (10 μM), 0,2 μL (1 U) de polimerase de DNA biotaq e 37,3 μL de água sem nuclease (volume final de 48 L). Os primers estão indicados na Tabela 5.
   2. Adicione 2 μL de cDNA em cada tubo e ciclo em um ciclo térmico PCR convencional separado para cada ensaio, de acordo com a Tabela 6.
   3. Prepare uma segunda solução de reação de mix mestre idêntica à anterior com o uso dos primers apropriados(Tabela 5) para a reação pcr de hemi-aninhada.
   4. Adicione 2 μL do produto PCR da primeira rodada e ciclo em um ciclo térmico PCR convencional usando os parâmetros de ciclismo indicados na Tabela 6.
   5. Visualize os diferentes produtos PCR (PCR primeira e segunda rodada) depois de carregá-los em um gel de 1% de agarose (100 mL de tampão EDTA tris-acetato 1x - TAE 1x) com brometo de etídio (concentração final em torno de 0,01%) e executar o gel durante 30 min a 120 V. Um resultado positivo de PCR é observado na forma de uma faixa brilhante do tamanho esperado(Tabela 5).
3. Sequenciamento de sanger
   1. Realize um sequenciamento Sanger dos amplicons obtidos com o PCR de hemi-aninhado pan-lyssavirus e complete a análise de genotipagem.

Resultados

Como em qualquer método de diagnóstico, a coleta de amostras é de suma importância para a confiabilidade dos resultados, especialmente quando realizada em ambientes de campo. O processo de coleta precisa ser o mais simples possível para garantir a coleta de amostras de alta qualidade. A coleta de uma biópsia cerebral (tronco cerebral com medulla oblongata) através da rota foramen magnum para diagnóstico pós-morte da raiva animal cumpre esse requisito, conforme indicado na Figura 2A-D²⁵.

Após a coleta, a amostra cerebral é submetida ao protocolo modificado do RIDT, resumido na Figura 6. Conforme indicado na seção Protocolo, a maior adaptação do fabricante desde que o protocolo seja a omissão da etapa de diluição na PBS, que simplifica o procedimento e os materiais/reagentes necessários, todos incluídos no kit (Figura 4).

Este protocolo modificado foi implementado e avaliado em cinco laboratórios diferentes, incluindo um centro colaborativo da OMS sobre raiva (Lab 1, França), um centro de referência da FAO para raiva (Lab 5, Itália) e três laboratórios de referência localizados em países africanos enzoóticos, Chad (Lab 2), Costa do Marfim (Lab 3) e Mali (Lab 4). No Chade, foi feita uma avaliação do RIDT tanto em ambientes de laboratório quanto de campo.

Em comparação com a técnica de referência DFAT, a sensibilidade e a especificidade do RDIT foram elevadas para todos os laboratórios, com 96% a 100% e 93,7% a 100%, respectivamente (Tabela 7). A menor sensibilidade e especificidade do RDIT foi obtida para o Laboratório 1 (França) durante a etapa de validação laboratorial. Com base no número acumulado de amostras testadas (n=162) (Tabela Suplementar 1),a sensibilidade e especificidade globais em relação à DFAT foram de 98,2% e 95,8%, respectivamente(Tabela 7). No entanto, esses resultados preliminares, mas promissores, foram obtidos em um conjunto de dados de amostra limitada e precisam ser confirmados em um grande número de amostras positivas e negativas, especialmente para aquelas testadas em áreas enzoóticas, para evitar qualquer potencial subestimação ou viés devido aos conjuntos de dados heterogêneos atuais.

O teste RIDT é adequado para detectar lyssavírus em biópsias cerebrais de animais infectados, onde o nível de antígenos lyssavírus é importante. No entanto, o limite de teste de detecção permanece alto ao testar a suspensão do vírus titulado(Tabela 8; Figura 7).

A Tabela 9 (de Léchenne 2016¹⁴) mostra um exemplo de resultados obtidos após a detecção do RNA pelo duplo pan-lyssavirus RT-qPCR, visando a polimerase viral do lyssavirus. Um painel de 51 testes ridt positivos realizados em condições laboratoriais (Laboratório 1, n=32) ou no Chade (Lab 2, n=19) e depois enviados à temperatura ambiente para o Laboratório 1, foi testado. A detecção positiva foi obtida para 18 (94,7%), 26 (81,2%) e 44 (86,3%) amostras do Laboratório 1, Laboratório 2 e os dois combinados, respectivamente. Além disso, foi realizado genotipagem para 14 dessas amostras (10 do Laboratório 1 e 4 do Laboratório 2) utilizando o PCR hemi-aninhado visando o gene de nucleoproteína parcial e foi bem sucedido para 13 delas (93%) (de Léchenne et al. 2016¹⁴).

Figura 1: Representação esquemática da estrutura de um RIDT para diagnóstico de raiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de técnicas rápidas e simples para coleta de amostras cerebrais (tronco cerebral com medulla oblongata) em animais (cão mostrado aqui) através do foramen occipital em ambientes de campo (Mali). (A) Coleção com uma pipeta de plástico descartável (B) Coleção com um canudo de plástico(C) Coleção com um grampo (D) Coleção com o conta-gotas de descarte fornecido no kit RIDT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Seção anatômica longitudinal da cabeça do cão, mostrando as diferentes partes do cérebro (tronco cerebral, cerebelo, hipocampo, tálamo e córtex) coletadas ao empurrar, em um movimento rotacional, uma pipeta de plástico descartável através da rota de foramen occipital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Descrição do conteúdo do kit RIDT, incluindo o dispositivo, um conta-gotas de plástico descartável, um cotonete descartável e o diluente de ensaio. O tubo onde a amostra será coletada e armazenada não é fornecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados representativos para interpretação do Anigen RIDT. (A) Resultados positivos (presença visível de duas linhas, linha C e linha T) (B) Resultados negativos (presença visível apenas da linha C) (C) Resultados inválidos (ausência de linha C visível). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Representação esquemática do protocolo RIDT, adaptado das instruções do fabricante. (A) Versão modificada do protocolo, com exclusão da etapa de diluição recomendada pelo fabricante (B) Protocolo inicial recomendado pelo fabricante, com etapa de diluição pré 1:10 em PBS das amostras cerebrais. As etapas excluídas na versão modificada do protocolo (apresentada na Figura 6A) são indicadas com uma linha vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exemplo de determinação do limite de detecção do RIDT¹⁴. Foi utilizada uma diluição em série 10:1 de um vírus da raiva titulada da cepa 9704ARG. A quantidade de vírus depositado em cada dispositivo é indicada em FFU (unidades fluorescentes de formação de foco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio Pan-RABV RT-qPCR
Reagente	μL/Reação
2X Reaction Mix (um buffer contendo 0,4 mM de cada dNTP e 6 mM MgSO4)	10
Água livre de nuclease	1.5
Taq3long (Para a frente) [10 μM]	1
Taq17revlong (Reverso) [10 μM]	1
RABV4 [10 μM]	0.3
RABV5 [10 μM]	0.3
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit)	0.25
Corante de referência ROX (25 μM) (fornecido no kit)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum	0.4
Total por reação	15
eGFP RT-qPCR ensaio
Reagente	μL/Reação
2X Reaction Mix (um buffer contendo 0,4 mM de cada dNTP e 6 mM MgSO4)	10
Água livre de nuclease	2.8
EGFP1F (Para a frente) [10 μM]	0.5
EGFP2R (Reverso) [10 μM]	0.5
sonda eGFP [10 μM]	0.3
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit)	0.25
Corante de referência ROX (25 μM) (fornecido no kit)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum	0.4
Total por reação	15
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR
Reagente	μL/Reação
2x Mistura de Reação Verde SYBR	10
Água livre de nuclease	2.1
Taq5long (Para a frente) [10 μM]	1
Taq16revlong (Reverso) [10 μM]	1
MgSO4 [50-mM] (fornecido no kit)	0.25
Corante de referência ROX (25 μM)	0.05
RNasin (40U/μL) (Promega)	0.2
Mix de Taq RT/Platinum SuperScript III/Platinum	0.4
Total por reação	15

Tabela 1: Descrição da solução de reação de mix mestre para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Ensaio RT-qPCR	Nome	Tipo	Comprimento	Sequência (5'-3')	Sentido	Posição
ensaio pan-RABV RT-qPCR	Taq3long	Primer	22	ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A	S	7273-7294a
	Taq17revlong	Primer	25	GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G	Como	7390-7414a
	RABV4	Sonda (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC	Como	7314-7342a
	RABV5	Sonda (FAM/TAMRA)	32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S	7353-7384a
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR	Taq5long	Primer	23	TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA	S	7272-7294a
	Taq16revlong	Primer	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	Como	7366-7390a
eGFP RT-qPCR ensaio	EGFP1F	Primer	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC	S	637-656b
	EGFP2R	Primer	19	GAA CTC CAG CAG GAC CAT G	Como	768-750b
	EGFP	Sonda (FAM/TAMRA)	22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S	703-724b

Tabela 2: Descrição dos primers/sondas para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR). ^um De acordo com a sequência de genomas RABV do vírus Pasteur (PV) (número de adesão do GenBank M13215). ^b De acordo com a sequência de vetor de clonagem pEGFP-1 (número de adesão do GenBank U55761).

Ensaios Pan-RABV RT-qPCR e eGFP RT-qPCR
Passo	Ciclo	Temp	Tempo	Coleta de Dados
Transcrição reversa	1	45 °C	15 min.
Inativação/desinaturação inicial de RT	1	95 °C	3 min.
Amplificação	40	95 °C	15 s
		61 °C	1 min	Ponto final
Ensaio Pan-lyssa RT-qPCR
Passo	Ciclo	Temp	Tempo	Coleta de Dados
Transcrição reversa	1	45 °C	15 min.
Inativação/desinaturação inicial de RT	1	95 °C	3 min.
Amplificação	40	95 °C	15 s
		55 °C	1 min	Ponto final
Curva de dissociação	1	95 °C	15 s	Aumento de 0,1 °C/s, 55-95 °C
		55 °C	1 min
		95 °C	15 s
		55 °C	15 s

Tabela 3: Descrição das condições de ciclismo térmico para os três diferentes ensaios RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Ensaio	Análise	Resultados	Interpretação
eGFP RT-qPCR	Cq no intervalo de aceitação	Extração validada	Análise de outros ensaios pode ser feita
	Cq fora do intervalo de aceitação	Extração não validada	Teste novamente a amostra (repita a execução ou/e a extração), solicite outra amostra, se necessário, se necessário
pan-RABV RT-qPCR	Cq <38	Positivo	Detecção positiva de RNA viral
	Cq ≥38	Negativo	Análise do ensaio pan-lyssa RT-qPCR
pan-lyssa RT-qPCR	Curva de fusão considerada positiva	Positivo	Detecção positiva de RNA viral
	Curva de fusão considerada negativa	Negativo	Ausência de detecção de RNA viral

Tabela 4: Interpretação geral do ensaio pan-lyssavirus RT-qPCR combinado duplo.

Ensaio PCR convencional de hemi-aninhado	Rodada pcr	Nome	Comprimento	Sequência (5'-3')	Sentido	Posicionea	Tamanho de amplicon (bp)
PCR aninhado de hemi visando o gene da polimerase	1ª rodada	PVO5m	20	ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA	S	7170-7189	320
		PVO9	19	TGA CCA TTC CAR CAR GTN G	Como	7471-7489
	2ª rodada	PVO5m	20	ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A	S	7170-7189	250
		PVO8	22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	Como	7398-7419
PCR aninhado de hemi visando o gene da nucleoproteína	1ª rodada	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	1532
		N8m	19	CAG TCT CYT CNG CCA TCT C	Como	1568-1586
	2ª rodada	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	845
		N829	19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	Como	881-899

Tabela 5: Descrição dos primers utilizados para o PCR convencional de hemi-aninhado.

	PCR aninhado de hemi visando o gene da polimerase
	Passo	Ciclo	Temperatura	Tempo
Primeira e segunda rodadas	Desnaturação inicial	1	94 °C	3 min.
	Desnaturação	35	94 °C	30 s
	Hibridização		56 °C	45 s
	Alongamento		72 °C	40 s
	Alongamento final	1	72 °C	3 min.
	PCR aninhado de hemi visando o gene da nucleoproteína
	Passo	Ciclo	Temperatura	Tempo
Primeira rodada	Desnaturação inicial	1	94 °C	3 min.
	Desnaturação	35	94 °C	30 s
	Hibridização		56 °C	30 s
	Alongamento		72 °C	45 s
	Alongamento final	1	72 °C	3 min.
Segunda rodada	Desnaturação inicial	1	94 °C	3 min.
	Desnaturação	35	94 °C	30 s
	Hibridização		58 °C	30 s
	Alongamento		72 °C	30 s
	Alongamento final	1	72 °C	3 min.

Tabela 6: Descrição das condições térmicas de ciclismo para o PCR convencional de hemi-aninhado.

Laboratório	País	Período de avaliação	Nb de amostras	Resultados do DFAT		Resultados do RIDT		Sensibilidade	Especificidade
				Pos	Negativo	Pos	Negativo
Laboratório 1	França	2015	82	50	32	50	32	96%	93.7%
Laboratório 2	Chad	2012-2015	44	33	11	33	11	100%	100%
Laboratório 3	Costa do Marfim	2017	10	8	2	8	2	100%	100%
Laboratório 4	Mali	2017	18	15	3	15	3	100%	100%
Laboratório 6	Itália	2016	8	8	0	8	0	100%	-
Todos		2015-2017	162	114	48	114	48	98.2%	95.8%

Tabela 7: Determinação dos parâmetros intrínsecos (sensibilidade, especificidade) do teste RIDT em relação ao método de referência DFAT, com base na análise de um total de 162 amostras e com a participação de 5 laboratórios diferentes.

Cepade vírus a	Host original	Localização	Concentração inicial (FFU/mL)b	Limite de detecção (FFU/mL)c
9147FRA	Raposa-vermelha	França	3.1 x 107	106
Cvs	Isolado de laboratório	-	1,6 x 107	106
8743THA	Humano	Tailândia	8.1 x 107	> 8.1 x 106
9508CZK (SAD)	Isolado de laboratório	-	5.4 x 108	107
Pv	Isolado de laboratório	-	4.3 x 107	106
9001FRA	Cão	Guiana Francesa	2.4 x 106	> 2.4 x 105
9704ARG	Morcego	Argentina	9,5 x 107	105
04030PHI	Humano	Filipinas	2,5 x 107	105

Tabela 8: Limite de detecção do RIDT utilizando 8 diferentes suspensões de vírus da raiva tituladas (de Léchenne et al. 2016¹⁴). ^um CVS: Desafio da cepa de vírus, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Vírus Pasteur. ^b Número de unidades fluorescentes de formação de foco (FFU) por mL. ^c Número de unidades fluorescentes de formação de foco (FFU) depositadas na faixa.

		RIDT realizado em
		Laboratório 1			Laboratório 2			Combinado
		Positivo	Negativo	Total	Positivo	Negativo	Total	Positivo	Negativo	Total
Detecção viral de RNA	Positivo	18	1	19	26	0	32	44	7	51
	Negativo	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	Total	18	1	19	26	0	35	44	10	54

Tabela 9: Detecção de RNA viral com RT-qPCR na tira de teste Anigen usada em condições laboratoriais (Lab 1), em condições de campo e enviada à temperatura ambiente (Lab 2) ou combinada (de Léchenne et al. 2016¹⁴).

Tabela suplementar 1: Descrição das 162 amostras testadas com o teste RIDT para determinação de seus parâmetros intrínsecos apresentados na Tabela 7. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Discussão

O RIDT é um método simples, rápido e de baixo custo para o diagnóstico de raiva pós-morte e uma alternativa de campo promissora para testes laboratoriais. A aplicação desse teste, especialmente para áreas descentralizadas de países de baixa e média renda, melhoraria a compreensão da prevalência e transmissão do vírus da raiva em escala local e potencialmente nacional. Quando combinado com o método rápido de coleta de amostras cerebrais (sem necropsia completa), uma grande vantagem é que o teste pode ser inteiramente realizado no ambiente de campo, longe das instalações laboratoriais. Amostras cerebrais coletadas através do foramen magnum podem ser usadas para testes, portanto não é necessário abrir completamente o crânio animal. O teste é simples de realizar e interpretar e é particularmente adequado para atividades de vigilância de campo¹⁴. Outras vantagens do RIDT sobre o DFAT ou DRIT não são a necessidade de controles positivos e negativos e armazenamento de kits à temperatura ambiente. Além disso, o protocolo modificado, onde a etapa de diluição (1:10) em PBS é omitida, não requer reagentes extras para realizar o teste e simplifica ainda mais o procedimento em condições de campo.

Um ponto chave é a qualidade das amostras cerebrais. As amostras devem ser coletadas e testadas o mais rápido possível após a morte do animal suspeito, ou mantidas em temperatura fria antes do teste, para evitar a degradação. Amostras decompostas não devem ser testadas porque podem afetar o resultado (risco de resultado falso negativo). Embora ainda não existam dados sobre a perda de sensibilidade do RIDT ao longo do tempo para amostras cerebrais, nós imaginamos que ele é semelhante em comparação com o teste DFAT³². No entanto, o tempo entre a morte do animal e a realização do teste pode ser reduzido, pois o teste pode ser feito de forma rápida e direta no campo. Assim, há, em geral, menor risco de amostras decompostas.

Outro passo crítico dentro do protocolo é a migração da suspensão da amostra. A migração deve começar diretamente após o depósito da amostra (1-5 min). A alta viscosidade da suspensão poderia, portanto, influenciar negativamente a migração. Coçar suavemente a parte inferior do local de depósito do dispositivo com o conta-gotas e adicionar mais 1-2 gotas muitas vezes resolve esse problema, e a migração começa imediatamente depois.

A maioria dos testes ridt realizados em laboratórios africanos (Chade, Costa do Marfim e Mali) foram realizados a temperatura ambiente que pode exceder 30 °C, enquanto a faixa de temperatura para armazenamento e uso recomendada pelo fabricante é de 15 °C - 30 °C. Embora não tenhamos identificado nenhum impacto de alta temperatura no desempenho do teste RIDT, é necessário avaliá-lo com mais cuidado. Da mesma forma, o impacto da alta temperatura durante o armazenamento e transporte do dispositivo após o uso para detecção e genotipagem viral precisa de avaliação adicional. A sensibilidade da detecção de RNA viral por RT-qPCR da tira RIDT pode ser afetada pela qualidade da amostra cerebral inicialmente usada no teste, mas também pela condição de armazenamento dos testes RIDT após o uso. Por exemplo, a sensibilidade da detecção de RNA foi maior quando os testes RIDT utilizados foram armazenados em condições laboratoriais controladas (94,7%) em comparação com as condições de campo (por exemplo, Chade) (81,2%)¹⁴. Essas condições também podem afetar a integridade (especialmente o comprimento) do RNA fixado na tira, possivelmente explicando a sensibilidade moderada para genotipagem com base em amplicons PCR mais longos (por exemplo, >500 nucleotídeos)¹⁴. A sensibilidade do RT-qPCR realizada na tira de teste foi menor do que a obtida utilizando cartões FTA Whatman (80,6%)¹⁴. Semelhante a outras técnicas moleculares, a carga viral também pode impactar o sucesso do genotipagem com base em tiras RDIT, com resultados negativos potenciais para amostras com baixa carga viral¹⁴.

O teste não é recomendado atualmente pela OMS e OIE para diagnóstico de rotina e vigilância de doenças, e um resultado não pode ser usado por conta própria para orientar a tomada de decisão da PEP. Ainda é necessária mais validação do teste. No entanto, o diagnóstico rápido e preciso da raiva é um elemento crucial dos sistemas contínuos de vigilância da raiva e é fundamental para aumentar o compromisso político, que é eminentemente importante para o sucesso do controle da raiva sustentável³³. Os testes RIDT oferecem novas oportunidades de diagnóstico da raiva neste contexto e são uma ferramenta útil para expandir a vigilância da raiva animal no campo em áreas enzoóticas de baixa ou média renda.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjugado do nucleocapsídeo antirrábico (liofilizado, adsorvido)	Bio-Rad, França	3572112	Anticorpo policlonal conjugado com fluoresceína-5-isotiocianato (FITC) contra o nucleocapsídeo do vírus da raiva. Use para a técnica de referência DFAT.
Sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems, França	4351104	Amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração do dispositivo RIDT.
Pipeta de plástico descartável, canudo, braçadeira, conta-gotas	-		Equipamento usado para a coleta do tronco cerebral (medula oblonga) através do forame magno (via occipital).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, França	3574911	Contra-coloração usada para o DFAT para facilitar a leitura sob microscópio UV.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics,	Alemanha-Primer	avançado para a amplificação do controle interno eGFP por RT-qPCR após extração de RNA do dispositivo RIDT, sequência: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics,	Alemanha-Primer	reverso para a amplificação do controle interno eGFP por RT-qPCR após extração do dispositivo RIDT, sequência: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics,	Alemanha-Primer	reverso para a amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração de RNA do dispositivo RIDT, sequência: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics,	Alemanha-Primer	avançado para a amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração de RNA do dispositivo RIDT, sequência: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Sonda eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Alemanha-Primer	avançado para amplificação do controle interno por RT-qPCR após extração do dispositivo RIDT, sequência: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Sonda RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Alemanha-Sonda	para amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração de RNA do dispositivo RIDT, sequência: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Sonda RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Alemanha-Sonda	para amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração de RNA do dispositivo RIDT, sequência: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Kit de teste rápido de raiva BioNote	Inc., República da Coréia	RG18-01DD	Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT, também chamado de dispositivo de fluxo lateral ou LFD) para o diagnóstico post-mortem da raiva.
Inibidor de ribonuclease RNasina recombinante	Promega, EUA	N2515	Enzima usada com o kit para amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração do dispositivo RIDT.
Kit de qRT-PCR SuperScript III Platinum One-Step	Invitrogen, França	11732-020	Kit para amplificação do RNA viral por RT-qPCR após extração do dispositivo RIDT.
Reagente de TRIzol	Invitrogen, França	15596026	Extração de RNA total à base de fenol/clorofórmio usando a membrana de celulose do RIDT.