Summary
우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.
Abstract
기능 광견병 감시 시스템은 신뢰할 수있는 데이터를 제공하고 질병 통제에 필요한 정치적 헌신을 증가시키는 데 중요합니다. 현재까지 광견병 양성으로 의심되는 동물은 고전 또는 분자 실험실 방법을 사용하여 사후 확인에 제출해야합니다. 그러나, 대부분의 풍토성 지역은 동물 광견병 진단이 중앙 수의학 실험실로 제한되는 저소득 및 중간 소득 국가에 있습니다. 감시 인프라의 가용성이 좋지 않은 것은 원격 지역에서 보고된 심각한 질병으로 이어집니다. 낮은 기술 적 전문 지식을 필요로하는 여러 진단 프로토콜이 최근에 개발되어 분산 된 실험실에서 광견병 진단을 확립 할 수있는 기회를 제공합니다. 우리는 여기에 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 동물 광견병의 현장 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석 및 바이러스 성 지화제를 위한 장치의 추가 사용을 설명하여 프로토콜을 완료합니다. RIDT는 뇌 샘플에서 광견병 바이러스 및 기타 리사바이러스를 쉽게 감지합니다. 이러한 테스트의 원리는 간단하다 : 뇌 물질은 금 공각 항체가 광견병 항원에게 특별히 결합 테스트 스트립에 적용됩니다. 항원 항체 복합체는 시험선에 고정된 항체에 더 결합하여 명확하게 보이는 보라색 선을 초래합니다. 바이러스는 시험 스트립에서 비활성화됩니다, 그러나 바이러스성 RNA는 이후에 추출될 수 있습니다. 이를 통해 전염성 뇌 샘플이 아닌 테스트 스트립을 확인 및 분자 입력을 위해 장비 된 실험실로 안전하고 쉽게 전송 할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜의 수정에 기초하여, 우리는 금 표준 기준 방법, 직접 면역 불광 항체 테스트에 비해 98 %에 도달, 증가 테스트 감도를 발견했다. 테스트의 장점은 다양합니다 : 신속하고 사용하기 쉽고 저렴한 비용과 현미경 검사 또는 냉간 사슬 규정 준수와 같은 실험실 인프라에 대한 요구 사항이 없습니다. RIDT는 참조 진단 방법을 사용할 수 없는 영역에 유용한 대안을 나타냅니다.
Introduction
개 광견병은 인간 광견병의 주요 원인이며, 전 세계적으로 연간 약 59,000명의 인명 사망을 담당하며, 아시아와 아프리카1의저소득 및 중소득 국가(LMIC)에서 거의 모두 발생합니다. 주요 병인학은 신경성 개 관련 고전적인 광견병 바이러스 (RABV, 가족 Rhabdoviridae,속 리사 바이러스,종 광견병 lyssavirus). 그러나, 박쥐 종에서 주로 순환하는 다른 광견병 관련 리사바이러스는 질병2,,3을유발한다. 영향을받는 지역에서, 질병 감시 및 통제는 수시로 믿을 수 있는 데이터의 부족으로 확률이 낮은 수준의 정치적 투입에 의해 방해됩니다44,5,,6. 질병 과소보고의 한 가지 이유는 실험실 진단의 부재, 부분적으로 인해 장착 된 실험실 및 훈련 된 직원에 대한 제한된 액세스뿐만 아니라 표본의 선적의 어려움. 실험실 진단은 광견병 케이스를 확인하고 추가로 관련 긴장의 유전 특성화를 허용하기 위하여 필요합니다, 지역 수준 4에서 바이러스 전송에 대한 통찰력을제공,55,47.
세계보건기구(WHO)와 세계동물건강기구(OIE)가 승인한 사후 광견병 진단을 위한 현재의 금 기준은 직접 형광항체 검사(DFAT), 직접 급속면역조직화학시험(DRIT) 및 분자방법(예를 들어, 역전사 폴리머라제 연쇄4반응(RT-PCR)4,,8. 그러나 LMIC의 적절한 적용은 일관되지 않은 전원 공급 장치, 냉각되지 않은 샘플 운송 및 품질 관리 시스템 부족으로 인해 부적절한 실험실 시설로 인해 제한적입니다. 동물 광견병 진단은 일반적으로 LMIC의 중앙 수의학 실험실에서만 수행되므로 기존 감시 데이터는 주로 도시 지역의 광견병 상황을 반영합니다.
최근 개발된 저기술 진단 대안은 외딴 지역과 분산광견병44,8,,9에서광견병 진단을 확립할 수 있는 기회를 제공한다. 신속한 면역크로마토그래피 진단 시험(RIDT)은 금 공주 검출기 항체를 이용한 면역크로마토그래피를 기반으로 하는 측면 유량 시험이며 매우 유망한 광견병 진단도구(10,,11,,12,,13)이다. 원리는 간단하다: 희석 후, 뇌 물질은 제공된 완충제에 혼합되고, 금컨쥬게이션된 단일클론 항체가 광견병에 특별히 결합되는 시험 스트립에 몇 방울을 적용하며, 주로 뉴클레오프로틴(도1). 항원-항체 복합체는 광견병 항원에 대하여 고정항체에 시험선(T-line)에 결합하는 측면 유동 이동을 겪으며, 그 결과 명확하게 보이는 보라색 선이 생긴다. 광견병에 얽매이지 않는 나머지 금 공인 항체는 추가 표적 항체를 통해 멤브레인으로 계속 이동하고 수정하여 명확하게 보이는 보라색 제어 라인(C-line)을 생성합니다.
한 단계, 저렴한 비용 방법은 빠르고 매우 쉬우며 고가의 장비 또는 특수 보관 조건이 필요하지 않습니다. 희석 단계를 제거하기 위해 제조업체 프로토콜을 수정하면 테스트를 수행하는 데 필요한 거의 모든 장비 및 시약이키트(14)에포함됩니다. 결과는 현미경없이 5-10 분 후에 읽습니다. 이것은 냉장 운송 및 견본 저장과 더불어 형광 현미경 및 면역 형광 conjugate를 요구하는 DFAT 시험에 비해 중요한 이점입니다. 가벼운 현미경을 사용하여 수행 될 수있는 DRIT 테스트조차도 아직 상용화되지 않은 항 광견병 항체를 저장하기 위해 연속 콜드 체인이 필요합니다. DRIT에 비해 RIDT는 폐기물 처리가 제대로 규제되지 않는 국가에서 독성 화학 물질이 필요하지 않습니다. 빠른 테스트는 금 표준 테스트 DFAT 및 DRIT에 비해 훨씬 쉽게 해석으로 시간이 많이 소요됩니다. 이를 통해 기술 전문성이 제한된 직원의 현장 테스트를 수행할 수 있습니다.
이러한 시험 특성에 따라, 원격 지역에서 의심되는 동물의 신속한 진단이 가능해지고, 노출된 사람들을 위해 노출 예방(PEP)의 구현을 가능한 한 빨리 가능하게 합니다. 또한 광견병 샘플의 거리 운송이 필요하지 않아 테스트 시 샘플 품질이 향상됩니다. 그러나 RIDT 테스트로 얻은 결과는 현재 DFAT 또는 DRIT와 같은 참조 진단 테스트를 사용하여 확인되어야 합니다.
RABV 및 기타 리사바이러스의 검출을 위한 RIDT 기술이 평가되었습니다. 2007년 한국 연구진이 실시한 첫 번째 연구 중하나는 10. DFAT 방법에 비해, 51개의 동물 샘플과 4개의 RABV 분리에서, RIDT는 각각 91.7%와 100%의 감도 및 특이성을 보였다. 이러한 결과는 DFAT에 비해 감도 및 특이성을 가진 한국의 110마리의 동물 뇌 샘플로 나중에 확인되었으며, 각각15%로 나타났다. 최근에는 다른 연구에서는 다른 지리적 기원을 가진 다양한 동물의 바이러스 격리 및/또는 감염된 뇌 샘플을 사용하여 이 RIDT의 성능을 평가했습니다. 아프리카 RABV 및 기타 아프리카 리사바이러스(듀베나지 바이러스(DUVV), 라고스 박쥐 바이러스(LBV), 모콜라 바이러스(MOKV)를 포함한 21개의 샘플의 패널이 DFAT16에비해 100%의 감도로 성공적으로 검출되었다. 유사한 고감도 (96.5%) 및 특이성 (100%) 값은 에티오피아17에서115 뇌 샘플의 패널에서 얻어졌다. 또 다른 연구는 유럽 RABV 격리, 두 개의 다른 유럽 리사 바이러스 (유럽 박쥐 리사 바이러스 유형 1 (EBLV-1) 및 유형 2 (EBLV-2)) 및 호주 박쥐 리사 바이러스 (ABLV)18을평가했다. 172개의 동물뇌 시료를 분석한 결과, RIDT 키트는 DFAT대비 감도 88.3% 및 특이성 100% 특이성을 가지고 있으며, 3개의 광견병 관련 리사바이러스가 성공적으로 검출되었다. 이 연구에서, 거짓 부정적인 결과 중 일부는 글리세롤 버퍼에 저장 된 뇌 샘플에서 온, 부적절한 글리세롤 제거 모세관 흐름 또는 항체 바인딩에 영향을 제안. 호주 박쥐에서 43 개의 임상 샘플을 최근 분석한 결과 DFAT19에완전한 일치를 가진 이전 테스트 결과를 확인했습니다. 2개의 연구 결과는 임상 견본의 한정된 수에 RIDT를 사용하여 인도에서 실시되었습니다 (11 및 34 견본). DFAT에 비해 민감도는 85.7%에서 91.7%, 특이성은 100%20%,,21이었다. 아프리카, 유럽 및 중동에서 80 개의 동물 뇌 샘플을 사용하여이 키트의 또 다른 평가는 특이성에 대한 DFAT와 완전한 일치를 얻었다 (100%) 그러나 더 높은 감도 (96.9%) 이전연구(22)와비교하면. 이 RIDT의 최근 실험실 간 비교에서 10개의 샘플의 패널을 사용하여 22개의 다른 실험실에서 수행되었으며, 전체 일치도는 99.5%23이었다.
최근 단 하나의 다심층 연구에서 전체 RIDT성능(24)이만족스럽지 못한 것으로 나타났습니다. 세 가지 데이터 집합의 샘플을 테스트하고 DFAT에 비해 가변 감도 및 특이성 값을 제공했습니다. 예를 들어, 실험감염동물로부터 의한 샘플의 제1 패널(n=51)과 제2패널(n=31)으로 얻은 민감도 및 특이성은 각각 16% 및 43%의 감도를 주었으며, 특이성은 둘 다에 대해 100%였다. 반대로, 실험실 B에 의해 분석된 현장 임상 샘플의 제3 패널(n=30)의 결과는 DFAT의 결과와 완전한 일치를 제공했으며, 이는 실험실 A(85% 감도 및 100% 특이성)에 의해 더욱 완전히 확인되었다. BATCH-투-Batch 변화는 RIDT24를사용하여 상대적으로 낮은 감도에 대한 가능한 설명으로 제안되었다.
동시에, 다른 연구는 제조 업체 권장 프로토콜(14)의수정과 함께, 상기 설명 된 RIDT의 유사한 유효성 검사 프로세스를 수행했다. PBS의 사전 희석 단계(1:10)는 뇌 물질의 제조 중에 생략되었다. 이 간단한 수정 프로토콜에 기초하여, 저자는 각각 95.3 %와 93.3 %의 민감도와 특이성을 얻었으며, 실험실 조건하에서 73 개의 동물 뇌 샘플의 데이터 세트로 다양한 RABV 균주에 자연스럽게 또는 실험적으로 감염된 DFAT에 비해 각각 95.3 %와 93.3 %의 민감성을 얻었습니다. 연구 결과는 필드 조정에서 이 RIDT의 첫번째 평가를 제시했습니다 (차드, 아프리카). 48개의 임상 뇌 샘플에서 감도 및 특이성은 각각 94.4%와 100%였습니다. DFAT와 RIDT 사이의 불일치는 RT-PCR확인 후 결정된 DFAT의 거짓 양성 결과 때문이었습니다. 이러한 결과가 삭제되었을 때 완전한 일치가 있었고 RIDT가 이러한 필드조건(14)에서DFAT가 더 신뢰할 수 있음을 입증했습니다. 수정된 프로토콜을 사용하여 일괄 처리 대 일괄 변경이 관찰되지 않았습니다. 수정된 프로토콜이 Eggerbauer 외24의연구에서 소수의 DFAT/RIDT 발산 샘플(n=8)에 적용되었을 때, 모두 콩코드(100% 감도)를 발견했다.
RIDT의 또 다른 주요 장점은 분자 기술(예: RT-PCR)과 후속 지노티핑14, 24를,24사용하여 스트립에 고정된 바이러스 RNA를 검출하기 위한 이차 사용이다. 추출 단계에 따라, Léchenne외. 14는 51개의 샘플 패널에서 86.3%의 감도를 가진 RT-PCR를 사용하여 애니젠 장치 멤브레인에 고정된 바이러스 RNA를 시연했습니다(주변 온도에서 차드에서 테스트 및 출하된 18개의 샘플 포함). 후속 지노티핑은 테스트된 14개의 샘플 중 93%에서 가능하였다. 길이가 500개 이상인 PCR 앰플리톤의 Sanger 염기서열분석이 사용되었다. RABV 격리 이외에, 시험은 완전히 일치하는 국제 간 실험실 시험14도중 4개의 그밖 리사바이러스 종, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 및 보켈로 박쥐 리사바이러스 (BBLV)를 검출했습니다. 바이러스 RNA 검출의 감도는 더 높았습니다 (100%) 에거바우어 등의 연구에서, 실험실 샘플검사(24)에기초한. 후자의 연구는 또한 RIDT 키트에 사용되는 버퍼가 비활성화 된 바이러스임을 입증했다. 따라서, 장치는 분자 확인 및 genotyping을 위해, 실험실을 참조하기 위하여 특정 생체 안전 예방 조치 없이 주변 온도에서 쉽게 출하될 수 있습니다.
이전 평가에 따라 RIDT 도구는 특히 참조 진단 기술을 사용할 수 없는 경우 필드 설정에서 사용할 수 있는 수많은 이점을 제공합니다. 그러나, 본 시험은 또한 항원 검출의 낮은민감도(14,24)의몇 가지한계,특히 있다. 이 시험은 뇌 샘플과 같은 바이러스 성 항원의 다량을 포함하는 견본에 적용됩니다. 그러나 타액이나 다른 체액과 같은 다른 샘플에는 적합하지 않습니다. 또 다른 단점은 DFAT, RT-PCR 또는 DRIT를 수행하는 비용에 비해 비용이 저렴하지만 LMIC의 경우 여전히 높은 장치 (유럽에서 약 5-10 유로)의 비용입니다. 그러나 향후 다른 회사의 유사한 RIDT의 개발 및 검증은 가격 하락으로 이어질 수 있습니다. 한 연구에서는 일괄 처리 간 변형을 보고했습니다. 다른 사람에 의해 보고 되지 는 않지만, 품질 관리 환경에서 사용 되는 모든 시약에 관해서는, 새로운 배치를 테스트 할 때 엄격한 품질 관리를 수행 해야 합니다. 다른배치(14)를사용할 때 수정된 프로토콜의 사용은 변경되지 않았습니다. 한 연구를 제외한 모든 연구는 RDIT의 감도가 DFAT (약 90 %-95 %)에 비해 높았다는 것을 입증했습니다. 광견병은 항상 치명적이기 때문에 DFAT, DRIT 또는 RT-PCR14와같은 참조 진단 테스트를 사용하여 RDIT로 부정적인 결과를 확인하는 것이 좋습니다.
이 원고에서, 우리는 상용화 된 RIDT의 예를 기반으로 동물 광견병의 필드 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시, 제조 업체 권장에 비해 수정 된 프로토콜의 응용에 뇌 샘플 수집에서 (이는 이전에 검증 된14)및 후속 분자 분석. 이 프로토콜은 DFAT 시험과 함께 광견병 진단을 위해 일상적으로 사용된 서아프리카와 중앙 아프리카의 필드 조건하에서 여러 번 적용되고 검증되었습니다. 또한 실험실 설정에서 장치에 고정된 바이러스 RNA의 RT-PCR를 사용하여 추출 및 검출을 위한 두 번째 응용 프로그램을 시연합니다.
Protocol
1. 포멘 매그넘 (목선 경로)25를 통해 샘플 컬렉션
참고: 이 기술은 실험실 조건 또는 현장 설정에서 구현할 수 있습니다. 샘플은 의심되는 동물의 사망 후 가능한 한 빨리 처리되어야하며 결과에 영향을 미칠 수있는 분해를 피하기 위해 시원한 온도 (냉장 또는 냉동)에 보관해야합니다. DFAT 및 DRIT와 같은 리사바이러스 항원 검출에 기초한 다른 기준 기술과 유사하게 분해된 시료는 결과에 영향을 줄 수 있기 때문에 테스트해서는 안 됩니다(거짓 음의 결과의 위험).
주의: 모든 샘플은 잠재적으로 전염성이 있는 것으로 간주되어야 합니다. 안전 규정 및 절차는 현장 설정4에서도엄격하게 따라야 합니다. 특히 마스크, 안경, 장갑, 실험실 코트 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 재료 및 시료 오염 제거에 적합한 소독제를 사용하십시오 (예 : 권장 제조업체 희석제를 사용한 하이포클로리트 나트륨, 70 % 알코올 - 에탄올 또는 이소프로판올, 1 % 비누 용액). 샘플을 처리하는 모든 직원은 광견병에 대한 예방 접종을 받아야합니다.
- 첫 번째 자궁 경부 척추 (아틀라스 척추) 전에 칼로 동물 머리를 제거하여 포멘 매그넘에 액세스하십시오.
참고: 감염 에어로졸을 최소화하려면 수동 톱 이나 이와 유사한 도구를 사용하지 마십시오. - 일회용 플라스틱 파이펫(도2A),음주짚(도2B),클램프(도Figure 2Figure 22C)또는 드롭퍼(RIDT와 함께 공급)를 사용하여 뇌간(medulla oblongata) 샘플을 수집한다(도2D).Figure 2
참고: 샘플 수집 시 결과의 신뢰성을 위한 가장 중요한 단계이므로 특별한 주의를 기울여야 합니다. 관심있는 뇌의 일부를 수집하는 방법을 간단한 방법으로 보여주는 관련 비디오 외에도 올바른 해부학 섹션을 수집하는 데 교육 단계가 좋습니다. - 선택적으로 그리고 뇌줄기(medulla oblongata)를 추가하여, 눈 소켓을 향해 플라스틱 파이펫이나 짚을 밀고 회전시킴으로써 동일한 후두 경로에 의해 뇌간 또는 뇌(소뇌, 해마, 시상 및 피질)의 다른 부분을 수집한다(그림3).
- 빨대 또는 파이펫을 사용하는 경우, 뇌 샘플을 튜브에 입금하기 위해 부드럽게 짜내십시오(0.5-2 g)를 튜브에 보관하여 후속 분석 및/또는 바이오뱅킹을 합니다.
참고: 글리세롤의 샘플 저장은 RIDT18의모세관 흐름 또는 항체 결합 단계에 영향을 미치는 것으로 보이기 때문에 권장되지 않습니다.
2. 수정된 RIDT 프로토콜14의 실행
참고: 이 수정은 제조업체 프로토콜(모든 버전)에 명시된 대로 희석 단계(1:10)를 PBS로 생략하고 실험실 또는 필드 설정에서 구현할 수 있습니다.
- 면봉/드롭퍼를 사용하여 뇌 물질의 땅콩 또는 완두콩(0.1-0.5g)에 해당하는 것을 수집하고 완충식 샘플 튜브에 놓습니다.
참고: 수정된 프로토콜의 경우 모든 시약/소모품은 키트에 포함되어 있습니다(PBS 또는 추가 튜브가 필요하지 않음)(그림 4). 키트의 일괄 처리 번호를 문서화하고 만료 날짜의 유효성을 확인합니다. - 동질현절이 얻어질 때까지 약 30s의 면봉이나 드롭퍼로 튜브에서 뇌 물질을 직접 분쇄한다.
참고: 완충 반응은 제조업체의프로토콜(24)의조건에서 바이러스의 감염성을 비활성화한다. - 드롭퍼를 사용하여 테스트 장치의 샘플 입구에 서스펜션의 4방울(약 100 μL)을 증착한다.
- 테스트 장치를 읽기 전에 전체 샘플 마이그레이션(1-5분)을 기다립니다. 샘플(1-5분)을 입금한 후 마이그레이션이 빠르게 시작되어야 합니다.
- 지연(점도 정지가 높기 때문에) 또는 마이그레이션의 시작을 가속화하기 위해 드롭퍼(1-5회)로 장치의 예치 부위의 바닥을 부드럽게 긁어내고 결국 1-2방울을 더 첨가합니다. 마이그레이션은 그 이후에 즉시 시작해야 합니다.
- 마이그레이션이 끝난 후 5-10분 후, 20분 이상 검색 창이 테스트 결과를 읽습니다.
- 도 5에따르면 검출 창에서 제어선(C선) 및 테스트 라인(T-line)(보라색 선)의 존재 또는 부재에 따라 결과를 해석한다. 두 선이 보이면 양수(도5A),C라인만 존재할 경우(도Figure 55B)및 T선만 존재하거나 선이 보이지 않는 경우 유효하지 않은 경우 음수(그림Figure 5Figure 55A)를고려한다.
참고: 유효하지 않은 결과는 적어도 한 번 반복되어야 합니다. 결과가 유효하지 않은 상태로 유지되는 경우 다른 기술을 수행해야 합니다. RIDT로 얻은 부정적인 결과는 DFAT, DRIT 및 분자 방법(폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR)과 같은 금 표준 기준 방법을 사용하여 이후에 확인되어야 합니다. 이 테스트의 감도가 높지만 (대표 결과 참조), 그것은 아니다 100%. - 사용 가능한 경우 사용 장치를 실온에 저장하거나 가능한 경우 냉장/동결을 통해 후속 분자 분석을 위해 보관하십시오(섹션 4 참조). 완충관에서 -20°C/-80°C의 나머지 시료 현탁액을 동결하여 필요한 경우 또는 후속 분자 분석을 위해 시험을 반복한다.
3. RIDT 장치에서 RT-qPCR에 의한 RNA 추출 및 검출
참고: 이 단계는 적응된 환경과 분자 진단에 적합한 장비가 있는 실험실 조건에서만 구현할 수 있습니다. RIDT 테스트 후 곧 수행되거나 실온(15-30°C)에 저장된 보관된 RIDT 장치에서 소급하여 냉장 또는 냉동할 수 있습니다.
- RNA 추출
참고: 추출 단계를 모니터링하려면 내인성 mRNA(예: ß-actin) 또는 외인성 제어(예: eGFP 합성 RNA)가 추출26,,27의첫 번째 단계에서 직접 시료로 스파이크될 수 있는 내부 제어를 사용하는 것이 좋습니다.- 장치를 조심스럽게 열고 필터 용지를 제거합니다.
- 시료의 퇴적 면적을 잘라 트라이 시약 LS의 1mL를 포함하는 튜브에 배치합니다. RT에서 1시간 동안 부드러운 일반 수동 교반으로 배양합니다.
- 이전에 설명된27과같이 제조업체 권장 사항에 따라 추출을 수행하십시오. 이 단계에서, 외인성 내부 제어를 추가할 수 있다.
- 이 과정에서 제조업체 권장 사항에 따라 RNA의 침전을 촉진하기 위해 글리코겐 2 μL을 추가합니다.
- 일반적으로 사용되는 50 μL의 부피와 함께 핵이 없는 물에서 RNA 재서스펜션에 대한 최종 부피를 조정합니다.
참고: 수성 및 유기상 분리를 위한 원심분리 단계의 끝에서(3-시약 LS에 클로로폼 200 μL을 첨가한 후), 장치에서 막 조각은 튜브의 바닥에 있고 상부 수성 상의 수집을 방해하지 않습니다. 대안적으로, 페놀 계 시약 및 실리카멤브레인(28)을사용하여 다른 쉽고 신속한 프로토콜을 사용할 수 있다.
- RT-qPCR26에 의한 감지
참고: 추출된 시료에 존재하는 잠재적 바이러스 RNA의 검출은 역전사 PCR, 종래의 (엔드포인트) 또는 실시간 PCR(qPCR)과 같은 다른 분자 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 종래의 RT-PCR(27,29또는29 RT-qPCR26,,30)과 같은 여러 가지 방법이 바이러스 성 뉴클레오단백질 또는 중합효소 유전자를 표적으로 한다. 한 가지 예는 바이러스 성 폴리머라제 중 보존 된 영역을 대상으로 이중 결합 된 범리사 바이러스 RT-qPCR을 기반으로 아래에 제시될 것이다. 이 RT-qPCR 기술은 TaqMan 프로브 기술(범래브 RT-qPCR)을 기반으로 한 RT-qPCR과 SyBR 그린 감지(범용 리사 RT-qPCR)를 사용하여 서로 다른 두 가지 RT-qPCR을 연결합니다. 또한, 추출 과정에서 직접 스파이크된 외인성 내부 제어(eGFP RNA)의 검출은 특정 TaqMan 프로브 계 RT-qPCR(eGFP RT-qPCR)에 의해 수행된다. 바이러스 RNA의 검출을 위해 선택된 분자 기술의 신중한 현장 검증은 특히, 실시간 RT-PCR에 대한 프라이머 및 프로브가 관심 영역에서 순환하는 균주의 검출을 위해 적응되는지 확인하는 것이중요하다.- 핵에 1:10으로 RNA 샘플을 희석시 자유수분. 96웰 반응 플레이트 또는 기타 포맷을 사용하여 각 RNA 샘플을 복제하여 테스트합니다. 각 분석기마다 양수 및 음수 컨트롤을 사용하고 최소한 중복으로 테스트합니다.
- 표 1에따라 세 가지 RT-qPCR 분석에 대한 마스터 믹스 반응 솔루션을 준비하고 표 2에표시된 프라이머/프로브를 준비한다.
- 희석된 RNA 샘플 5μL과 3개의 서로 다른 세약 각각에 마스터 믹스 15 μL을 추가합니다. 범 RABV RT-qPCR 분석기와 eGFP RT-qPCR 분석은 동일한 플레이트에서 순환할 수 있습니다.
- 표 3에표시된 열 순환 조건에 따라 다른 해석을 실행합니다. 하나의 PCR 열 사이클러만 사용할 수 있는 경우 범RABV RT-qPCR로 시작하여 범용 라브V RT-qPCR이 끝날 때까지 4°C에서 범리사 RT-qPCR용 플레이트를 보관하십시오.
- 표 4에따른 세 가지 분석으로 얻은 결과를 분석한다.
4. RIDT 장치에서 RNA 추출 후 Genotyping
- 역 전사 RT27,29
- RNA 6μL, PD 2μL(N)6 임의 프라이머(200 μg/μL) 및 10μL의 최종 부피를 위해 2μl의 뉴클레아제 없는 물로 마스터 믹스를 준비한다.
- 65°C에서 열 블록에서 10 분 동안 배양 한 다음 얼음에 저장하십시오.
- 5x 퍼스트 스트랜드 버퍼 6μL, 0.1 M 디티오트리톨(DTT), 슈퍼스크립트 II 역전사 1μL(200U), RNasin 2μL(80U), 2μL(10μM) 및 핵에 대한 2μL(10μM)의 최종 시료를 획득하여 최종 20μL의 마스터 믹스를 준비한다.
- 마스터 믹스(20 μL)를 샘플(10 μL)(최종 부피 30 μL)에 추가하고 열블록에서 90분 동안 42°C에서 배양한다.
- PCR 증폭을 사용하여 다음 단계로 진행하거나 cDNA를 -20°C에 저장합니다.
- 종래의 PCR27,,29,,31
참고 : 기존의 PCR의 다른 기술은 지노핑에 사용할 수 있습니다. 두 가지는, 둘 다 제시됩니다, 둘 다 헤미 중첩 PCR, 뉴클레오단백질의 부분 또는 리사 바이러스의 바이러스 성 단백질의 일부를 대상으로. 프로토콜은 프라이머 및 사이클링 조건을 제외하고 이러한 각 분석서에 대해 동일합니다. 양성(양성 RNA) 및 음수(음수 cDNA 및/또는 뉴클레아제 가 없는 물) 제어는 각 계열 및 각 PCR 라운드에 포함되어야 합니다.- 0.2 mL 마이크로튜브의 각 샘플을 첫 번째 PCR 단계에 대한 마스터 믹스 반응 솔루션에 준비한다. 이 믹스는 10x NH4 반응 버퍼 5μL, MgCl2 2용액(50mMM), dNTP 믹스 1μL(10 μM), 각 프라이머의 1μL(10 μM), 비오타크 DNA 폴리머라제 0.2 μL(1U), 뉴클레아스 프리 워터(48)의 37.3μL을 함유하고 있습니다. 프라이머는 표 5에표시됩니다.
- 표 6에따르면 각 분석기마다 각 튜브에 2 μL의 cDNA를 추가하고 각 분석기마다 별도의 기존 PCR 열 사이클러에 사이클을 넣습니다.
- 헤미 중첩 PCR 반응에 적합한 프라이머(표5)를사용하여 이전과 동일한 두 번째 마스터 믹스 반응 용액을 준비한다.
- 표 6에표시된 사이클링 파라미터를 사용하여 1라운드 PCR 제품의 2μL을 기존 PCR 열 사이클러에 추가하고 사이클을 한다.
- 에티듐 브로마이드 (최종 농도 0.01%)와 함께 1 % 아가로즈 젤 (Tris-acetate EDTA 버퍼 1x - TAE 1x)에 로드 한 후 다른 PCR 제품 (1 및 2 라운드 PCR)을 시각화하십시오. 120 V에서 30 분 동안 젤을 실행합니다. 양수 PCR 결과는 예상 된 크기의 밝은 대역의 형태로 관찰된다(표 5).
- Sanger 시퀀싱
- 범리사바이러스 헤미 중첩 PCR로 얻은 앰플리콘의 Sanger 시퀀싱을 수행하고 지노티핑 분석을 완료한다.
Representative Results
모든 진단 방법과 마찬가지로 샘플 수집은 특히 필드 설정에서 수행될 때 결과의 안정성에 가장 중요합니다. 고품질 샘플 의 수집을 보장하기 위해 수집 프로세스는 가능한 한 간단해야합니다. 동물 광견병의 사후 진단을 위한 포르멘 매그넘 경로를 통해 뇌 생검(medulla oblongata을 가진 뇌간)의 수집은 도 2A-D25에명시된 바와 같이 이 요구 사항을 충족시다.
수집 후 뇌 샘플은 RIDT의 수정된 프로토콜에 제출되며 도 6로요약된다. 프로토콜 섹션에 명시된 바와 같이, 제공된 프로토콜의 주요 적응은 PBS의 희석 단계의 생략으로, 이는 절차와 필요한 소모품/시약을 단순화하여 키트에 모두 포함되어있다(도 4).
이 수정된 프로토콜은 광견병에 대한 WHO 협력 센터(Lab 1, 프랑스), 광견병에 대한 FAO 참조 센터 1개(Lab 5, 이탈리아) 및 아프리카 내 밀집 국가, 차드(Lab 2), 코트디부아르(Lab 3) 및 말리(Lab 4)에 위치한 3개의 참조 실험실을 포함하여 5개의 다른 실험실에서 구현및 평가되었습니다. 차드에서는 RIDT에 대한 평가가 실험실 및 현장 설정 모두에서 수행되었습니다.
기준 기술 DFAT에 비해, RDIT의 민감도 및 특이성은 모든 실험실에서 높았으며, 각각 96%에서 100% 및 93.7%에서 100%로높았다(표 7). RDIT의 가장 낮은 감도 및 특이성은 실험실 검증 단계 동안 Lab 1 (프랑스)에 대해 수득되었다. 테스트된 샘플의 누적 수(n=162)(보충표1)에기초하여, DFAT에 비해 전체 민감도 및 특이성은 각각 98.2% 및 95.8%,(표7)였다. 그러나, 이러한 예비하지만 유망한 결과는 제한된 샘플 데이터 집합에서 얻어졌으며, 특히 enzootic 영역에서 테스트된 양양성 및 음수 샘플의 상당수에서 추가로 확인되어야 하며, 현재 이종성 데이터 집합으로 인한 잠재적 과소평가 또는 편견을 피할 수 있습니다.
RIDT 검사는 리사바이러스 항원 수준이 중요한 감염된 동물의 뇌 생검에서 리사바이러스를 검출하는 데 적합합니다. 그러나, 적정 바이러스 현탁액을 테스트할 때 검출의 테스트 한계는 높게유지됩니다(표 8; 그림 7).
표 9(Léchenne 201614로부터)리사바이러스의 바이러스 성 폴리머라아제표적을 표적으로 하는 이중 결합범리사바이러스 RT-qPCR에 의해 RNA 검출 후 얻은 결과의 예를 나타낸다. 실험실 조건(실험실 1, n=32) 또는 차드(Lab 2, n=19)에서 수행된 51개의 양성 RIDT 테스트 패널을 테스트한 다음 주변 온도에서 실험실 1로 출하한 후 테스트되었습니다. 양성 검출은 18(94.7%), 26개(81.2%)로 수득되었다. 44개(86.3%) 실험실 1, 실험실 2 및 두 개의 샘플이 각각 결합되었습니다. 또한, 이러한 샘플 중 14개(실험실 1에서 10개, 실험실 2로부터 4개)를 대상으로 기미 중첩 PCR을 사용하여 수행되었으며, 그 중 13개(93%)를 성공적으로 수행하였다. (레첸 네 에서 201614).
그림 1: 광견병 진단을 위한 RIDT 구조의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동물(여기에 표시된 개)에서 뇌 샘플(수질 외경을 가진 뇌간)의 수집을 위한 신속한 간단한 기술의 예(말리). (A)일회용 플라스틱 파이펫(B) 컬렉션에 플라스틱 마시는 빨대(C) 컬렉션에 클램프(D) 컬렉션이 RIDT 키트에 제공된 폐기 드롭퍼가 있는 컬렉션.BCD 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 개 머리의 경도 해부학 섹션, 뇌의 다른 부분을 보여주는 (뇌간, 소뇌, 해마, 시상 및 피질) 밀 때 수집, 회전 운동에서, 후두 포라멘 경로를 통해 일회용 플라스틱 파이펫. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 장치, 일회용 플라스틱 드롭퍼, 일회용 면봉 및 분석 희석제를 포함한 RIDT 키트의 내용에 대한 설명. 샘플을 채취하고 보관하는 튜브는 제공되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 애니겐 RIDT 해석을 위한 대표적인 결과. (A)양수 결과(두 줄, C라인 및 T선의 눈에 보이는 존재)(B)음의 결과(C선의 눈에 보이는 존재만)(C)유효하지 않은 결과(눈에 보이는 C선의 부재). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 제조업체 지침에서 적용된 RIDT 프로토콜의 회로도 표현입니다. (A)프로토콜의 수정된 버전,제조업체(B)초기 프로토콜이 권장하는 희석 단계의 삭제와 함께, 뇌 샘플의 PBS에서 1:10 희석 단계의 사전1:10 희석 단계를 가진 제조자에서 권장한다. 수정된 버전의 프로토콜(그림 6A에표시됨)에서 삭제된 단계는 빨간색 선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: RIDT14의검출 한계를 결정하는 예. 연재 10:1 균주 9704ARG의 적정 광견병 바이러스의 희석이 사용되었다. 각 장치에 증착된 바이러스의 양은 FFU(형광 초점 형성 단위)에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 범RABV RT-qPCR 분석 | |
| 시약 | μL/반응 |
| 2X 반응 믹스(각 dNTP의 0.4mM 및 6m MgSO4를 포함하는 버퍼) | 10 |
| 뉴클레아제 프리 워터 | 1.5 |
| 타크3롱(포워드) [10 μM] | 1 |
| Taq17revlong (역) [10 μM] | 1 |
| RABV4 [10 μM] | 0.3 |
| RABV5 [10 μM] | 0.3 |
| MgSO4 [50mM] (키트제공) | 0.25 |
| ROX 레퍼런스 염료(25 μM) (키트에 제공) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (프로메가) | 0.2 |
| 슈퍼스크립트 III RT/플래티넘 타크 믹스 | 0.4 |
| 반응당 총 합계 | 15 |
| eGFP RT-qPCR 분석 | |
| 시약 | μL/반응 |
| 2X 반응 믹스(각 dNTP의 0.4mM 및 6m MgSO4를 포함하는 버퍼) | 10 |
| 뉴클레아제 프리 워터 | 2.8 |
| EGFP1F(포워드) [10 μM] | 0.5 |
| EGFP2R(역) [10 μM] | 0.5 |
| eGFP 프로브 [10 μM] | 0.3 |
| MgSO4 [50mM] (키트제공) | 0.25 |
| ROX 레퍼런스 염료(25 μM) (키트에 제공) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (프로메가) | 0.2 |
| 슈퍼스크립트 III RT/플래티넘 타크 믹스 | 0.4 |
| 반응당 총 합계 | 15 |
| 팬 리사 RT-qPCR 분석 | |
| 시약 | μL/반응 |
| 2x SYBR 녹색 반응 믹스 | 10 |
| 뉴클레아제 프리 워터 | 2.1 |
| 타크5롱(포워드) [10 μM] | 1 |
| Taq16revlong (역) [10 μM] | 1 |
| MgSO4 [50mM] (키트제공) | 0.25 |
| ROX 레퍼런스 염료 (25 μM) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (프로메가) | 0.2 |
| 슈퍼스크립트 III RT/플래티넘 타크 믹스 | 0.4 |
| 반응당 총 합계 | 15 |
표 1: 세 가지 RT-qPCR 저세(범래-RABV RT-qPCR, 범용 리사 RT-qPCR 및 eGFP RT-qPCR)에 대한 마스터 믹스 반응 솔루션에 대한 설명.
| RT-qPCR 분석 | 이름 | 형식 | 길이 | 시퀀스 (5'-3') | 감각 | 위치 |
| 범RABV RT-qPCR 분석 | 타크3롱 | 뇌관 | 22 | ATG AGA AGT GGA 아야 AYC ATC A | S | 7273-7294a |
| 타크17레브롱 | 뇌관 | 25 | GAT CTG TCT GAA TAA 태그 AYC CAR G | AS | 7390-7414a | |
| RABV4 | 프로브 (FAM/탐라) | 29 | AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC | AS | 7314-7342a | |
| RABV5 | 프로브 (FAM/탐라) | 32 | AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY 개그 TTT TTY CA | S | 7353-7384a | |
| 팬 리사 RT-qPCR 분석 | 타크5롱 | 뇌관 | 23 | TAT 개그 AAA TGG AAC AAY CAY CA | S | 7272-7294a |
| 타크16레브롱 | 뇌관 | 25 | GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C | AS | 7366-7390a | |
| eGFP RT-qPCR 분석 | EGFP1F | 뇌관 | 20 | GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC | S | 637-656b |
| EGFP2R | 뇌관 | 19 | GAA CTC CAG CAG GAC CAT G | AS | 768-750b | |
| EGFP | 프로브 (FAM/탐라) | 22 | AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A | S | 703-724b |
표 2: 세 가지 RT-qPCR 어약(범래방 RT-qPCR, 범리사 RT-qPCR 및 eGFP RT-qPCR)에 대한 프라이머/프로브에 대한 설명. a 파스퇴르 바이러스 (PV) RABV 게놈 서열에 따르면 (GenBank 가입 번호 M13215). b 복제 벡터 pEGFP-1 서열에 따르면(GenBank 가입 번호 U55761).
| 범래브 RT-qPCR 및 eGFP RT-qPCR 에세이 | ||||
| 단계 | 주기 | 임시 | 시간 | 데이터 수집 |
| 역전사 | 1 | 45°C | 약 15분 | |
| RT 비활성화/초기 변성 | 1 | 95°C | 3분 | |
| 증폭 | 40 | 95°C | 15 s | |
| 61 °C | 1분 | 끝점 | ||
| 팬 리사 RT-qPCR 분석 | ||||
| 단계 | 주기 | 임시 | 시간 | 데이터 수집 |
| 역전사 | 1 | 45°C | 약 15분 | |
| RT 비활성화/초기 변성 | 1 | 95°C | 3분 | |
| 증폭 | 40 | 95°C | 15 s | |
| 55 °C | 1분 | 끝점 | ||
| 해리 곡선 | 1 | 95°C | 15 s | 0.1 °C /s, 55-95 °C 증가 |
| 55 °C | 1분 | |||
| 95°C | 15 s | |||
| 55 °C | 15 s | |||
표 3: 세 가지 RT-qPCR 저서(범RABV RT-qPCR, 범용 리사 RT-qPCR 및 eGFP RT-qPCR)에 대한 열 순환 조건에 대한 설명.
| 시험 | 분석 | 결과 | 해석 |
| eGFP RT-qPCR | 수락 간격의 Cq | 추출 유효성검사 | 다른 분석의 분석은 수행 할 수 있습니다 |
| 수락 간격에서 Cq | 추출유효성이 확인되지 않음 | 샘플 재테스트(실행 또는/및 추출 반복), 필요한 경우 다른 샘플을 요청 | |
| 범래브 RT-qPCR | Cq & lt;38 | 긍정적인 | 바이러스 RNA의 긍정적 인 검출 |
| Cq ≥38 | 부정적인 | 범리사 RT-qPCR 분석 분석 | |
| 범리사 RT-qPCR | 양수로 간주되는 용융 곡선 | 긍정적인 | 바이러스 RNA의 긍정적 인 검출 |
| 음수로 간주되는 용융 곡선 | 부정적인 | 바이러스 RNA의 검출의 부재 |
표 4: 이중 결합 된 범 리사 바이러스 RT-qPCR 분석의 전반적인 해석.
| 헤미 중첩 종래의 PCR 분석 | PCR 라운드 | 이름 | 길이 | 시퀀스 (5'-3') | 감각 | 위치a | 앰플리슨 크기 (bp) |
| 중합체 유전자를 표적으로 하는 헤미 중첩 PCR | 1라운드 | PVO5m | 20 | ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA | S | 7170-7189 | 320 |
| PVO9 | 19 | TGA CCA TTC 자동차 GTN G | AS | 7471-7489 | |||
| 2라운드 | PVO5m | 20 | ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A | S | 7170-7189 | 250 | |
| PVO8 | 22 | GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A | AS | 7398-7419 | |||
| 뉴클레오단백질 유전자를 표적으로 하는 헤미 중첩 PCR | 1라운드 | N127 | 20 | ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG | S | 55-74 | 1532 |
| N8m | 19 | CAG TCT CYT CNG CCA TCT C | AS | 1568-1586 | |||
| 2라운드 | N127 | 20 | ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG | S | 55-74 | 845 | |
| N829 | 19 | GCC CTG GTT CGA ACA TTC T | AS | 881-899 |
표 5: 기존의 헤미 중첩 PCR에 사용되는 프라이머에 대한 설명.
| 중합체 유전자를 표적으로 하는 헤미 중첩 PCR | ||||
| 단계 | 주기 | 온도 | 시간 | |
| 1라운드와 2라운드 | 초기 변성 | 1 | 94°C | 3분 |
| 변성 | 35 | 94°C | 30 s | |
| 혼성화 | 56 °C | 45 s | ||
| 신장 | 72 °C | 40 s | ||
| 최종 신장 | 1 | 72 °C | 3분 | |
| 뉴클레오단백질 유전자를 표적으로 하는 헤미 중첩 PCR | ||||
| 단계 | 주기 | 온도 | 시간 | |
| 1라운드 | 초기 변성 | 1 | 94°C | 3분 |
| 변성 | 35 | 94°C | 30 s | |
| 혼성화 | 56 °C | 30 s | ||
| 신장 | 72 °C | 45 s | ||
| 최종 신장 | 1 | 72 °C | 3분 | |
| 2라운드 | 초기 변성 | 1 | 94°C | 3분 |
| 변성 | 35 | 94°C | 30 s | |
| 혼성화 | 58 °C | 30 s | ||
| 신장 | 72 °C | 30 s | ||
| 최종 신장 | 1 | 72 °C | 3분 | |
표 6: 기존의 헤미 중첩 PCR에 대한 열 순환 조건에 대한 설명.
| 랩 | 국가 | 평가 기간 | 샘플 의 Nb | DFAT 결과 | RIDT 결과 | 감도 | 특이성 | ||
| Pos | Neg | Pos | Neg | ||||||
| 랩 1 | 프랑스 | 2015 | 82 | 50 | 32 | 50 | 32 | 96% | 93.7% |
| 랩 2 | 차드 | 2012-2015 | 44 | 33 | 11 | 33 | 11 | 100% | 100% |
| 랩 3 | 코트디부아르 | 2017 | 10 | 8 | 2 | 8 | 2 | 100% | 100% |
| 랩 4 | 말리 | 2017 | 18 | 15 | 3 | 15 | 3 | 100% | 100% |
| 랩 6 | 이탈리아 | 2016 | 8 | 8 | 0 | 8 | 0 | 100% | - |
| 모든 | 2015-2017 | 162 | 114 | 48 | 114 | 48 | 98.2% | 95.8% | |
표 7: 총 162개의 샘플의 분석에 기초하여 5개의 상이한 실험실의 참여와 함께 참조 DFAT 방법에 비해 RIDT 시험의 본질적인 파라미터(감도, 특이성)의 측정.
| 바이러스균주 | 원래 호스트 | 위치 | 초기 농도(FFU/mL)b | 감지 제한(FFU/mL)c |
| 9147FRA | 레드 폭스 | 프랑스 | 3.1 x 107 | 106 |
| Cvs | 실험실 격리 | - | 1.6 x 107 | 106 |
| 8743THA | 인간의 | 태국 | 8.1 x 107 | > 8.1 x 106 |
| 9508CZK (슬픈) | 실험실 격리 | - | 5.4 x 108 | 107 |
| 태양광 발전 | 실험실 격리 | - | 4.3 x 107 | 106 |
| 9001FRA | 개 | 프랑스령 기아나 | 2.4 x 106 | > 2.4 x 105 |
| 9704ARG | 박쥐 | 아르헨티나 | 9.5 x 107 | 105 |
| 04030PHI | 인간의 | 필리핀 | 2.5 x 107 | 105 |
표 8: 8가지 상이한 격자 광견병 바이러스 현탁액을 이용한 RIDT 의 검출 한계(레첸네 외 201614). a CVS: 도전 바이러스 긴장, 슬픈: 거리 앨라배마 더퍼린, PV: 파스퇴르 바이러스. b mL당 형광 초점 형성 유닛(FFU) 수. c 스트립에 증착된 형광 초점 형성 장치(FFU)의 수입니다.
| RIDT에서 수행 | ||||||||||
| 랩 1 | 랩 2 | 결합 | ||||||||
| 긍정적인 | 부정적인 | 총 | 긍정적인 | 부정적인 | 총 | 긍정적인 | 부정적인 | 총 | ||
| 바이러스 RNA 검출 | 긍정적인 | 18 | 1 | 19 | 26 | 0 | 32 | 44 | 7 | 51 |
| 부정적인 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 3 | 3 | |
| 총 | 18 | 1 | 19 | 26 | 0 | 35 | 44 | 10 | 54 | |
표 9: 실험실 조건(Lab 1)에 사용되는 애니젠 테스트 스트립에 RT-qPCR을 사용한 바이러스 RNA검출, 현장 조건에서 주변 온도(Lab 2) 또는14결합(Léchenne et al. 2016 14)에서).
보조 표 1: 표 7에 제시된 본질적인 매개변수의 판정을 위해 RIDT 테스트로 테스트된 162개의 샘플에 대한 설명입니다. 이 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).
Discussion
RIDT는 사후 광견병 진단을 위한 간단하고 빠르며 저렴한 방법이며 실험실 테스트에 대한 유망한 현장 대안입니다. 이러한 시험의 적용, 특히 저소득 및 중간 소득 국가의 분산 된 영역에 대한, 광견병 바이러스 보급 및 지역 및 잠재적으로 국가 규모의 전송의 이해를 향상시킬 것입니다. 빠른 뇌 샘플 수집 방법 (완전한 부검없이)과 결합될 때, 큰 장점은 실험실 시설에서 멀리 떨어진 필드 환경에서 테스트를 완전히 수행 할 수 있다는 것입니다. foramen 매그넘을 통해 수집 된 뇌 샘플은 테스트에 사용할 수 있으므로 동물 두개골을 완전히 열 필요가 없습니다. 이 테스트는 수행하고 해석하는 것이 간단하며 현장 감시활동(14)에특히 적합합니다. DFAT 또는 DRIT에 대한 RIDT의 다른 장점은 실온에서 양수 및 음수 제어 및 키트 저장이 필요하지 않습니다. 또한, PBS로 희석 단계(1:10)가 생략된 수정된 프로토콜은 테스트를 수행하기 위해 추가 시약을 필요로 하지 않으며 현장 조건 하에서 절차를 더욱 단순화한다.
핵심은 뇌 샘플의 품질입니다. 샘플은 의심되는 동물의 죽음 후 가능한 한 빨리 수집 및 테스트해야하며, 저하를 피하기 위해 테스트 하기 전에 시원한 온도에서 보관해야합니다. 분해된 샘플은 결과에 영향을 줄 수 있으므로 테스트해서는 안 됩니다(거짓 음수 결과의 위험). 뇌 샘플에 대한 시간이 지남에 따라 RIDT의 감도 손실에 관한 데이터는 아직 제공되지 않지만 DFAT 테스트32와비교하면 유사하다고 가설합니다. 그러나, 동물의 죽음과 시험을 수행하는 시간 사이 시간은 시험이 현장에서 신속하고 직접적으로 행해질 수 있기 때문에 감소될 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 분해된 견본의 더 낮은 리스크가 있습니다.
프로토콜 내에서 또 다른 중요한 단계는 샘플 서스펜션 마이그레이션입니다. 샘플(1-5분)을 입금한 후 마이그레이션이 시작됩니다. 따라서 서스펜션의 점도가 높므로 마이그레이션에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 드롭퍼로 장치 입금 사이트의 바닥을 부드럽게 긁고 1-2 방울을 더 추가하면 종종이 문제를 해결하고 마이그레이션이 즉시 시작됩니다.
아프리카 실험실에서 수행된 RIDT 시험의 대부분(차드, 코트디부아르 및 말리)은 30°C를 초과할 수 있는 주변 온도에서 수행되었으며, 제조자가 권장하는 저장 및 사용을 위한 온도 범위는 15°C-30°C이다. 우리는 RIDT 테스트 성능에 고온의 영향을 식별하지 않았지만, 더 신중하게 평가 할 필요가있다. 유사하게, 바이러스 RNA 검출 및 지노피핑에 사용 후 장치의 저장 및 운송 중에 고온의 충격은 추가적인 평가가 필요하다. RIDT 스트립으로부터 RT-qPCR에 의한 바이러스 RNA 검출의 감도는 처음에 시험에서 사용되는 뇌 샘플의 품질에 의해 영향을 받을 수 있지만, 또한 사용 후 RIDT 테스트의 저장 상태에 의해서영향을 받을 수 있다. 예를 들어, RIDT 시험을 사용할 때 RNA 검출의 감도가 더 높았으며, 통제된 실험실 조건(94.7%)에 저장되었다. 필드 조건(예: 차드) (81.2%)14. 이러한 조건은 또한 스트립에 고정된 RNA의 무결성(특히 길이)에 영향을 미칠 수 있으며, 더 긴 PCR 앰플리턴(예를 들어,)에 기초하여 피놀티핑에 대한 적당감(예를 들어,,gt;500 뉴클레오티드)14에영향을 미칠 수 있다. 테스트 스트립에서 수행된 RT-qPCR의 민감도는 FTA Whatman 카드(80.6%)를 사용하여 얻은 것보다 낮았다(80.6%)14. 다른 분자 기술과 마찬가지로, 바이러스 부하는 또한 낮은 바이러스 부하14를가진 견본을 위한 잠재적인 부정적인 결과와 RDIT 스트립에 근거를 둔 지평의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다.
시험은 일상적인 진단 및 질병 감시를 위해 WHO와 OIE에 의해 현재 추천되지 않으며, 결과는 PEP 의사 결정을 지도하기 위하여 그 자체로 사용될 수 없습니다. 추가 테스트 유효성 검사가 여전히 필요합니다. 그러나 정확한 빠른 광견병 진단은 지속적인 광견병 감시 시스템의 중요한 요소이며 성공적인 지속 가능한 광견병 제어33에매우 중요한 정치적 헌신을 높이는 데 중요한 역할을합니다. RIDT 테스트는 이러한 맥락에서 새로운 광견병 진단 기회를 제공하며 저소득 또는 중간 소득 enzootic 영역에서 동물 광견병 감시를 확장하는 유용한 도구입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 백신 및 예방 접종을 위한 글로벌 얼라이언스(GAVI), 울베르만 네겔리 재단, 스위스 아프리카 연구 협력(SARECO), SWF 스티퉁 퓌르 뷔르뷔르 뷔르뷔르 뷔르슈르 뷔르슈샤프트 포르충, 프레윌리지 아카데미슈 게셀샤프트(FAG) 바젤, 양자 과학 및 아시아 연구 재단을 위한 글로벌 얼라이언스를 통해 지원되었다.
우리는 특히 개 소유자, 수의학 인력 및 실험실 직원에게 큰 헌신을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 언어 편집에 대한 리사 크럼프를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed) | Bio-Rad, France | 3572112 | Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique. |
| Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, France | 4351104 | Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper | - | - | Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route). |
| Evans Blue Solution 1% | Bio-Rad, France | 3574911 | Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope. |
| Primer eGFPF1 | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'. |
| Primer eGFPR2 | Eurofins Genomics, Germany | - | Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'. |
| Primer Taq17 revlong | Eurofins Genomics, Germany | - | Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'. |
| Primer Taq3 long | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'. |
| Probe eGFP FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'. |
| Probe RABV4 FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'. |
| Probe RABV5 FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'. |
| Rapid Rabies Ag Test Kit | BioNote Inc., Republic of Korea | RG18-01DD | Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies. |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega, USA | N2515 | Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen, France | 11732-020 | Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, France | 15596026 | Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT. |
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