Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Расширенный диффузии изображений в гиппокампе крыс с мягкой травматического повреждения головного мозга

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/60012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Infinity lab, Medical Imaging and Signal Processing Group, Ghent University

Summary

Общая цель этой процедуры заключается в получении количественной микроструктурной информации гиппокампа у крысы с легкой черепно-мозговой травмой. Это делается с использованием передового диффузионного взвешенного протокола магнитно-резонансной томографии и анализа параметрических диффузионных карт.

Abstract

Легкая черепно-мозговая травма (mTBI) является наиболее распространенным типом приобретенных черепно-мозговой травмы. Поскольку пациенты с черепно-мозговой травмой демонстрируют огромную изменчивость и неоднородность (возраст, пол, тип травмы, другие возможные патологии и т.д.), модели животных играют ключевую роль в распутывании факторов, которые являются ограничениями в клинических исследованиях. Они обеспечивают стандартизированную и контролируемую обстановку для изучения биологических механизмов травми и ремонта после ТБИ. Однако не все модели животных эффективно имитируют диффузную и тонкую природу mTBI. Например, широко используемые контролируемые корковые воздействия (CCI) и боковой жидкости ударных травм (LFPI) модели используют краниотомии подвергать мозг и вызвать широкое координационного травмы, которые обычно не видели в mTBI. Таким образом, эти экспериментальные модели не являются действительными для имитации mTBI. Таким образом, соответствующая модель должна использоваться для исследования mTBI. Модель падения веса Marmarou для крыс причиняет подобные микроструктурные изменения и познавательные ухудшения как у пациентов которые выдерживают слабую травму; поэтому эта модель была выбрана для этого протокола. Обычные компьютерной томографии и магнитно-резонансной томографии (МРТ) обычно не показывают никаких повреждений после легкой травмы, потому что mTBI вызывает часто только тонкие и диффузные травмы. С диффузией взвешенных МРТ, можно исследовать микроструктурные свойства ткани мозга, которые могут обеспечить более глубокое понимание микроскопических изменений после легкой травмы. Таким образом, цель этого исследования заключается в получении количественной информации о выбранном регионе интересов (т.е. гиппокамп) для последующей прогрессии заболевания после получения легкой и диффузной черепно-мозговой травмы.

Introduction

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) получила больше внимания в последние годы, как стало ясно, что эти травмы головного мозга может привести к пожизненной когнитивных, физических, эмоциональных и социальных последствий1. Несмотря на это повышение осведомленности, мягкий TBI (mTBI, или сотрясение мозга) по-прежнему часто занижены и недиагностированы. MTBI был назван молчаливой эпидемии, и лица с историей mTBI показывают более высокие показатели злоупотребления психоактивными веществами или психических проблем2. Несколько пациентов с mTBI выходят на недиагностированные каждый год из-за диффузного и тонкого характера травм, которые часто не видны на обычной компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ). Отсутствие радиологических доказательств повреждения головного мозга привело к разработке более передовых методов визуализации,таких как диффузионная МРТ, которые более чувствительны к микроструктурным изменениям 3.

Диффузия МРТ позволяет in vivo отображение микроструктуры, и этотметод МРТ был широко использован в исследованиях TBI 4,5,6. От диффузии тензора, дробная анизотропия (FA) и средняя диффузорность (MD) вычисляются для количественной оценки изменений в микроструктурной организации после травмы. Недавние обзоры в mTBI пациентов сообщают об увеличении ВС и уменьшается в MD после травмы, которая может свидетельствовать о аксональной опухоль7. Противоположность, увеличения в MD и уменьшениях в FA также найдены и предложены для того чтобы underlie нарушения в parenchymalструктуре следуя за образованием отека, аксональной дегенерацией, или misalignment волокна/нарушением 8. Эти смешанные выводы могут быть частично объяснены значительной клинической неоднородностью mTBI, вызванной различными типами воздействия и тяжести (например, ускорение вращения, тупая травма силы, травма взрыва или комбинация первого). Однако в настоящее время нет четкого консенсуса в отношении лежащей в основе патологии и биологической/клеточной основы, лежащей в основе изменений в микроструктурной организации.

Модели животных обеспечивают стандартизированную и контролируемую настройку для более детального изучения биологических механизмов травми и ремонта после TBI. Несколько экспериментальных моделей для TBI были разработаны и представляют различные аспекты человека TBI (например, координационный против диффузной травмы или травмы, вызванные вращательных сил)9,10. Обычно используемые модели животных включают контролируемое воздействие корковой (CCI) и боковой жидкости ударных травм (LFPI) модели11,12. Хотя экспериментальные параметры могут быть хорошо контролируемыми, эти модели используют краниотомию для разоблачения мозга. Краниотомии или переломы черепа обычно не видели в mTBI; поэтому эти экспериментальные модели не являются действительными для имитации mTBI. Модель ускорения удара, разработанная Marmarou et al.13, использует вес, который сбрасывается с определенной высоты на голову крысы, которая защищена шлемом. Эта модель животных вызывает аналогичные микроструктурные изменения и когнитивные нарушения, как видно у пациентов, которые поддерживают легкую травму. Таким образом, это Marmarou падение веса модель подходит для исследования изображений биомаркеров для диффузных mTBI14,15.

Этот отчет демонстрирует применение передовой диффузии МРТ в модели крыс mTBI с использованием модели падения веса Marmarou. Первый показано, как вызвать легкую и диффузную травму, и анализ с использованием диффузии тензоризображения (DTI) модель затем предоставляется. Специфическая биологическая информация получена с использованием более продвинутых моделей диффузии (т.е., диффузионная визуализация куртоза (DKI) и модель целостности тракта белого вещества (WMTI). В частности, легкая травма наносится и микроструктурные изменения затем оцениваются в гиппокампе с помощью обычных T2-взвешенных МРТ и передовых диффузионной визуализации протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол был одобрен Комитетом по этике животных ВГентского университета (ECD 15/44Aanv), и все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Европейской комиссии (Directive 2010/63/EU).

1. Подготовка животных и шлем крепления

  1. Взвесить самку крысы Wistar H (возраст 250 г или 12 недель) и анестезируется в небольшой индукционной камере, наполненной смесью изофлюран (5%) и O2 в течение по крайней мере 1 мин.
  2. Введите крысу с 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно в шею, вернуть его в домашнюю клетку, и позволяют упреждающей анальгезии, по крайней мере 30 минут, чтобы принять эффект.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время 30 минут ждать, хирургическое место может быть подготовлено.
  3. Поместите грелку, хранящееся при 37 градусах Цельсия под хирургическим полем. Поместите стерилизованные хирургические инструменты на хирургическое поле, которое было продезинфицировано 70% этанола.
  4. Поместите крысу обратно в индукционную камеру и обезопажно крысы, пока он не реагирует на лапу или хвост щепотку.
  5. Поместите крысу на хирургическое поле и вставьте катетер в боковую хвостовую вену. Затем побрить голову крысы, удалить избыток меха и дезинфицировать кожу головы и остальную часть хирургической области с хлорогексидин.
  6. Вводят 100 л 2% лидокаина локально в кожу головы.
  7. Сделайте разрез средней линии с помощью скальпеля размер 11 подвергать череп, удаляя любые избыточные мембраны с небольшими ножницами. Утяните кожу с помощью глазного спектра с максимальным распространением 1 см.  Кроме того, удалить периостеум, осторожно протирая стерильный ватный тампон по всему черепу, пока периостеум больше не присутствует.
  8. Положите одну каплю клея ткани на череп и один на стерилизованный металлический диск (диаметр 10 мм и толщина 3 мм), который выступает в качестве шлема. Клей диск ажура примерно на треть до и на две трети позади брегмы. Дайте клею высохнуть в течение 1 мин.

2. Индукция черепно-мозговой травмы (ТБИ)

  1. Поместите крысу на специально сделанную кровать с пенным матрасом определенной весенней константы (см. ТаблицуМатериалов). Расположите крысу прямо под прозрачной пластиковой трубкой с весом 450 г с максимально горизонтальным шлемом. Отослать крысу от наркоза.
  2. Потяните вес до 1 м и отпустите, когда готовы. Убедитесь, что второй экспериментатор присутствует, чтобы переместить крысу от пластиковой трубки сразу после удара, чтобы предотвратить второе воздействие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивные раненые крысы получают ту же экспериментальную процедуру (шаги 1.1-2.7), за исключением шага 2.2.
  3. Повторно прикрепите крысу к анестезии и введите 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) через катетер, чтобы уменьшить гемодинамический шок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что крыса на короткое время перестает дышать из-за удара. Аккуратно сжимать грудную клетку, если крыса не спонтанно дышать после 2 с, чтобы поощрять дыхание рефлекс.
  4. Снимите шлем, аккуратно потянув его из черепа. Удалить оставшийся клей из черепа и кожи и закрыть разрез с хирургическим швом. Нанесите местный гель обезболивающий с помощью стерильного наконечника аппликатора.
  5. Поместите крысу на кровать Томсканера. Подтвердите правильное положение с помощью сканирования разведчика. Отрегулируйте поле зрения, чтобы можно было сделать изображение всей головы в одном положении кровати. Администрирование общего назначения, низкой дозы КТ, чтобы исключить переломы черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перелом черепа является критерием эвтаназии.
  6. Поместите крысу в чистую клетку на грелку (37 градусов по Цельсию). Следите за временем, чтобы прийти в сознание. После того, как крыса может сидеть в вертикальном положении, крыса может быть возвращена в домашнюю клетку.
  7. Вводят вторую дозу 0,05 мг/кг бупренорфин один день после индукции TBI.

3. Диффузионная магнитно-резонансная томография (МРТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузионно-взвешенная визуализация выполняется до и 1 дня после индукции травмы.

  1. Анестезия крысы в небольшой индукционной камере, наполненной смесью изофлуран (5%) и O2. Когда крыса не реагирует на лапу или хвост щепотку уменьшить анестезию до 2% с потоком скорость 500 мл/ мин. Перенесите животное на кровать сканера в лобовом положении.
  2. Расположите крысу в головном держателе с зубами бар и нос конус, обеспечивая анестезию, и слайд голову вперед, пока центр мозга находится на уровне центра четырехкратного объема МРТ катушки. Нанесите смазочную мазь на глаза в небольших количествах, чтобы предотвратить любое повреждение роговицы. Зафиксировать голову небольшим куском ленты, чтобы избежать движения во время сканирования.
  3. Поместите давление площадку под грудной клетки крысы для мониторинга дыхания и покрыть крысу с циркулирующим теплой водой нагрева одеяло и пузырь обернуть держать крысу теплой. Перед сканированием проверьте дыхательный монитор, чтобы убедиться, что сигнал чист без шума и что дыхательный цикл является последовательным. При необходимости переместите на панель давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания должна храниться между 1 дыханиена на 1200-1700 мс путем корректировки уровня анестезии между 1%-2%.
  4. Сдвиньте катушку объема четырехкраты над головой. Отрегулируйте настройку и соответствие конденсаторов катушки к надлежащей частоте и понавеству в соответствии с инструкциями, предоставленными поставщиком катушки. Предварительный сканер кровать в сканер родила, чтобы начать сканирование.
  5. Для обеспечения правильного позиционирования получите сканирование разведчика по умолчанию («трипилот»).
    1. Загрузите последовательность трипилота в управление сканированием, нажав на новое сканирование и выбрав последовательность трипилота из списка протоколов. Затем нажмите кнопку светофора, чтобы начать сканирование.
    2. Когда сканирование закончено, загрузите сканирование на дисплее изображения и убедитесь, что 1) голова лежит прямо и 2) мозг расположен в центре магнита и катушки. При необходимости отрегулируйте положение головы и/или кровати сканера и приобретите новое сканирование трипилота.
  6. Отрегулируйте локальное магнитное поле с помощью автоматизированного протокола shimming второго порядка: загрузите протокол shim второго порядка в Scan Control, как описано в шаге 3.5.1. Далее, нажмите на вкладку Acq Текущие корректировки Метод специфической регулировки для локальной однородности поля в окне инструмента управления спектрометра, чтобы начать автоматизированное shimming.
  7. Загрузите новую визуализацию T2 Rapid с перефокусированной последовательностью Echoes (RARE) в управление сканирования, описанное в шаге 3.5.1.
    1. Приобретите взвешенные изображения T2 с помощью параметров по умолчанию, за исключением следующих параметров:
    2. Откройте вкладку Edit Scan и отрегулируйте время повторения (TR) и время эхо (TE) до 5500 мс и 37 мс соответственно. Кроме того, изменить поле зрения и размер матрицы, чтобы обеспечить более высокое разрешение в плоскости 109 мкм х 109 мкм (по умолчанию резолюции 156 мкм х 156 мкм). Убедитесь, что толщина ломтика составляет 600 мкм, количество ломтиков установлено до 45, а фактор RARE установлен до 8.
    3. Откройте редактор Geometry и поместите пакет ломтик в правильном положении, включая bulbus мозга и мозжечка.
  8. Загрузите три новых новых эхо-планара диффузионно-взвешенной последовательности спин-эхо (DtiEpi) из папки B'DIFFUSION в протокол scan Control, как описано в шаге 3.5.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование трех различных диффузии "оболочки", диффузии тензор изображения (DTI) модель4,16, диффузии куртоза изображений (DKI) модель17, и белого вещества тракта целостности (WMTI) модель18 все могут быть оценены. Рекомендуется использовать по крайней мере три различных b-значения, с самым высоким b-значением, имеющим максимум 3000 с/мм2 с по крайней мере 15 равномерно расположенными направлениями на оболочку изображения17.
    1. Приобретайте взвешенные изображения диффузии (DW) с использованием параметров по умолчанию, помимо следующих настроек:
    2. Откройте вкладку Edit Scan и отрегулируйте геометрические параметры под вкладкой Geometry. Отрегулируйте поле зрения и размер матрицы до 105 x 105, чтобы обеспечить разрешение 333 мкм x 333 мкм.
    3. Установите ориентацию среза на осевую и количество ломтиков до 25, в результате чего толщина ломтика 500 мкм и межслойное расстояние 600 мкм. Изменить направление считываемого влево-вправо.
    4. Нажмите на вкладку Contrast, чтобы настроить время эхо до 24 мс и время повторения до 6250 мс.
    5. Установите пропускную способность до 250 000 Гц и включите подавление жира. Отрегулируйте количество средних до одного.
    6. Нажмите на вкладку Исследования и измените количество средних (сегментов EPI) до 4.
    7. Нажмите на вкладку Диффузии в исследовательской вкладке. Выполните этот шаг отдельно для каждой из трех оболочек диффузии.
      1. Отрегулируйте количество направлений диффузии до 32 для первой оболочки, 46 для второй оболочки и 64 для третьей оболочки.
      2. Отрегулируйте направления градиента с помощью пользовательских файлов направлений градиента.
      3. Измените количество изображений B0 на 5 для первой оболочки, 5 для второй оболочки и 7 для третьей оболочки.
      4. Отрегулируйте значение b в направлении до 800 с/мм2 для первого корпуса, 1500 с/мм2 для второго корпуса и 2000 с/мм2 для третьего корпуса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка градиентных направлений с помощью пользовательского файла градиентных направлений может быть выполнена вручную, установив направление Введите диффузию на да или автоматически с помощью макроса DTI-SET-DIRECTIONS.
    8. Откройте редактор Geometry и поместите поле зрения между луковицей и мозжечкой, содержащей только мозг, чтобы уменьшить время артефакта и сканирования. Позиция шесть полос насыщения 5 мм вне мозга, чтобы уменьшить артефакты, нажав на насыщенность и скольжения полос в предпочтительном положении с помощью прокрутки баров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Луковица и мозжечок могут быть определены на основе анатомических ориентиров и три изображения три пилота сканирования.
  9. Приобретайте импортированные последовательности, нажав на символ светофора. Используя параметры, описанные выше, время приобретения сканирования T2-RARE составляет 12 мин, из первой оболочки DWI 15 мин, второй оболочки DWI 21 мин и третьей оболочки 30 мин. Общее время приобретения составляет около 80 минут (на одном приемнике системы канала).
  10. По завершении протокола сканирования снимите животное со свяжеской кровати сканера и поместите животное в чистую клетку с грелкой при 37 градусах Цельсия. Верните животное в домашнюю клетку, когда оно придет в сознание.

4. Обработка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах, обработка диффузионных изображений описывается в MRtrix3, ExploreDTI19 и программное обеспечение Amide20, которые являются открытыми ящиками инструментов доступа. Тем не менее, предобработка шаги могут быть выполнены в других наборах инструментов (например, FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Передача полученных данных с консоли приобретения путем экспорта файла 2dseq.
  2. Преобразуйте файлы 2dseq (сырые dWI-файлы) в формат .mif, который является стандартным форматированием MRtrix3, чтобы обеспечить дальнейшие шаги предварительной обработки в MRtrix3. Кроме того, concatenate три диффузионных снарядов, используя следующие команды в оболочке:
    конвертировать-бруккер pdata/1/2dseq ratID-T2.mih (для T2-взвешенных изображений)
    конвертировать-бруккер pdata/1'2dseq ratID'dwi1.mih (для первой диффузионной оболочки)
    конвертировать-бруккер pdata/1'2dseq ratID'dwi2.mih (для второй диффузионной оболочки)
    конвертировать-бруккер pdata/1'2dseq ratID'dwi3.mih (для третьей диффузионной оболочки)
    mrcat ratID'dwi1.mif ratID-dwi2.mif ratID-dwi3.mif ratID-dwi.mif
  3. Выполните коррекцию шума и гиббса, звенящей коррекцию на DWIs в MRtrix321,22. Кроме того, конвертировать исправленные изображения DWI и изображение T2 в формат NIFTI с помощью следующих команд:
    dwidenoise ratID'dwi.mif ratID-dwi-denoised.mif
    mrdegibbs ratID'dwi-denoised.mif ratID-dwi-denoised-gr.mif
    mrconvert ratID'dwi-denoised-gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID-T2.mif ratID-T2.nii
  4. Выполните коррекцию для EPI, движения и текущих искажений В ExploreDTI:
    1. Преобразуйте изображения NIFTI в файл .mat, нажав на файл Calculate DTI.mat Преобразуйте исходные данные в файл DTI-.mat. Измените оценку тензора диффузии на взвешенную линейную и b-значение на NaN. Отрегулируйте размер вокселя до 0,333 0,333 0,6, количество не-DWI изображений до 17, количество изображений DWI до 142, и размер матрицы до 105 105 25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установив b-значение для NaN, ExploreDTI будет рассматривать набор данных как набор данных kurtosis.
    2. Нажмите на вкладку «Настройки», чтобы настроить настройки для коррекции EPI (она отключена по умолчанию). Выберите коррекцию SM/EC/EPI, также зарегистрируйтесь на другие данные? и нажмите на Да, чтобы сделать коррекцию EPI (нежесткий). Укажите суффикс анатомического изображения T2, соответствующего набору диффузионных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ExploreDTI корректирует искажения EPI, используя регистрацию изображений между неискаженным анатомическим изображением и диффузионным изображением.
    3. Нажмите на вкладку Плагинов и выберите Исправление для диспропорций и искажений EC/EPI и выберите предварительно обработанный файл данных диффузии с шага 2.3. Убедитесь, что изображение T2 находится в той же папке и имеет ту же базу, что и имя файла диффузии (например, rat1.nii для DWI и rat1'T2.nii для анатомического изображения). Этот шаг будет генерировать файл «родной» («родной.mat») и «преобразованный» файл (зtrafo.mat).
  5. Рассчитайте метрики DTI для каждой крысы, нажав на Плагины и экспортные вещи на q.nii и выбрав параметрические карты модели DTI: дробная анизотропия (FA), означает диффусивность (MD), радиальная диффузорность (RD) и осная диффусивность (AD; обозначается как "крупнейший eigenvalue L1").
  6. Кроме того, экспортировать параметрические карты для модели куртоза (MK, AK, и РК) и Модели WMTI (AWF, AxEAD, RadEAD и TORT). Обработка диффузионных изображений приведет к повозможности 12 параметрических карт(рисунок 1, рисунок 2, рисунок3), которые могут быть использованы для дальнейшего микроструктурного анализа.
  7. Создайте файл маски для гиппокампа каждой крысы с помощью MRtrix3.
    1. Загрузите изображение FA крысы в MRtrix зрителя, нажав инструмент и ROI редактор.
    2. Создайте новую рентабельность инвестиций, нажав кнопку«Кью» и нажмите на edit, чтобы нарисовать рентабельность инвестиций на каждом срезе, который включает гиппокамп (рисунок4). Чтобы стереть нежелательные области из нарисованной рентабельности инвестиций, нажмите кнопку «Правая мышь».
    3. Когда рисунок roI будет завершен, сохраните изображение маски, нажав кнопку Сохранить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл маски будет двоичным файлом изображения NIFTI с вокселями значения 1, содержащими ткани гиппокампа, а остальные воксели будут иметь значения 0. Для стандартизации области гиппокампа между крысами, параметрические карты могут быть зарегистрированы с исследованием конкретного шаблона с предопределенными регионами, представляющими интерес очертил23 или атлас мозга крысы.
  8. Для извлечения диффузионных показателей гиппокампа крысы используйте созданный файл маски шага 4.6 и откройте программное обеспечение Amide.
    1. Откройте параметрические карты и маску изображение крысы.
    2. Чтобы добавить roI файла маски в Amide, выберите изображение файла маски, щелкните Edit Добавить рентабельность инвестиций 3D Isocontour и нажмите на рентабельность инвестиций, отображаемый на изображении маски. Дайте ROI значимое имя и подтвердите, что этот том должен содержать только воксели, имеющие значение одного.
    3. Чтобы вычислить средние значения показателей диффузии в гиппокампе, нажмите Инструменты Рассчитайте статистику рентабельности инвестиций и укажите изображения и рентабельность инвестиций, которые должны быть включены. После нажатия Execute,другой экран появится с вычисленных значений, которые могут быть использованы для дальнейшего статистического анализа. Этот файл может быть сохранен или скопирован в предпочтительный формат данных (например, .xlsx или .csv файл).

5. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах мы описываем обработку диффузионных изображений в SPSS Statistics 24; однако статистический анализ может быть выполнен в других статистических наборах инструментов.

  1. Загрузите данные в широком формате в файле SPSS s.sav.
  2. Чтобы проверить статистические различия между двумя группами для каждой временной точки (т.е. базового или 1-дневного после травмы), нажмите «Анализ» Непараметрические тесты Наследие Диалоги 2 Независимые тесты образцов. Загрузите переменные, которые необходимо протестировать, и укажите группы (нат., TBI и фиктивные группы). Укажите Манн-Уитни U в качестве типа теста.
  3. Для проверки статистических различий между 2 точками времени в каждой группе файл данных должен быть разделен. Перейти к данным, сплит файл и указать Сравнить группы. Далее нажмите на Анализ, Nonparametric тесты, Наследие Диалоги, 2 связанных образцов испытаний, загрузить переменные, которые необходимо сравнить и указать Wilcoxon как тип теста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исправить для нескольких сравнений, p-значения корректируются для каждой модели диффузии с использованием коррекции Bonferroni (т.е. p-значение, разделенное на количество сравниваемых параметров (DTI 4, DKI 3 и WMTI 4) . В частности, р-эт/0,0125 считается значимым для моделей DTI и WMTI, а р-эт-н-00 считается значимым для модели DKI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В исследовании, все TBI крыс (n No 10) выжили воздействия и смогли оправиться от удара и анестезии в течение 15 минут после отрыва от анестезии23. На КТ изображения, не было никаких доказательств переломов черепа и T2 изображения не показывают каких-либо отклонений, таких как кровотечение, увеличенные желудочки, или образование отеков в месте ушиба 1 день после травмы (Рисунок 5). Таким образом, на основе этих визуальных осмотров анатомических изображений, большие очаговые повреждения не были обнаружены, подтверждающие диффузный и мягкий характер травмы.

Качество корегистрации (нежесткий) шаг между t2 изображения и диффузии набор данных (шаг 4.4) был рассмотрен путем добавления наложения изображения T2 на цветокодированной карте FA (Рисунок 6). Затем были рассчитаны параметрические карты FA, MD, AD и RD(рисунок1) и загружены в программное обеспечение Amide. На основе карты FA была нарисована рентабельность инвестиций, включающая гиппокампа(рисунок 4). Статистические значения показателей диффузии были рассчитаны в среднем по всем вокселям в пределах интересуемого региона, а средние значения каждой метрики DTI экспортировались для дальнейшего анализа. Еще одна проверка качества диффузионных данных может быть выполнена путем проверки выбросов в метриках DTI. Например, значения FA в гиппокампе должны быть около 0,15; Таким образом, значения злт;0.10 (отозначающее изотропную диффузию) или 0,30 (значения видны в белом веществе) могут рассматриваться как биологически неправдоподобные значения. Эти точки данных должны быть отклонены от дальнейшего анализа. Кроме того, были рассчитаны средние значения для АК, РК и МК модели диффузионного куртоза, а также AWF, AxEAD, RadEAD и TORT модели WMTI(рисунок 2, рисунок 3).

В нашем исследовании, анализ метрик DTI показал значительное увеличение значений FA (стр 0,007), и снижение значений диффузии (MD и RD) (р 0,007 и стр 0,007, соответственно) после воздействия в группе mTBI(рисунок 7). Эти сокращения в RD и MD значительно отличались от фиктивной группы (р 0,005 и стр. 0,004, соответственно). Диффузия kurtosis метрики показали значительное снижение РК (р 0,005) после воздействия, но никаких изменений в АК или МК(Рисунок 8). Используя модель WMTI, RadEAD (р 0,007) и TORT (р 0,007) показали значительное снижение и увеличение, соответственно, в группе mTBI 1 день после удара(рисунок 9C, D). Значения в фиктивной группе не показали каких-либо существенных изменений.

Figure 1
Рисунок 1: Репретритальные параметрические карты дробной анизотропии (FA), означает диффусивность (MD), осевая диффусивность (AD) и радиальная диффусивность (РД). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представительные параметрические карты для среднего куртоза (МК), осевого куртоза (АК) и радиального куртоза (РК). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные параметрические карты для фракции аксональной воды (AWF), осевой и радиальной дополнительной аксональной диффузии (AxEAD, RadEAD) и тортуозности (TORT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Создание маски в MRtrix3. Рентабельность инвестиций нарисована вокруг гиппокампа на всех ломтиках, содержащих объем гиппокампа, и объем сохраняется в виде файла маски. Это может быть сделано для каждой крысы по отдельности или с помощью конкретного файла маски шаблона исследования, к которому каждая из параметрических карт может быть созарегистрирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: КТ и T2 взвешенные изображения репрезентативного животного mTBI 1 день после удара. На изображениях КТ (верхний ряд) не показаны переломы черепа. На T2-взвешенных изображениях (нижний ряд) не было продемонстрировано кровотечения, увеличенные желудочки или образование отеков. Следует отметить, образование отеков хорошо видно, как гиперинтенсивной области вокруг области раны от хирургического вмешательства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Цвет закодированная карта FA диффузионных данных, наложенных анатомическим изображением после коррекции для EPI, движения и текущей коррекции Эдди в ExploreDTI. Показана плохая коррекция и сорегистрация слева и хорошие примеры справа. Следует обеспечить правильное кодирование цвета: лево-правое направление в красном (например, корпус каллосума), передне-зародёрное направление в зеленом и низкое- высшее направление в синем (например, цингулум). Кроме того, закодированное изображение FA должно быть идеально выровнено с анатомическим изображением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Изменения в диффузии тензор метрик гиппокампа для обмана (n No 10) и mTBI животных (n No 10). После воздействия, было значительное увеличение FA (A) и значительное снижение средней диффузии (B) и радиальной диффузии (D) в mTBI животных (B, D). Существенных различий в диффузииосевой (C) у крыс mTBI не наблюдалось. Фиктивные животные не показали каких-либо значительных изменений DTI (P qlt; 0.0125). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Изменения в диффузии kurtosis метрик гиппокампа для обмана (n No 10) и mTBI животных (n No 10). После воздействия, было значительное снижение РК (C) животных mTBI, но никаких изменений в АК (B) или МК (A). Фиктивные животные не показали никаких изменений (p qlt; 0.0166). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Изменения в метрике целостности участка белого вещества гиппокампа для обмана (n No 10) и mTBI животных (n No 10). После воздействия, было значительное снижение RadEAD (C) и значительное увеличение TORT (D) животных mTBI, но никаких изменений в AWF или AxEAD (A,B). Фиктивные животные не показали никаких изменений (p qlt; 0.0125). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку mTBI часто является результатом диффузной и тонкой травмы, которая не показывает никаких отклонений на КТ и обычных МРТ, оценка микроструктурных повреждений после легкой травмы остается проблемой. Поэтому, более передовые методы визуализации необходимы для визуализации в полной мере травмы. Применение диффузии магнитно-резонансной томографии в исследованиях TBI приобрело больший интерес втечение последнего десятилетия, где диффузионная тензорная томография чаще всего используется 5. Ограничением модели DTI является предположение о процессе диффузии Гауссиана, который не является точным предположением для микроструктуры мозга (состоящей из сложной сети аксонов и клеток с мембранами, выступающими в качестве барьеров), в результате чего показатели DTI не являются специфическими для базовая биологическая микроструктура24. Диффузия куртоз изображения является продолжением модели DTI и попытки охарактеризовать степень негаусовской диффузии17. Это может предоставить дополнительную информацию о неоднородности тканей или сложности.

Хотя, недостаток моделей DTI и DKI является то, что они являются лишь представлением диффузионного сигнала, который характеризует вероятностный профиль смещения воды, но не специфичен для микроструктуры6. С другой стороны, модель целостности тракта белого вещества, основанная на куртоза тензоре, представляет собой микроструктурную методику картирования, которая включает априори биологическую информацию (предположения) в модель18. Он приписывает диффузионный сигнал к отсекам ткани и может оценить биологические атрибуты более непосредственно. Эти биофизические модели могут таким образом предложить новую информацию для описания аномалий после mTBI и преодолеть этот вопрос неспецифическости6. Используя эти три различные модели, микроструктурные изменения и биологические процессы смогли быть визуализированы после mTBI более подробно, в частности, с помощью модели падения веса Marmarou.

Модель падения веса Marmarou проста в использовании и требует лишь незначительной операции; однако, второму экспериментатору рекомендуется отодвинуть крысу от стеклянной трубки сразу после первого удара, чтобы избежать второго. Кроме того, иногда требуется, чтобы помочь крысе восстановить дыхательный рефлекс после удара. Довольно длинный протокол МРТ, с общим временем приобретения около 80 мин, хорошо переносится как обман и mTBI крыс. Хотя, во время сканирования, важно контролировать цикл дыхания и настроить анестезию, если животное спит слишком глубоко или легко. Важно также, чтобы животное тепло как во время, так и после приобретения, пока крыса полностью проснулся, чтобы избежать переохлаждения.

В передовых мрт диффузии, движения артефактов следует избегать как можно больше. Простое решение для уменьшения движения во время сканирования, чтобы использовать зубы бар и зафиксировать голову с небольшой кусок ленты или два уха баров, если таковой имеется. Это гарантирует, что голова не будет двигаться вверх и вниз каждый раз, когда крыса делает вдох.

Используя передовые протоколы мРТ диффузии, приобретенные изображения должны пройти через несколько (до) этапов обработки, в основном с использованием различных программных средств, прежде чем они могут быть использованы для дальнейшего анализа. Недостатком использования различных программных средств для обработки взвешенных изображений, взвешенных по диффузии, является то, что (часто) каждый инструмент использует свой собственный формат данных для кодирования таблицы градиентных направлений. MRtrix3 хранит информацию о градиенте вместе с взвешенным изображением диффузии в файле .mif, в то время как ExploreDTI использует отдельный файл (B-матрица) для хранения направлений градиента. Поэтому важно проверить, правильно ли переносятся градиентные направления с MRtrix3 на ExploreDTI. Это можно сделать, проверяя, что цветкодирование правильно на цвете закодированных изображений FA (т.е. лево-правое направление в красном (например, корпус мозолии), передне-заднего направления в зеленом, и ниже высшего направления в синем (например, cingulum)) . Цвет закодированные изображения FA также могут быть использованы для проверки качества нежесткого процесса совместной регистрации между диффузионно-взвешенными изображениями и структурными T2- взвешенными изображениями.

С помощью ExploreDTI параметрические карты были извлечены с использованием моделей DTI, DKI и WMTI. Модель DTI предоставила параметрические карты для MD, AD, RD и FA, в то время как модель DKI предоставляет параметрические карты для МК, АК и РК. Хотя были рассчитаны четыре метрики модели WMTI (т.е. AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), в рамках ExploreDTI не удалось извлечь внутриаксональную диффузию (IAD). IAD можно получить с помощью инструмента MATLAB, предоставленного разработчиками модели WMTI25. Для этого взвешенные изображения и информация о градиентах должны быть вновь переданы из ExploreDTI в Matlab. Этот шаг снова подвержен ошибкам, касающимся кодирования информации о градиентах. Кроме того, параметры kurtosis tensor и WMTI должны быть оценены и рассчитаны заново.

Предварительная обработка полученных изображений, оценка тензоров и расчет параметрических карт требуют длительного периода вычислительного времени. Коррекция для EPI, движения и затмили тока, требуемые 40 минут на данные, установленные на сервере с восемью ядрами и 16 ГБ оперативной памяти. Используя анализ рентабельности инвестиций, средние значения в гиппокампе были рассчитаны до и 1 день после удара. Изменения в метриках DTI, DKI и WMTI были затем количественно определены в группе mTBI. Однако в метриках DKI и AWF модели WMTI наблюдалась большая межпредметная изменчивость, что привело к неожиданной разнице в базовых значениях между группами фиктивных и mTBI. Это, скорее всего, результат вокселей, содержащих биологически неправдоподобные значения (выбросы) в исследуемом регионе и могут быть отфильтрованы в будущих исследованиях до расчета средних значений в Амиде.

В заключение, этот протокол демонстрирует осуществимость передовых мрт диффузии для исследования и количественной микроструктурных изменений в гиппокампе в крысиной модели mTBI. Используя три различные модели диффузии, можно получить дополнительную информацию о лежащих в основе биологических процессах, которые способствуют условиям после mTBI. Это представляет собой шаг вперед в разработке биомаркеров для mTBI, которые могут быть достаточно чувствительными для выявления конкретных микроструктурных изменений на ранней стадии после легкого воздействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Исследовательский фонд - Фландрии (FWO) за поддержку этой работы (Грант номер: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, L. J., et al. Systematic Review of the Prognosis After Mild Traumatic Brain Injury in Adults. Cognitive, Psychiatric, and Mortality Outcomes: Results of the International Collaboration on Mild Traumatic Brain Injury Prognosis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (3), S152-S173 (2014).
  2. Buck, P. W. Mild Traumatic Brain Injury: A Silent Epidemic in Our Practices. Health & Social Work. 36 (4), 299-302 (2011).
  3. Bodanapally, U. K., Sours, C., Zhuo, J., Shanmuganathan, K. Imaging of Traumatic Brain Injury. Radiologic Clinics of North America. 53 (4), 695-715 (2015).
  4. Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. MR diffusion tensor spectroscopy and imaging. Biophysical Journal. 66 (1), 259-267 (1994).
  5. Hulkower, M. B., Poliak, D. B., Rosenbaum, S. B., Zimmerman, M. E., Lipton, M. L. A Decade of DTI in Traumatic Brain Injury: 10 Years and 100 Articles Later. American Journal of Neuroradiology. 34 (11), 2064-2074 (2013).
  6. Hutchinson, E. B., Schwerin, S. C., Avram, A. V., Juliano, S. L., Pierpaoli, C. Diffusion MRI and the detection of alterations following traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 612-625 (2018).
  7. Wallace, E. J., Mathias, J. L., Ward, L. Diffusion tensor imaging changes following mild, moderate and severe adult traumatic brain injury: a meta-analysis. Brain Imaging and Behavior. , 1-15 (2018).
  8. Rutgers, D. R., et al. White Matter Abnormalities in Mild Traumatic Brain Injury: A Diffusion Tensor Imaging Study. American Journal of Neuroradiology. 29 (3), 514-519 (2008).
  9. Bondi, C. O., et al. Found in translation: Understanding the biology and behavior of experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 58, 123-146 (2015).
  10. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  11. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7 (AUG), (2016).
  12. Lyeth, B. G. Historical Review of the Fluid-Percussion TBI Model. Frontiers in Neurology. 7 (DEC), 1-7 (2016).
  13. Marmarou, A., Foda, M. A. A. -E., van den Brink, W., Campbell, J., Kita, H., Demetriadou, K. A new model of diffuse brain injury in rats. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  14. Heim, L. R., et al. The Invisibility of Mild Traumatic Brain Injury: Impaired Cognitive Performance as a Silent Symptom. Journal of Neurotrauma. 34 (17), 2518-2528 (2017).
  15. Zohar, O., Rubovitch, V., Milman, A., Schreiber, S., Pick, C. G. Behavioral consequences of minimal traumatic brain injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars. 71 (1), 36-45 (2011).
  16. Pierpaoli, C., Basser, P. J. Toward a quantitative assessment of diffusion anisotropy. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 36 (6), 893-906 (1996).
  17. Jensen, J. H., Helpern, J. A. MRI quantification of non-Gaussian water diffusion by kurtosis analysis. NMR in Biomedicine. 23 (7), 698-710 (2010).
  18. Fieremans, E., Jens, H., Jensen, J. A. H. White matter characterization with diffusional kurtosis imaging. NeuroImage. 58, 177-188 (2011).
  19. Leemans, A. Explore DTI. , (2019).
  20. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
  21. Veraart, J., et al. Denoising of diffusion MRI using random matrix theory. NeuroImage. 142, 394-406 (2016).
  22. Veraart, J., Fieremans, E., Novikov, D. S. Diffusion MRI noise mapping using random matrix theory. Magnetic Resonance in Medicine. 76 (5), 1582-1593 (2016).
  23. Braeckman, K., et al. Dynamic changes in hippocampal diffusion and kurtosis metrics following experimental mTBI correlate with glial reactivity. NeuroImage: Clinical. 21 (August 2018), 101669 (2019).
  24. Jones, D. K., Knösche, T. R., Turner, R. White matter integrity, fiber count, and other fallacies: The do's and don'ts of diffusion MRI. NeuroImage. 73, 239-254 (2013).
  25. Matlab code DKI and WMTI model. , Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).

Tags

Неврология Выпуск 150 черепно-мозговая травма агнетическая резонансная томография диффузионная тензорная томография доклиническая крыса гиппокамп
Расширенный диффузии изображений в гиппокампе крыс с мягкой травматического повреждения головного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braeckman, K., Descamps, B.,… More

Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter