Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.
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Artigo de método
Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Macrófagos representam as populações de células imunes mais heterogêneas e abundantes no coração e são centrais na condução de inflamação e respostas reparadoras após lesão cardíaca. Como vários subconjuntos de macrófagos orquestram as respostas imunes após lesão cardíaca é uma área ativa de pesquisa. Apresentado aqui é um protocolo simples que nosso laboratório executa rotineiramente, para a extração de macrófagos de espécimes de miocánio humano e camundongos obtidos de indivíduos saudáveis e doentes. Resumidamente, este protocolo envolve digestão enzimática de tecido cardíaco para gerar uma única suspensão celular, seguido de coloração de anticorpos e citometria de fluxo. Esta técnica é adequada para ensaios funcionais realizados em células classificadas, bem como sequenciamento de RNA em massa e célula única. Uma grande vantagem deste protocolo é a sua simplicidade, variação mínima do dia a dia e ampla aplicabilidade que permite a investigação da heterogeneidade do macrófago em vários modelos de camundongos e entidades de doenças humanas.
Introdução
Os macrófagos representam o tipo de célula imune mais abundante no coração, e desempenham papéis significativos na geração de respostas inflamatórias e reparadoras robustas após lesão cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nosso grupo identificou dois grandes subconjuntos de macrófagos no coração de urina derivados de origens distintas do desenvolvimento5,6. Em termos gerais, populações distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes em tecidos podem ser identificadas com base ....
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Protocolo
O protocolo apresentado foi aprovado pela Washington University em St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos os sujeitos fornecem consentimento informado antes da coleta de amostras e os experimentos são realizados de acordo com o protocolo de estudo aprovado. O protocolo apresentado é realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee da Washington University School of Medicine e segue as diretrizes descritas no Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação de espécimes de tecido cardíaco humano
- Nivele corações explantados por cânulando a ostia da artéria coronária esq....
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Resultados
O protocolo descrito permite o isolamento de macrófagos do mouse e do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com uma estratégia diferente de coloração e marcha, as células estromais também podem ser colhidas do miocánio humano. Os resultados da FACS aqui apresentados foram adquiridos na plataforma BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Os controles de compensação foram gerados a partir de amostras de controle de cores únicas de splenocytes manchados. A Figura 1
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Discussão
O protocolo permite a extração de vários subconjuntos de macrófagos do miocátrio humano. O protocolo é simples e leva de 3 a 4 horas para preparar a suspensão de célula única pronta para a análise facs. Embora o protocolo seja relativamente simples de executar, há certos aspectos técnicos que precisam ser considerados que minimizarão a variabilidade. Em primeiro lugar, trabalhar em tempo hábil com o tecido humano é necessário para a viabilidade celular ideal. É importante manter o tecido em saline frio / HBSS para minimi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este projeto foi possível graças ao financiamento fornecido pelo Children's Discovery Institute da Universidade de Washington e pelo St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Fundação do Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e pelo NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. é apoiado pelo NIH K08 HL123519 e burroughs Welcome Fund (1014782).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Conocal de 15 mL | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µ m Filtros de Células | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Tubos Cônicos | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Tampão de Lise | Gibco | A10492-01 | |
| Albumina de Soro | Bovino Sigma | A2058 | |
| Colagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0,5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Tampão | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Tampão | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0,5 M) | ||
| Fetal Soro Bovino | Gibco | A3840201 | |
| Fórceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostáticos | VWR | 63042-052 | |
| Hialuronidase tipo 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Placas de Petri | Thermo Fisher | ||
| barbear | VWR | 55411-050 | |
| Tesoura | VWR | 82027-578 |
Referências
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electr....
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Reimpressões e permissões
