Aqui nós apresentamos um protocolo mecânico da dissociação para isolar ràpida macrófagos do gânglio dorsal da raiz para o fenotipagem e a análise funcional.
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Artigo de método
Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há interesses crescentes para estudar as interações moleculares e celulares entre as células imunes e os neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal após lesão do nervo periférico. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos, são conhecidas por responder a uma lesão tecidual por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. A evidência emergente implicou a contribuição de macrófagos dorsais do gânglio da raiz ao desenvolvimento neuropática da dor e ao reparo axonal no contexto de ferimento do nervo. Rapidamente fenotipagem (ou "isolação rápida de") a resposta de macrófagos dorsais do gânglio da raiz no contexto da lesão de nervo é desejada identificar os fatores neuroimune desconhecidos. Aqui nós demonstramos como nosso laboratório isola ràpida e eficazmente macrófagos dos gânglios da raiz dorsal usando um protocolo mecânico enzima-livre da dissociação. As amostras são mantidas no gelo por toda parte para limitar o stress celular. Este protocolo é muito menos demorado comparado ao protocolo enzimático padrão e foi usado rotineiramente para nossa análise fluorescência-ativada da classificação de pilha.
Introdução
Há agora uma evidência considerável que as pilhas imunes contribuem à dor neuropática que segue a lesão periférica do nervo1,2. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos maduros, são conhecidas por responder a lesões teciduais e infecção sistêmica por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. Paralelamente à ativação de microglia induzida por lesão nervosa no Corno dorsal espinhal, os macrófagos nos gânglios da raiz dorsal (DRG) também se expandem significativamente após a lesão nervosa3,4. Notavelmente, háinteresses crescentes para determinar se os macrófagos contribuem para o desenvolvimento da dor neuropática após lesão nervosa periférica, interagindo com neurônios sensoriais no DRG5,6,7, 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11. Além disso, estudos recentes também implicam a contribuição dos macrófagos DRG no reparo axonal após lesão nervosa12,13. Outro estudo sugere ainda que as subpopulações de macrófago (i.e., CD11b+Ly6CHi e CD11b+Ly6CLow/- Cells) podem desempenhar um papel diferente na hipersensibilidade mecânica14. Conseqüentemente, ràpida fenotipagem a resposta de macrófagos de DRG no contexto da lesão do nervo pode ajudar-nos a identificar os fatores neuroimune que contribuem à dor neuropática.
Convencionalmente, o protocolo para isolar macrófagos no DRG envolve múltiplas etapas, incluindo a digestão enzimática15,16. A técnica é muitas vezes demorada e pode ser dispendiosa para experimentos em grande escala. Embora a digestão suave com colagenase tipo II (4 mg/ml) e Dispase tipo II (4,7 mg/ml) por 20 min foi recomendado anteriormente15, é concebível que as células após a exposição a esta enzima são propensos a danos celulares ou morte celular, o que pode levar a baixa Rendimento. Além disso, a diferença na qualidade das enzimas de lote para lote pode impactar ainda mais a eficiência deste processo. Mais importante, os macrófagos expostos à digestão enzimática podem ser estimulados involuntàvelmente e, portanto, podem ser muito diferentes do status in vivo. As alterações podem potencialmente complicar o desfecho do estudo funcional.
Aqui nós descrevemos um protocolo enzima-livre para isolar ràpida macrófagos de DRG em 4 ° c usando a dissociação mecânica. As amostras são mantidas no gelo para limitar o stress celular. Como resultado, nossa abordagem oferece uma vantagem para manter a consistência do isolamento, e as células isoladas são presumivelmente mais saudáveis e menos estimuladas. Nós apresentamos mais a evidência para validar a qualidade das pilhas isoladas com análise fluorescência-ativada do Cell Sorting (FACS).
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da Califórnia em São Francisco e foram conduzidos de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. colete DRG lombar de camundongos experimentais
- Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio de gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) misturando 9 volumes do meio com 1 volume de CA+ +/mg+ +-Free 10x HBSS. Mantenha-o no gelo.
- Anestesie o rato com 2,5% Avertin. Confirme que o animal está totalmente anestesiado pela falta de resposta à pinça da pata traseira.
Nota: foram utilizados ratos machos e fêmeas com idades compreendidas entre 6-8 semanas. - Perfuse o rato transcardially com 10 mL de PBS pre-refrigerado 1x.
- Coloc o rato na posição supina com as quatro patas fixadas com a fita dentro de uma capa química das emanações. Levante a pele abaixo da caixa torácica pelo fórceps, e faça uma pequena incisão com tesouras cirúrgicas para expor o fígado e o diafragma.
- Continue a usar tesouras para cortar o diafragma e a caixa torácica, abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.
- Corte rapidamente o Apêndice Atrial direito com tesouras da íris. Uma vez que o sangramento é observado, insira uma agulha de 30 G na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mL de PBS pré-refrigerado 1x para perfuse o animal.
- Realize laminectomia dorsal15 no rato colocado na posição prona.
Nota: se a cultura da célula for planejada, pulverize o mouse com 70% de etanol antes da incisão e use instrumentos cirúrgicos pré-esterilizados para dissecção.- Use um bisturi de tamanho 11 para fazer uma incisões profundas laterais longitudinais a partir da região torácica até a região sacral. Retire a pele pela tesoura para expor a camada dorsal do músculo.
- Use Friedman-Pearson Rongeur para descascar fora os tecidos e os músculos conexivos até que os processos Lumbosacral da espinha e os processos transversais bilaterais estejam expostos.
- Use uma mola de Noyes Scissor para abrir com cuidado a coluna espinal dorsal, a seguir mude a um Friedman-Pearson Rongeur para remover os ossos vertebrais para expor a medula espinal com os nervos espinais intactos Unidos.
- Cuidadosamente dissecado DRG lombar ipsilateral e contralateral (L4/L5 DRG em nosso estudo) e colocá-lo em 1 mL de CA+ +/mg+ +-livre de gelo-1x HBSS em um homogeneizador de tecido dounce. Agora os tecidos estão prontos para o passo 2.
Nota: aparar o nervo espinhal anexado ao DRG, se possível.
2. isolar células individuais do mouse lombar DRG
- Homogeneizar o tecido DRG com um pilão solto no homogeneizador dounce 20-25 vezes.
- Coloque um filtro de célula de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL. Molhe o filtro da pilha com 800 μL do gelo-frio 1x HBSS, e o fluxo-através é coletado no tubo cônico.
- Colete a suspensão do tecido homogeneizado do homogeneizador usando uma pipeta e passe pelo filtro de células de nylon molhado de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL.
- Enxague o homogeneizador duas vezes com 800 μL de gelo-frio 1x HBSS e, em seguida, decantar no mesmo tubo cônico 50 mL com filtro de células para aumentar o rendimento.
- Adicionar 1,5 mL de meio de gradiente de densidade isotónica gelado equilibrado (preparado no passo 1,1) num tubo de poliestireno FACS estéril de 5 mL.
- Transfira o homogeneizar da pilha do tubo cônico de 50 mL (na etapa 2,4) no tubo de FACS, misture bem com o meio do inclinação da densidade pipetando acima e para baixo. Adicione um adicional de 500 μL de 1x HBSS para selar a parte superior.
- Pellet as células por centrifugação em 800 x g por 20 min a 4 ° c.
- Aspirar com cuidado o sobrenadante que contem o mielina no meio sem perturbar a pelota da pilha na parte inferior do tubo de FACS.
- Ressuscitem as células no tampão PBS ou FACS contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) para análise de FACS.
Nota: pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um rato.- Ressuscitem as células DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) em 100 μL de PBS contendo 5% de soro bovino fetal e, em seguida, incubar com anticorpo α-mouse CX3CR1-APC (1:2000) no escuro a 4 ° c por 1 h.
- Lave as células com 5 mL de PBS uma vez; Centrifugar as células 360 x g durante 8 min a 4 ° c.
- Aspirar o sobrenadante, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 300 μL de PBS para análise de FCAS. Se a classificação de célula é planejada, resuspender as células no buffer FACS em vez disso.
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Resultados
Para validar as células isoladas, primeiro escolhemos os camundongos transgênicos de apoptose induzida por macrófago (MAFIA)17. Esta linha expressa um fármaco-inducible FK506-Binding proteína (FKBP)-FAS suicídio gene de fusão e proteína verde fluorescente (eGFP) o controle do promotor do receptor CSF1 (CSF1R), que é especificamente expressa em ambos os macrófagos e microglia. A injeção sistemática do dimerizer da proteína de ligação de FK, AP20187 (AP), induz o apoptose das pilhas que expressam o ...
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Discussão
Aqui nós introduzimos um método novo para enriquecer eficazmente macrófagos isolados do rato DRG. A abordagem convencional para isolar as células imunes do DRG requer digestão enzimática15,16, queagora é substituída por homogeneização mecânica em nosso protocolo para limitar os danos celulares indesejados e aumentar o rendimento. Portanto, o novo protocolo é muito menos demorado. Mais importante, a digestão da enzima pode estimular os macrófagos e alterar a assin...
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes relacionados a este manuscrito.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado por: Fundação para a educação e pesquisa em anestesia (XY); o departamento de anestesia e assistência perioperatória (XY) da UCSF; e 1R01NS100801-01 (GZ). Este estudo foi apoiado em parte pelo laboratório HDFCCC para a análise de células recurso compartilhado recursos através de uma subvenção da NIH (P30CA082103).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-camundongo CX3CR1-APC anticorpo | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Filtro de células (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Homogeneizador de tecidos Dounce | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| Tubos FACS (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca ++ / Mg ++-livre) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Iodeto de propídio | Sigma | Pág. 4864-10ml |
Referências
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