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Artigo de método

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

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DOI:

10.3791/60028

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10 de agosto de 2019

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

Resumo

As gravações neurais multiregionais podem fornecer informações cruciais para compreender as interações de escala de tempo fino entre várias regiões cerebrais. Entretanto, os projetos convencionais do Microdrive permitem frequentemente somente o uso de um tipo de elétrodo para gravar das únicas ou das regiões múltiplas, limitando o rendimento de únicas-unidade ou de gravações do perfil da profundidade. Ele também geralmente limita a capacidade de combinar as gravações de eletrodos com ferramentas optogenéticas para direcionar a atividade de caminho e/ou tipo de célula específica. Aqui apresentamos um array híbrido de Microdrive para ratos que se deslocam livremente para otimizar o rendimento e uma descrição de sua fabricação e reutilização da matriz de Microdrive. O projeto atual emprega nove tetrodes e uma ponta de prova do opto-silicone implantada em duas áreas diferentes do cérebro simultaneamente em ratos livremente moventes. O tetrodes e a sonda opto-silício são independentemente ajustáveis ao longo do eixo dorsoventral no cérebro para maximizar o rendimento das atividades unitárias e oscilatórias. Esta matriz de Microdrive também incorpora uma set-up de luz, mediando a manipulação optogenética para investigar as respostas específicas do tipo regional ou celular e funções de circuitos neurais de longo alcance. Além, a ponta de prova do opto-silicone pode com segurança ser recuperada e reúso após cada experimentação. Como a matriz de Microdrive consiste em peças impressas em 3D, o design de microdrives pode ser facilmente modificado para acomodar várias configurações. Descrito pela primeira vez é o projeto da matriz de Microdrive e como anexar a fibra óptica a uma sonda de silício para experimentos de optogenética, seguido pela fabricação do pacote tetrode e implantação da matriz em um cérebro do mouse. A gravação de potencialidades locais do campo e da unidade que spiking combinou com a estimulação optogenética igualmente demonstra a viabilidade do sistema da disposição do Microdrive em ratos livremente moventes.

Introdução

É crucial compreender como a atividade neuronal apoia o processo cognitivo, tal como a aprendizagem e a memória, investigando como as regiões cerebrais diferentes interagem dinamicamente uns com os outros. Para elucidar a dinâmica da atividade neural subjacente às tarefas cognitivas, a eletrofisiologia extracelular em grande escala tem sido conduzida em animais que se deslocam livremente com o auxílio de matrizes de Microdrive1,2,3, a 4. Nas últimas duas décadas, vários tipos de Microdrive array foram desenvolvidos para implantar eletrodos em múltiplas regiões cerebrais para ratos5,6,7,8 e camundongos9, 10 de , 11 anos de , 12. no entanto, os projetos atuais do Microdrive geralmente não permitem o uso de tipos múltiplos da ponta de prova, forçando investigadores a escolher um único tipo do elétrodo com benefícios e limitações específicos. Por exemplo, as matrizes tetrode funcionam bem para regiões cerebrais densamente povoadas, como o hipocampo dorsal CA11,13, enquanto sondas de silício dão um melhor perfil geométrico para estudar conexões anatômicas14 , quinze anos.

Tetrodes e sondas de silício são freqüentemente usados para gravação in vivo crônica, e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Tetrodes provaram ter vantagens significativas na melhor isolação da única unidade do que os únicos elétrodos16,17, além do que a eficácia de custo e a rigidez mecânica. Eles também fornecem rendimentos mais elevados de atividades de unidade única quando combinados com microdrives8,18,19,20. É essencial aumentar o número de neurônios simultaneamente gravados para compreender a função dos circuitos neurais21. Por exemplo, um grande número de células é necessário para investigar pequenas populações de tipos de células funcionalmente heterogêneas, como22 ou recompensa relacionadas ao tempo23 células. Os números de pilha muito mais elevados são exigidos para melhorar a qualidade da decodificação de seqüências do ponto13,24,25.

Tetrodes, no entanto, tem uma desvantagem na gravação de células distribuídas espacialmente, como no córtex ou no tálamo. Em contraste com tetrodes, sondas de silício podem fornecer distribuição espacial e interação de potenciais de campo local (lfps) e atividades de spiking dentro de uma estrutura local14,15. As sondas de silício com várias hastes aumentam ainda mais o número de locais de gravação e permitem a gravação em estruturas únicas ou vizinhas27. Entretanto, tais matrizes são menos flexíveis no posicionamento de locais do elétrodo comparados a tetrodes. Além disso, os algoritmos de classificação de Spike complexos são necessários em sondas de alta densidade para extrair informações sobre potenciais de ação de canais vizinhos para espelhar os dados adquiridos por tetrodes28,29,30. Daqui, o rendimento total de únicas unidades é frequentemente menos do que tetrodes. Além disso, as sondas de silício são desvantajosas devido à sua fragilidade e alto custo. Assim, a escolha de tetrodes vs. sondas de silício depende do objetivo da gravação, que é uma questão de saber se a obtenção de um alto rendimento de unidades únicas ou perfil espacial nos locais de gravação é priorizada.

Além de registrar a atividade neural, a manipulação optogenética tornou-se uma das ferramentas mais poderosas na neurociência para examinar como tipos específicos de células e/ou caminhos contribuem para as funções do circuito neural13,31, 32,33. Entretanto, as experiências optogenética exigem a consideração adicional no projeto da disposição do Microdrive para unir o conector da fibra às fontes luminosas da estimulação34,35,36. Muitas vezes, a conexão de fibra óptica requer uma força relativamente grande, o que pode levar a uma mudança mecânica da sonda no cérebro. Portanto, não é uma tarefa trivial para combinar uma fibra óptica implantável para matrizes de Microdrive convencionais.

Pelas razões acima, os pesquisadores são obrigados a otimizar a seleção do tipo de eletrodo ou para implantar uma fibra óptica, dependendo do objetivo da gravação. Por exemplo tetrodes são usados para alcançar maior rendimento unitário no hipocampo1,13, enquanto sondas de silício são usadas para investigar o perfil de profundidade laminar de áreas corticais, como o córtex entorrinal medial (MEC)37. Atualmente, microdrives para implantação simultânea de tetrodes e sondas de silício haviam sido relatados para os ratos5,11. No entanto, é extremamente desafiador para implantar múltiplas sondas de tetrodes e silício em camundongos por causa do peso dos Microdrives, espaço limitado na cabeça do mouse e requisitos espaciais para projetar o Microdrive para empregar diferentes sondas. Embora seja possível implantar sondas de silício sem um Microdrive, este procedimento não permite o ajuste da sonda e diminui a taxa de sucesso da recuperação da sonda de silício12,38. Além disso, experimentos optogenéticos exigem considerações adicionais no design de matriz de Microdrive. Este protocolo demonstra como construir e implantar uma disposição do Microdrive para a gravação crônica em ratos livremente moventes, que permite a implantação de nove tetrodes independente ajustável e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone. Esta matriz de Microdrive também facilita experimentos optogenéticos e recuperação da sonda de silício.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) do centro médico do sudoeste da Universidade do Texas.

1. preparações de peças de matriz de Microdrive

  1. Imprima as peças da matriz de Microdrive usando uma impressora 3D usando resina modelo dental (Figura 1a, B). Assegure-se de que a espessura de camadas impressas 3D individuais seja inferior a 50 μm para manter os pequenos furos nas peças impressas claras e viáveis.
    Nota: a matriz de Microdrive consiste em cinco partes (Figura 1C): (1) o corpo principal da matriz de Microdrive, que inclui nove Microdrive-parafusos para tetrodes e um parafuso para uma sonda de silício (Figura 1CA-d). A coordenação do feixe e do furo tetrode para a ponta de prova do opto-silicone na parte inferior depende das coordenadas da área do cérebro do alvo (Figura 1Cd); (2) um vaivém para fixar uma sonda de silício ou um optrode (Figura 1Ce); (3) um conector elétrico da ponta de prova monta para prender o conector da ponta de prova do silicone (Figura 1CF); (4) um suporte da virola da fibra que grampos à parte center do corpo para impedir movimentos indesejados da ponta de prova implantada do opto-silicone ao obstruir/desconectar um conector da fibra óptica (Figura 1Cg); e (5) um cone de blindagem que fornece blindagem física e elétrica para a matriz de Microdrive para gravação estável (Figura 1Ch). O peso total da matriz de Microdrive é 5,9 g, incluindo o cone de blindagem (tabela 1). Se os furos são obstruídos nas peças impressas, perfurar para fora os furos usando bocados de broca: #76 para os furos internos e #68 para os furos exteriores para parafusos do tetrode-Microdrive, #71 para o furo do suporte do Microdrive-parafuso do tetrode, e #77 para os furos para os bornes da guia na parte inferior de o corpo.
  2. Inserção de postes de guia no corpo da matriz de Microdrive.
    1. Corte 2 16 mm de comprimento de 26-GA fio de aço inoxidável. Afie delicadamente as pontas do fio usando um moedor giratório.
    2. Insira os fios nos orifícios inferiores do corpo (Figura 2a). Aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato na parte inferior do corpo para fixar os postes de guia.

2. preparação da sonda de Opto-silício

  1. Prepare o parafuso de Microdrive para uma sonda de silício.
    Nota: o parafuso de Microdrive para a sonda de silício consiste em um parafuso personalizado (Pitch de 300 μm), suportando um tubo de suporte e um tubo em forma de L (Figura 2b).
    1. Prepare o molde para a cabeça do Microdrive (Figura 2C). Para construir o molde, prepare o padrão de plástico impresso em 3D do Microdrive (Figura 2Ca). Em seguida, despeje gel de silicone líquido depois de fazer uma parede temporal, colocando fitas em torno do padrão. Retire as bolhas de ar agitando suavemente, aguarde até que seja curada, em seguida, retire o molde de silicone-gel do padrão (Figura 2Cb).
    2. Corte 18 mm e 9,5 mm de comprimento de 23 G de fio inoxidável usando um moedor rotativo. Roughen os 2-3 milímetros superiores dos fios com um moedor giratório para realçar a adesão do acrílico dental.
    3. Tome um parafuso feito encomenda e aplique a pequena quantidade de óleo de silicone para reduzir a fricção com o acrílico dental. Definir os fios e um costume-parafuso para o molde.
    4. Derrame o acrílico dental no molde usando uma seringa para eliminar bolhas de ar em torno dos fios e dos parafusos. A contaminação da bolha de ar fará o Microdrive frágil. Espere até que o acrílico dental esteja curado inteiramente, a seguir Tire os parafusos do Microdrive do molde. Dobre 6 mm da ponta do fio mais longo para um ângulo de 60 ° usando alicates.
    5. Verifique a qualidade dos parafusos de Microdrive (por exemplo, rachaduras, bolhas de ar e atrito) para girar o parafuso. Se houver fricção elevada, gire o parafuso até que se tornem lisos usando um excitador de parafuso elétrico com uma ponta personalizada do excitador, que acopla com o parafuso do Microdrive.
    6. Instale o parafuso de Microdrive no corpo da matriz do Microdrive para verificar se ele se move para cima e para baixo suavemente girando o parafuso. As roscas para o parafuso são automaticamente criadas ao inserir o parafuso no orifício do corpo.
  2. Prepare o vaivém (Figura 3Aa).
    1. Corte dois comprimentos de 5 milímetros da tubulação do polyetheretherketone (auge) usando tesouras afiadas. Alinhe os tubos em ambos os lados do vaivém. Cole os tubos e transporte usando epóxi.
    2. Aplique uma pequena quantidade de óleo de silício nos postes de guia. Verifique a qualidade do transporte inserindo nas postagens do guia do corpo da matriz de Microdrive. Certifique-se de que o vaivém se move suavemente sem atrito excessivo.
  3. Prepare um optorode (Figura 3Ab). Esta etapa pode ser ignorada se um experimento optogenético não for necessário.
    1. Cleave a fibra óptica de 21 mm de comprimento usando um cortador de rubi. Moer a ponta de fibra para fazer a ponta plana e brilhante.
    2. Coloc delicadamente a fibra ótica na parte dianteira da silício-ponta de prova. A ponta da fibra é posicionada 200-300 μm acima da parte superior dos locais do elétrodo. Segure a fibra temporariamente com fita transparente.
    3. Cole a fibra óptica na base da sonda de silício usando uma pequena quantidade de epóxi. Aguarde pelo menos 5 h até que o epóxi está totalmente curado.
      Nota: recomenda-se anexar a fibra óptica do mesmo lado que os locais dos eléctrodos. Prender a fibra na parte traseira pode impedir que a luz iluminando corretamente os locais da gravação.
  4. Prenda a canela à sonda de silício (Figura 3Ac): aplique uma pequena quantidade de epóxi na parte de trás da base da sonda de silício. Prenda a parte inferior do vaivém à base da sonda de silício e segure suavemente a posição durante 2 – 3 min para evitar a formação de uma lacuna entre a base de transporte e a sonda de silício durante a cura inicial da epoxi. Aguarde pelo menos 5 h até que o epóxi está completamente curado.
  5. Insira cuidadosamente os tubos de transporte nos postes de guia do corpo principal o microscópio (Figura 3B). Durante este procedimento, segure a ranhura do vaivém com pinças finas.
  6. Insira o parafuso Microdrive no orifício do parafuso rodando o parafuso. Envolva a sonda de silício e o Microdrive-Screw inserindo a ponta do fio em forma de L na ranhura da cabeça do vaivém (Figura 3C).
  7. Fixe o suporte do conector elétrico da sonda ao corpo da matriz de Microdrive (Figura 3D).
    1. Corte dois parafusos #0 para 3,5 mm de comprimento da rosca. Moer as pontas para remover rebarbas.
    2. Coloque o suporte do conector da sonda no corpo. Coloque o conector elétrico da sonda de silício no suporte.
    3. Fixe o conector da sonda de silício no suporte usando epóxi e certifique-se de não colá-lo no corpo da matriz de Microdrive para permitir o procedimento de recuperação da sonda de silício. Insira os parafusos para segurar o suporte do conector da sonda.
  8. Fixe o suporte de virola à sonda opto-Silicon e ao corpo da matriz de Microdrive (Figura 3D).
    1. Corte dois parafusos #0 a 6 mm de comprimento da rosca. Moer as pontas para remover rebarbas.
    2. Moer o exterior de duas porcas #0 parafuso da máquina para fazer pequenas porcas sextavadas com 2,5 – 3,0 mm de diâmetro exterior para reduzir o peso e o espaço.
    3. Insira os parafusos no componente A do suporte. Cole as cabeças do parafuso usando epóxi.
    4. Aplique uma pequena quantidade de graxa de silício ao componente a e B para reduzir o atrito com o corpo. Insira o componente A no corpo e, em seguida, segure temporalmente usando pinças inversas.
    5. Coloque o componente B no parafuso do componente A. Rosqueie as porcas personalizadas nos parafusos. Use alicates para apertar as porcas para fixar o suporte do virola no corpo.
    6. Insira a ponteira de fibra na ranhura do porta-virola de fibra (componente B). Assegure-se de que a virola de fibra esteja furando 4 – 5 milímetros fora do suporte.
    7. Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre a virola e o sulco do suporte. Aguarde até que o epóxi esteja totalmente curado e verifique se a ponteira não se move. Verifique a canela e o suporte do virola para o movimento liso afrouxando as porcas antes de girar o Microdrive-Screw.
    8. Verifique a distância de trabalho da sonda. Certifique-se de que a ponta da sonda se retraí completamente no corpo quando o suporte de virola está na posição superior, enquanto os tubos de transporte ainda estão associados com os postes de guia. A distância máxima de trabalho é determinada pelo comprimento da sonda de silicone e a região do cérebro alvo.
    9. Se o Microdrive-Screw é frouxo, aplique a pequena quantidade de acrílico dental em torno do parafuso para adicionar mais linhas para a sustentação. Quando é curado, gire o parafuso para verific a tensão e a estabilidade.

3. tetrode preparação

Nota: este procedimento é semelhante ao publicado anteriormente artigos8,19,20,39.

  1. Prepare os parafusos de Microdrive para o tetrode. O Microdrive para um tetrode consiste em um parafuso feito-à-medida e em uma tubulação de 23 G (Figura 2b). Este procedimento é semelhante à secção 2,1.
  2. Faça um pacote de 30 tubos de aço inoxidável G que tem um fio de 5,5 mil dentro. Neste caso, utilizou-se um total de 9 30 G de tubos (oito tetrodes de gravação e um eletrodo de referência).
  3. Passe o pacote de 30 G da parte inferior do corpo da unidade e fixe-os com tubos de parede fina de 20 G para o corpo principal. Aparar a parte inferior do pacote com um moedor rotativo para fazer a ponta mesmo e flush. Aparar a parte superior dos tubos de 30 G com um moedor rotativo para que o tubo de 30 G se sobressaia cerca de 0,5 mm do corpo principal.
  4. Carregue 5,5 mil tubos de isolamento do polyimide na tubulação de 30 G. Prepare os fios tetrode e carregue-os em uma placa de interface elétrica (BEI) de 32 canais. Verifique a conexão elétrica com o testador de impedância antes do corte de precisão final.
  5. Abaixe a impedância da ponta do elétrodo a 250-350 kΩ com solução do chapeamento de ouro. Conserte todos os tetrodes com supercola.
  6. Encha a abertura excessiva entre o tubo do polyimide e o tetrode com óleo mineral para a selagem e a lubrificação. Encaminhar o fio terrestre para o BEI.
    Nota: se necessário, a fibra óptica pode ser integrada ao longo de fios tetrode12.

4. fixar o cone de blindagem

  1. Pinte a pintura de blindagem condutora de prata no interior do cone impresso. Coloque a matriz de Microdrive dentro do cone (Figura 3E).
  2. Corte dois parafusos #0 para 3,5 mm de comprimento da rosca. Aperte os parafusos do lado de fora do cone para segurar a matriz de Microdrive no lugar.
  3. Aplique tinta prateada ao redor da cabeça do parafuso para conectar eletricamente o cone de blindagem com aterramento elétrico. Verifique a conectividade elétrica entre o fio terra e o cone. Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre o corpo da matriz de Microdrive e o cone de blindagem para prender firmemente o corpo.
    Nota: outra maneira de preparar o cone de blindagem é usar fita de alumínio40 (Figura 3F). Primeiro, prepare o papel padrão para o cone de blindagem depois de furar a folha de alumínio ao papel (Figura 3Fa). Em seguida, role o papel e prenda-o ao corpo do Microdrive usando uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato (Figura 3Fb). O peso deste cone é de 0,72 g e o peso total da matriz de Microdrive é reduzido para 4,7 g (tabela 1).

5. cirurgia de implante

Nota: este procedimento é modificado a partir de artigos publicados anteriormente18,39,41 para implantação de dois sites. Assegure-se de que o peso do animal esteja sobre 25 g para o implante do Microdrive para uma recuperação mais rápida após a cirurgia.

  1. Preparação
    1. Para preparar um parafuso à terra, prenda o fio de prata a um parafuso do crânio e aplique a pintura de prata. Em seguida, anexar um pino de ouro para o lado oposto do fio usando tinta prateada.
    2. Prepare o adaptador de retenção de unidade para manter a matriz de Microdrive em um dispositivo estereotáxico. Prenda um conector masculino a um punho inoxidável usando a cola Epoxy. Certifique-se de que o alinhamento do cabo conector e inoxidável é reto.
    3. No caso em que a confirmação histológica é necessária após a gravação, aplicar di-I para o tetrodes ou parte traseira da sonda de silício38.
    4. Abaixe a sonda de silício para baixo para ser a profundidade desejada. Afrouxe as porcas do suporte da ponteira usando alicates, abaixe a sonda de silício (sonda opto-Silicon) girando o Microdrive-Screw da sonda de silício e aperte as porcas para fixar o suporte de virola. Ao implantar tetrodes na área hipocampal CA1 e uma sonda de silício no MEC, a distância entre a cânula tetrode e a ponta da sonda de silício é de 3 – 4 mm.
  2. Defina o rato anestesiado (0,8% – 1,5% de isoflurano) num dispositivo estereotaxico. A condição anestésica do rato é confirmada pela ausência do reflexo do dedo do pé-pitada. Aplique pomada clara aos olhos para evitar a secagem. Cubra os olhos com um pedaço de folha para proteger da exposição à luz cirúrgica forte.
  3. Desinfete o couro cabeludo do rato com iodo e isopropanol depois de raspar a pele. Faça uma incisão de 1,5 – 2,0 cm no couro cabeludo usando tesouras cirúrgicas padrão e remova o tecido sobre o crânio usando cotonetes de algodão após a aplicação subcutânea de lidocaína.
  4. Alinhe a cabeça do mouse com a ferramenta estereotótaxica. Assegure-se de que a diferença de altura entre Bregma e lambda seja inferior a 100 μm. Determine o local da craniotomia usando um Atlas e marque esses locais com um lápis esterilizado.
  5. Escorra os parafusos do crânio (diâmetro de 0,8 milímetros, passo da linha de 0,200 milímetros) girando os 1,5 voltas (0,3 milímetros) no crânio, usando pinças cirúrgicos e uma chave de fenda após a perfuração 8 – 11 furos no crânio usando a broca de 0,5 milímetros.
    Nota: 2 – 4 furos no crânio frontal, 2 – 3 furos em cada lado do crânio parietal, e 1 – 2 furos no crânio interparietal são sugeridos.
  6. Fixe o parafuso de aterramento ao orifício girando-o uma vez (0,2 mm) Após perfurar um orifício no osso interparietal. Assegure-se de que este furo não penetre através do osso no caso do cérebro; caso contrário, os sinais Cerebelares irão contaminar a gravação. Verifique se a impedância é inferior a 20 kΩ a 1 kHz entre o parafuso de aterramento e os parafusos do crânio usando um medidor de impedância.
    Nota: a impedância maior causará a introdução de artefatos de movimento durante a gravação.
  7. Realize a craniotomia nos locais marcados. A dura pode ser deixada intacta em camundongos.
  8. Conecte o pino macho do parafuso de aterramento e o conector de aterramento da matriz de Microdrive. Verifique a conectividade usando o medidor de impedância medindo entre o parafuso de aterramento e a blindagem.
  9. Defina a matriz de Microdrive para o adaptador, defina-o para o dispositivo estereotódico e abaixe lentamente a sonda de silício até a profundidade desejada. Assegure-se de que os feixes tetrode estejam coloc acima da superfície do cérebro mas ainda dentro da disposição do Microdrive quando a ponta de prova do silicone é introduzida no cérebro (figura 4a).
  10. Aplique cuidadosamente a graxa de silício para selar a área da sonda de silício e o feixe tetrode (Figura 4B). Coloque uma pequena quantidade de graxa de silício na ponta de uma agulha de 20 G e aplique a graxa em torno das sondas usando a agulha. Repita até que a graxa do silicone cubra completamente a área em torno da ponta de prova de modo que o acrílico dental não flua sobre ou debaixo dos elétrodos/pontas de prova. Tenha cuidado para não deixar a graxa tocar os locais do eletrodo, caso contrário, aumentará drasticamente a impedância dos locais de gravação.
  11. Aplique o acrílico dental para fixar a disposição do Microdrive aos parafusos de ancoragem no crânio.
    Nota: recomenda-se aplicar o acrílico dental em três camadas para evitar o calor excessivo produzido durante a cura do acrílico.
  12. Remova o adaptador da matriz de Microdrive com cuidado. Injete 1 mL de PBS subcutaneamente para evitar a desidratação. Injete 5 mg/kg de Meloxicam por via subcutânea como tratamento analgésico.
  13. Cubra o conector do silicone-Probe por uma parte de fita para impedir que toda a sujeira começ dentro das conexões elétricas. Cubra a matriz de Microdrive usando um filme plástico de parafina e tape-o no lugar.
  14. Administrar o tratamento analgésico adequado durante 3 dias (por exemplo, injeções subcutâneas de 2 mg/kg de Meloxicam uma vez por dia). Permita 3 – 5 dias para a recuperação antes de começar o ajuste tetrode. O mouse implantado após o período de recuperação é mostrado na Figura 4C.

6. recuperando a sonda de silício (figura 4D)

  1. Injetar cetamina (75 mg/kg) e dexmedetomidina (1 mg/kg) anestésicos via intraperitoneal e confirmou a ausência do reflexo do dedo do pé-pitada. Fixar o rato anestesiado por perfusing diretamente 4% paraformaldeído através do coração usando uma capa. Os métodos cirúrgicos para roedores são descritos previamente42.
  2. Afrouxe as porcas do suporte do virola usando um alicate. Em seguida, mova-o cuidadosamente para o topo do corpo girando o parafuso de ajuste para retrair totalmente a sonda de silício para dentro do corpo da matriz de Microdrive. Aperte as porcas para segurar a sonda na posição superior.
  3. Tire o cérebro do mouse para fora do fundo, quebrando o crânio do lado. A matriz de Microdrive está agora separada do animal.
  4. Remova completamente o Microdrive-Screw em forma de L que impulsiona a sonda de silício. Afrouxe e tire as porcas do suporte de virola usando alicates. Tire o componente a do suporte de virola.
  5. Desaparafuse a montagem do conector da sonda e retire-a do corpo da unidade. Verifique se a montagem do conector da sonda pode sair do corpo da matriz de Microdrive.
  6. Segure a parte superior do vaivém com pinças e, em seguida, deslize cuidadosamente o conjunto de sonda de silício para fora da matriz de Microdrive.
  7. Limpe a ponta da sonda com o limpador de lentes de contato (primeiro com enzima, depois 3% de peróxido de hidrogênio) por pelo menos 1 dia. Limpe com cuidado a ponta do elétrodo usando as almofadas do isopropanol o microscópio. Mantenha a sonda em uma caixa de armazenamento livre de estática.
    Nota: a montagem do conector de transporte e sonda permanece presa à sonda de silício e pode ser reutilizada na próxima implantação.
    Nota: algumas sondas de silício não são toleráveis com peróxido de hidrogênio. Neste caso, use a solução da lente de contato que contem a enzima proteolíticas somente.
  8. Para reutilizar o corpo da matriz de Microdrive para a próxima cirurgia, retire o acrílico dental usando uma combinação de brocas de ponta fina e pinças. Em seguida, recupere os parafusos do crânio, imersando o acrílico dental removido em acetona. Observe que a acetona dissolverá partes plásticas da matriz de Microdrive.
  9. Remova o epóxi entre o corpo do Microdrive e o cone de blindagem usando um bisturi.
    Nota: nenhuma peça adicional precisa de ser imprimida outra vez para a cirurgia seguinte se o Microdrive não é quebrado.

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Resultados

A matriz de Microdrive foi construída dentro de 5 dias. A linha do tempo da preparação do Microdrive é descrita na tabela 2. Usando este Microdrive, nove tetrodes e uma sonda de silício foram implantados no hipocampal CA1 e MEC do mouse [21 semanas de idade/29 g peso corporal masculino pOxr1-CRE (C57BL/6 fundo)], respectivamente. Este rato transgênicas expressa CRE em neurônios piramidal da camada III de MEC. O rato foi injetado com 200 nL de AAV5-DIO-ChR2-YFP (Titer: 7,7 x 1012 GC/ml) no MEC ...

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Discussão

O protocolo demonstra como construir e implantar uma matriz de Microdrive híbrida que permite a gravação de atividades neurais de duas áreas cerebrais usando tetrodes ajustável independente e uma sonda de silício em camundongos que se comportam livremente. Também demonstra experimentos optogenéticos e a recuperação da sonda de silício após experimentos. Quando a ponta de prova ajustável33 do silicone ou a sonda do opto-silicone36 a implantação for demonstrada previamente no...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pela sociedade do Japão para a promoção da ciência de bolsas de pesquisa no exterior (HO), programa de estudioso dotado (TK), programa de ciência da fronteira humana (TK), Brain Research Foundation (TK), faculdade de ciência e tecnologia de aquisição e Programa da retenção (TK), cérebro & Fundação da pesquisa do comportamento (TK), e pelo concessão da pesquisa da Fundação de Sumitomo (JY), concessão nova da pesquisa do investigador de NARSAD (JY). Agradecemos a W. Marks por comentários valiosos e sugestões durante a preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#00-90 parafusoJ.I. Morris#00-90-1/8Porca EIB
0-80 PeçaspequenasB00DGB7CT2porca de latão para segurar o suporte da ponteira de fibra
#0-80 ParafusodeB000FMZ57Glatão para montagem do conector da sonda, suporte da ponteira de fibra e cone de blindagem Tubos de
polieteretercetona de 22 GaPeças pequenasSLPT-22-24para anexar à lançadeira, 0,025 polegadas de diâmetro interno
23 Ga tubo inoxidávelpequenasHTX-23Rpara tetrodo
23 Ga fio inoxidávelpequenasHTX-23R-24-10para fio em forma de L / suporte
26 Ga fio inoxidávelpequenasGWX-0200para postes de guia
30 Ga fio inoxidávelpequenasHTX-30Rpara tetrodo
Pacote de software CAD 3-DDassault Systè mesSolidWorks 2003
impressora 3DFormLabForm2
tubos isolantes de poliimida 5.5milHPC Medical72113900001-012
fita de folha de alumínioTycoTyco Adhesives 617022 fita de folha de alumíniopara a pasta condutora de cone de blindagem alternativa
YSHIELDHSF54para cone
de blindagemparafusos personalizados para microdrive de sonda de silícioAMTUNM1.25-HalfMoonparafuso de aço inoxidável meia-lua, 1,5 mm de diâmetro, 300 µ m passo de rosca
personalizado para tetrode microdriveAMTYamamoto_0000-160_9mmparafuso de aço inoxidável ranhurado, 0,5 mm de diâmetro, 160 µ m passo de rosca, feito sob medida para o nosso design
acrílico dentalStoelting51459
resina modelo dentalFormLabRS-F2-DMBE-02
Ferramenta rotativa DremelDremelmodelo 800trituradora
Fine Science Tool19007-05
placa de interface elétricaNeuralynxEIB-36-Narrow
epóxiDevconGLU-735.905 minutos
pomada epóxi para os olhosPomada oftálmicaDechrapara evitar que os olhos dos ratos sequem durante a cirurgia
folha de polimento de fibraThorlabsLFG5Ppara polir a fibra óptica
pinças finasProtech International15-368para carregar/recuperar a sonda de silício
ouro pinosNeuralynxEIB Pinos Pequeno
fio terraA-M Systems7815000,010 polegada fio de prata nu
headstage pré-amplificadorNeuralynxHS-36
medidor de impedânciaBAK eletrônicaModelo IMP-21 kHz frequência de teste
óleo mineralZONA36-105para lubrificação de parafusos e fios
fibra ópticaDoricMFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Sistema de gravaçãoNeuralynxDigital Lynx 4SX
escriba de fibra de rubiThorlabsS90Rpara clivar a graxa de silicone de fibra óptica
Fine Science Tool29051-45
sonda de silícioNeuronexusA1x32-Edge-5mm-20-177Fig. 3, 4A, 4B, 5
sonda de siliconeNeuronexusA1x32-6mm-50-177Fig. 4C
solução de lavagem de sonda de siliconeAlconAL10078844
limpador de lentes de contato lubber de siliconeSmooth-OnDragon Skin 10 FASTpara preparação de tinta prateada de molde de microdrive
GC eletrônico22-023impressão prateada II revestimento, usado para fios terra
parafuso de caveiraOtto Frei2647-10AC0,8 mm de diâmetro, 0,200 mm de rosca
tesoura cirúrgica padrãoROBOZRS-5880
aparelho estereotáxicoKopfModelo 942
super colaLoctiteLOC230992para aplicação em postes de guia
pinças cirúrgicasROBOZRS-5135
Tetrode TwisterJun YamamotoTT-01
fios de tetrodoSandvikPX000004
# de Peças Peças Peças Peças uma broca Puralube

Referências

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